L'approche de la souris ronde-fenêtre pour ototoxiques Delivery Agent: Un rapide et fiable Technique d'incitation à Cochlear dégénérescence cellulaire

L'objectif général de cette procédure est d'établir un modèle de lésion de l'oreille interne en administrant de manière ciblée des agents ototoxiques directement dans la niche de la fenêtre ronde du limaçon de la souris. Cette étape est réalisée en premier lieu en disséquant la couche de tissu adipeux sous-cutané et en retirant délicatement le muscle afin de mettre à nu le périoste de la bulle tympanique. La deuxième étape consiste à ouvrir la bulle en retirant progressivement des fragments osseux jusqu'à l'exposition de la niche de la fenêtre ronde.

Ensuite, le liquide visible de l'oreille moyenne et de la niche de la fenêtre ronde est complètement séché afin de permettre une visualisation optimale de la niche de la fenêtre ronde. La dernière étape consiste à remplir la niche de la fenêtre ronde avec l'agent ototoxique sélectionné sans perturber l'artère pédiculée de la STA, suivie de répétitions appropriées selon les spécifications de l'agent. Enfin, des procédures fonctionnelles, notamment la réponse auditive du tronc cérébral, ainsi qu'une évaluation morphologique, sont utilisées pour démontrer la préservation sélective ou la dégénérescence de la microarchitecture cochléaire.

Le principal avantage de cette technique, par rapport à notre mesure existante, est que cette procédure permet une excellente exposition de la niche de la fenêtre ronde et du mémoire, de sorte que le vieillissement toxique sélectif puisse être directement appliqué. Les avantages de cette technique comprennent la préservation de l'oreille interne, de la microarchitecture, l'évitement de la toxicité systémique, un début rapide de l'effet, la dégénérescence sélective de certains types cellulaires cochléaires et des résultats reproductibles. Cette technique peut être appliquée avec peu de modifications entre d'autres espèces de rongeurs, notamment les rats, les cochons d'Inde et les gerbilles.

Je vais maintenant démontrer la procédure dans mon laboratoire. Tous les aspects de la recherche sur les animaux ont été menés conformément aux directives du comité institutionnel approprié pour les soins et l'utilisation des animaux. Toutes les procédures expérimentales sur les vertèbres décrites ici ont été approuvées selon les directives du comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation de l'Université de médecine de Caroline du Sud.

Après avoir anesthésié l'animal selon les procédures approuvées, administrer un analgésique préopératoire à raison de 0,1 milligramme par kilogramme. La buprénorphine est utilisée ici. Vérifier que l'animal a atteint un niveau chirurgical d'anesthésie.

Il ne devrait y avoir aucune réponse à une pincée des orteils, et le réflexe d'écriture doit être absent chez les souris, comme observé ici. Prélevez 0,2 millilitre d'une solution aqueuse contenant l'agent ototoxique sélectionné dans une seringue tuberculinique d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 28 émoussée de demi-pouce, et expulsez tout air présent dans la seringue, car les bulles peuvent empêcher une application adéquate de l'agent. Utilisez un tondeur électrique pour raser le pelage dans la zone s'étendant du sillon interauriculaire jusqu'au niveau du ceinturon scapulaire.

Étendre l'épilation de la ligne médiane sagittale dorsale jusqu'à l'angle mandibulaire latéralement. Utiliser un rasoir jetable afin d'assurer une préparation soigneusement rasée. Stériliser la peau de la zone préparée selon les protocoles établis par l'institution.

Ici, la Bétadine est alternée avec de l'éthanol et appliquée localement de manière circulaire pendant deux minutes. Placer un petit coussin chauffant sous le corps pour maintenir la température corporelle de l'animal. À une température de 36 à 38 degrés Celsius, fixer la tête de l'animal à l’aide d’un dispositif de maintien de la tête.

Serrer délicatement une petite pince sur le dos du museau de l'animal pour le maintenir en place. Vérifier que le support de tête est solidement fixé au centre d'un bras articulé en forme de U. Fixer une tige d'un centimètre de large sur le bras gauche du U afin de l'utiliser comme appui-tête gauche, permettant ainsi l'accès au côté droit.

Une fois solidement fixé dans le support de tête, placer la souris en position latérale gauche. Positionner soigneusement le corps sur la surface plane de l'aire opératoire afin d'assurer sa stabilité tout au long de la procédure et d'éviter toute contrainte torsionnelle excessive sur les vertèbres cervicales. Placer un microscope opératoire permettant un grossissement de 10 x et 20 x au-dessus du champ chirurgical.

Vérifiez que le microscope peut maintenir sa position sans intervention manuelle afin que les deux mains puissent être utilisées pour la chirurgie tout en travaillant sous grossissement microscopique. Utilisez des ciseaux pointus ou une lame de scalpel pour réaliser une incision rétro-auriculaire de un à 1,5 centimètre, située approximativement à six à huit millimètres en regard du sillon céphalique de l’oreille. Évitez de couper en profondeur afin de préserver les structures vasculaires sous-jacentes.

Disséquez en plan contondant à travers la couche de tissu adipeux sous-cutané. Si vous disséquez de l'avant vers le médial, veillez à éviter la veine jugulaire externe. En cas de saignement, utilisez de la gélatine absorbable, des éponges ou des pellets de coton pour arrêter l'écoulement.

Une fois la couche grasse correctement divisée, exposez la musculature cervicale. Un repère important est une petite branche nerveuse du nerf crânien 11 qui contourne le bord postérieur du masséter mastoïdien du C CTO. Pour étendre la région en direction du pavillon de l’oreille, utilisez un rétracteur auto-rétentif afin de rétracter doucement le corps musculaire du masséter mastoïdien du C CTO dans une direction postérieure.

Divisez délicatement l'aponévrose transparente entourant le corps musculaire. Rétractez également avec précaution la parotide et la veine jugulaire externe dans la direction opposée. Avec une bonne rétraction du corps musculaire du muscle CTO Masto, le dôme brillant du périoste de la bulle tympanique est visible au niveau de l'aspect inférieur de la bulle, correspondant à l'insertion d'un muscle cervical profond.

La mastoïdite sterno apparaîtra. Placez un rétracteur auto-rétentif pour écarter le mastoïde CTO à l'aide d'une technique à deux mains, puis utilisez délicatement une diathermie bipolaire pour diviser le périostéum bullaire et exposer l'os sous-jacent. Utilisez ensuite une pince ou un curet otochirurgical pour soulever doucement et repousser le périostéum vers la périphérie afin d'exposer complètement le dôme de la bulle.

Utilisez maintenant un micromoteur dentaire à entraînement par courroie, muni d'une pointe conique d'un ou deux millimètres, pour percer soigneusement un avant-trou de deux millimètres à travers l'os du bulla. Percez entre la marge coddle de la coupole et la ligne visiblement opaque s'étendant sur l'aspect rostral du bulla. Ensuite, percez soigneusement un deuxième avant-trou à proximité afin de faciliter le décapage de l'os du bulla. À l'aide d'une pince fine de bijoutier, ouvrez l'os du bulla dans une direction dorsale et coddle.

Veillez à ne pas percer l'artère EDL qui se trouve directement sous le capuchon bulloïde. Minimisez la quantité d'os retirée afin d'éviter une entrée excessive de liquide dans l'oreille moyenne avant l'application de l'agent. Utilisez une mèche en papier pour éliminer tout liquide visible dans l'oreille moyenne et la niche de la fenêtre ronde jusqu'à ce que l'os sec soit visible.

Cette étape est cruciale pour la réussite du protocole. En observant la zone à l'agrandissement maximal, utilisez une aiguille de petit calibre fixée à une seringue tuberculinique d'un millilitre pour appliquer une goutte d'agent ototoxique directement dans la niche de la fenêtre ronde, en la remplissant complètement. Laissez l'agent agir dans la niche de la fenêtre ronde pendant 10 minutes.

Au stade initial, surveillez attentivement le remplacement d'un petit reflet lumineux à la base de la niche sèche par un ménisque de liquide terne et trouble. Cela indique que la niche se remplit correctement. Une fois 10 minutes écoulées, absorbez complètement l'agent à l'aide d'un buvard et remplacez-le par une nouvelle application du même agent.

Le nombre d'appliquations dépend de l'agent utilisé. Le temps d'exposition varie généralement entre 30 et 60 minutes. Après la dernière application, laissez le dispositif non obturé et utilisez une pince pour rabattre le tissu mou au-dessus du site chirurgical.

Utilisez un fil non absorbable de 4-0 pour fermer la peau au-dessus du site chirurgical. Laissez l’animal se réveiller de l’anesthésie dans une cage domestique propre, équipée de litière et de nourriture molle. Surveillez les animaux quotidiennement jusqu’à l’euthanasie et la récolte du tissu cochléaire chez les adultes C-B-A-C-A-J.

Des souris des deux sexes ont été exposées à l'agent ototoxique Hept éthanol. La diffusion par la fenêtre ronde. Des augmentations significatives des seuils de réponse au bruit ont été observées chez les souris traitées au Hept du premier au quatorzième jour suivant l'intervention chirurgicale, par rapport aux animaux témoins ayant subi une chirurgie factice avec administration de sérum salin au lieu du Hept.

L'éthanol n'a pas démontré de décalage seuil significatif à aucune fréquence testée. Une immunomarquage dirigé contre un canal potassique rectificateur entrant, représenté en vert, a servi de méthode indirecte pour visualiser les lésions et la récupération des structures cochléaires. L'intensité de la coloration a été nettement réduite dans les theria vais.

Le premier jour suivant l'intervention chirurgicale, des signes de rupture de l'intégrité nucléaire et de condensation chromosomique, typiques de l'apoptose cellulaire, ont également été observés lors de la contre-coloration nucléaire montrée en rouge. Lorsque l'intensité de la coloration des canaux potassiques a été quantifiée dans les zones du stratum des oreilles traitées, un creux initial a été suivi d'un décalage significatif vers l'intensité du témoin sept jours après l'exposition au hept, avec un rétablissement se poursuivant par la suite. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en 30 à 60 minutes si elle est effectuée correctement.

Il est important de se rappeler qu'une exposition supplémentaire ou un réapprovisionnement peuvent aider à éviter la dilution indésirable de l'agent auto-toxique par la condensation sanguine ou le liquide interstitiel. Toutefois, il convient de faire preuve de prudence avec cette approche, car elle tend à augmenter le risque de lésion involontaire de l'artère cédale ou d'introduction de liquide interstitiel dans la niche de la fenêtre ronde. Cette technique peu invasive permet une étude détaillée de processus biochimiques délicats et a joué un rôle essentiel dans la poursuite de nos recherches visant à comprendre le potentiel régénératif cochléaire in vivo.