Mesure de TCR-pMHC Reliure

Dans cette vidéo, nous allons montrer comment mesurer la cinétique entre le récepteur de l'antigène des lymphocytes T et le complexe majeur d'histocompatibilité chargé en peptide, ou PMHC, dans C deux, situé au sein de la synapse immunologique entre un lymphocyte T et un bicouche lipidique planaire supportée. Nous vous guiderons brièvement à travers les aspects importants de la production de protéines et la vérification de l'intégrité fonctionnelle de la bicouche lipidique par des mesures de flux calcique. Pour des informations plus détaillées sur la préparation de la bicouche lipidique et la mise en place d'un microscope à fluorescence monoculaire, veuillez consulter notre contribution parallèle dans le Journal of Visualized Experiments. Nous expliquerons ensuite en détail comment réaliser et analyser des mesures de transfert d'énergie par résonance de Förster, en masse et au niveau monoculaire.

Pour déduire la cinétique de la liaison du récepteur des cellules T synaptique au PMHC afin d'expliquer notre stratégie basée sur la FRET utilisée dans notre approche globale, nous partons de la structure cristalline du récepteur des cellules T, ou TCR, représenté ici en bleu, tel qu'il se lie à son antigène, la molécule CMH chargée d'un peptide, ou PMHC, illustrée en jaune et rouge. Nous introduisons également un fragment monochaine des domaines variables d'un anticorps réactif au bêta du récepteur des cellules T appelé age 57. Pour des mesures quantitatives basées sur la FRET, il est impératif de marquer de manière spécifique les deux partenaires : le donneur FRET, dans notre cas le fragment monochaine, et l'accepteur FRET, le PMHC.

Cela est réalisable pour les protéines recombinantes grâce à l'introduction d'une cystéine non appariée, qui peut ensuite être liée de manière covalente à un fluorophore conjugué à une mite. Comme illustré, nous fixons le donneur Alexa Fluor 555 ou Side Three au fragment monochaine et à l'accepteur FRET, ainsi qu'Alexa Fluor 647 ou SI Five au terminus C du peptide lié à la molécule du CMH.

La distance Indy, telle qu'indiquée dans cette structure composite, est d'environ 41 angströms, soit même inférieure au premier rayon, qui correspond à la distance de transfert d'énergie maximale à moitié entre les deux colorants. Dans nos expériences, nous utilisons des bicouches lipidiques soutenues sur verre plan comme cellules présentatrices d'antigènes simulées. Celles-ci sont fonctionnalisées avec PMXC, la molécule co-stimulatrice B sept un et la molécule d'adhésion I chim un.

Ainsi, l'imagerie peut être réalisée en mode de fluorescence par réflexion totale interne, qui illumine les fluorophores situés à proximité immédiate de l'interface, réduisant ainsi considérablement le fond cellulaire. Le transfert d'énergie par résonance (FRET) n'est détectable que lorsque les récepteurs T spécifiques marqués sous forme de fragments uniques s'associent aux PM HCS intégrées dans la couche. Cela nous permet de visualiser la liaison T-C-R-P-M-H-C, puis de calculer la cinétique de liaison dans un complexe majeur d'histocompatibilité correctement replié.

Les parties extracellulaires de P seven one et d’I chem one sont purifiées à partir des surnageants de cultures de cellules d'insectes infectées par le virus BUC correspondant. La purification est réalisée en trois étapes, commençant par une chromatographie d'affinité au nickel anti aros, suivie d'une chromatographie par échange d'ions et d'une chromatographie d'exclusion stérique. Les hétérodimères de la classe II du CMH portant une étiquette histidine sont exprimés dans E. coli sous forme de corps d'inclusion et renaturés in vitro à quatre degrés Celsius en présence d'un peptide espaceur, par dilution rapide dans un tampon redox.

Le peptide espaceur sera ultérieurement clivé par exposition à la lumière UV. Les complexes PMHC correctement repliés sont ensuite purifiés et concentrés en présence de l'espaceur. Le peptide est clivé et remplacé à pH 5,2 par le peptide fluorescent.

Le produit final est purifié par taille. Le fragment monochaine est exprimé avec une cystéine non appariée sous forme de corps d'inclusion dans E. coli, puis replié in vitro par dialyse progressive et purifié par taille. Il est ensuite marqué via sa cystéine non appariée avec un colorant conjugué à une maléimide et purifié à nouveau par taille.

Toutes les protéines recombinantes sont finalement dialysées contre du PBS contenant 50 % de glycérol, concentrées à un milligramme de protéine par millilitre, puis stockées à long terme à moins 20 degrés Celsius. Utilisez le colorant rapporteur URA deux pour mesurer les concentrations intracellulaires de calcium dans les lymphocytes T afin de vérifier la puissance stimulante du lipide blay. Chargez les lymphocytes T activés avec l'ester URA 2:00 AM.

Ce composé pénètre dans les cellules par son groupement AM, mais il est ensuite piégé à l'intérieur par l'action des estérases, qui clivent la partie AM. Ajoutez Fura 2-AM à environ 3 millions de lymphocytes T à une concentration finale de cinq micromoles par litre. Transférez les cellules de la plaque 24 puits vers un nouveau tube et incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes.

Lavez les cellules une fois dans du tampon d'imagerie contenant une solution saline tamponnée au Hank incluant du calcium et du magnésium ainsi que 1 % d'albumine. Pour surveiller le calcium intracellulaire, utilisez un système automatisé de microscope inversé doté de capacités UV. Démarrez le protocole de chronométrage et ajoutez moins de deux lymphocytes T chargés sur la bicouche lipidique fonctionnalisée placée au foyer sur la platine du microscope, puis acquérez à des intervalles de temps réguliers une image de contraste interférentiel différentiel (DIC) et deux images fluorescentes excitées respectivement avec une lumière UV de 340 et 380 nanomètres.

Immédiatement après le contact avec la bicouche, les lymphocytes T adoptent des niveaux élevés de calcium, mesurés par le rapport URA deux 15 minutes après le début de l'expérience. Ajoutez un anticorps bloquant aux cellules, saturant tous les antigènes PMHC. En conséquence, les concentrations intracellulaires de calcium chutent jusqu'aux niveaux observés dans l'état non activé, qui serviront ultérieurement de référence.

Dès que les niveaux de l'anticorps bloquant présents diminuent jusqu'à une valeur reflétant l'état non activé, que nous normalisons à un pour les mesures de FRET, les lymphocytes T doivent être marqués avec une sonde de fragment monovalent réactive du TCR pour chaque expérience, transférer environ 1 million de cellules dans un tube et les centrifuger à 400 ×g. Éliminer le milieu et évacuer les gouttelettes résiduelles de milieu en essuyant les parois internes avec un papier absorbant. Cela garantit un volume d'incubation minimal d'environ 30 microlitres, comme je l'ai mentionné précédemment.

La sonde FRET est conservée à une concentration d'un milligramme par millilitre et à 50 % de glycérol à moins 20 degrés Celsius. Elle est marquée de manière spécifique sur un site avec soit Alexa, soit Fluor de 5, 5 5, également trois, à un rapport protéine/anticorps de un à 0,3 microlitre de la sonde par rapport aux cellules. Agiter doucement le culot plusieurs fois et incuber les cellules pendant 20 minutes sur de la glace.

Lavez les cellules dans un tampon d'imagerie glacé. Répétez cette procédure de lavage une fois. L'incubation, la centrifugation et le stockage à basse température garantissent que les lymphocytes T n'internalisent pas la sonde fluorescente pendant leur exposition à celle-ci.

Cela entraînerait une fluorescence de fond élevée. De plus, les lymphocytes T ne perdent pas la sonde au froid pendant le lavage et le stockage avant de placer la bicouche contenant la chambre sur l'échangeur de plateau du microscope. Remplacer successivement le PBS par le tampon d'imagerie en évitant à tout prix l'exposition de la bicouche à l'air, car cela la détruirait.

Pour réduire le bruit de fond cellulaire, nous utilisons l'illumination en champ évanescent. Pour cela, nous positionnons le faisceau d'excitation à un angle critique auquel se produit une réflexion totale interne. Éteignez l'excitation, allumez la lumière large et ajoutez le lymphocyte T à la chambre ltec, puis laissez-les se déposer sur la bicouche lipidique.

Activez l'excitation et focalisez une illumination sans champ proche. La membrane cellulaire est observée sous forme d'un anneau le long de l'axe optique dans chaque plan focal ; dans le champ proche, seule la membrane basale en contact avec la bicouche est observable. Les plans focaux supérieurs ne sont plus excités et par conséquent non visibles.

Le protocole de temporisation commence par les impulsions d'excitation rouge et verte pour l'imagerie du PMHC et du TCR, suivies d'une impulsion de blanchiment rouge afin d'ablationner l'accepteur P-M-H-C-F. Une impulsion verte permet d'imaginer le TCR après le blanchiment de l'accepteur F fat, et une impulsion rouge vérifie l'ablation de l'accepteur F ; ces expériences sont réalisées à une échelle de temps inférieure à la seconde, avec le délai le plus court possible entre la première et la seconde impulsion verte. En option, une image CIDI peut être obtenue au départ ; la séparation d'image en deux couleurs permet la détection simultanée du donneur alimenté et du canal de l'accepteur alimenté.

L'excitation de l'accepteur en mode FRET montre l'accumulation de pMHC dans la synapse des cellules T. Cette image pré-photoblanchiment vérifie la présence de PMCS et indique déjà une liaison de pMHC médiée par le TCR. Excitation. Le donneur FRET donne lieu à des images dans les deux canaux.

Le signal du canal du donneur excité est en partie réduit en intensité en raison du transfert d'énergie vers le canal de l'accepteur F. Le signal du canal de l'accepteur FRET est composé du passage du signal du donneur excité et de l'excitation croisée de l'accepteur FRET. Quoi qu'il en soit, cette image ne sera pas utilisée pour l'analyse.

Dans le protocole actuel, un empilement de désaturation rapide suit et élimine toute la fluorescence acceptée du donneur F. L'intensité de l'image du donneur F après la désaturation acceptable par transfert d'énergie par résonance (FRET) est désormais récupérée à des niveaux plus élevés sans perte d'intensité dans le canal FRET.

Le critère suivant de l'accepteur de transfert d'énergie par résonance (FRET) confirme l'effacement complet de l'accepteur de graisse fluorescente. Zoomons sur la synapse afin de quantifier la récupération du donneur marqué. Déterminez l'intensité moyenne du fond, une valeur constante indépendamment de l'accepteur FRET.

Photoblanchiment, puis déterminer l'intensité moyenne du synapse et celle d'un cluster représentatif de TCR. Le rendement FRET est ensuite calculé en normalisant la différence avant et après l'ablation de l'accepteur. Dans notre exemple, nous mesurons un FRET de 16 % pour l'ensemble du synapse et de 26 % pour le cluster représentatif.

Les rendements de transfert d'énergie par résonance de type FRET des agrégats de TCR seront ultérieurement convertis en taux d'occupation des TCR, ce qui permet d'obtenir des données uniques à l'échelle moléculaire sur la constante de dissociation synaptique en deux dimensions. Celles-ci nous permettent de déduire la cinétique de la liaison synaptique entre le TCR et le peptide CMH dans des expériences de microscopie FRET à l'échelle moléculaire unique. Nous utilisons les mêmes réactifs et la même stratégie de marquage que précédemment.

Cependant, afin de garantir que nous observons effectivement l'interaction entre un seul TCR et un seul peptide CMH, nous choisissons de satisfaire au critère suivant. Un événement candidat pour une molécule unique de fre doit coïncider familièrement avec la molécule unique de fre accepteur ou de fre donneur. Ici, nous utilisons un seul PMHC comme molécule accepteur de fre afin de vérifier la nature monocellulaire de l'événement de fre observé, mais selon une logique inverse.

L'utilisation d'accepteurs alimentés dans des boutons supérieurs et de donneurs Fred dans des boutons inférieurs est certainement une option. Nous exposons généralement les lymphocytes T en contact avec une bicouche lipidique stimulante aux excitations de 514 et 647 nanomètres, en alternant de manière séquentielle et répétée les excitations du donneur et de l'accepteur, avec un délai minimal d'un milliseconde suivi d'un temps de latence. Ce dernier peut varier selon les besoins de l'expérience.

Pour obtenir un signal fluorescent suffisamment intense permettant la détection d’un unique composant en quelques millisecondes après l’excitation, nous devons appliquer des densités de puissance d’excitation élevées, comprises entre un et cinq kilowatts par centimètre carré. En raison du photoblanchiment, le nombre de molécules d’accepteur PMHC marquées par transfert d’énergie par résonance (FRET) visibles diminue rapidement jusqu’à un niveau où les signaux individuels des fluorophores accepteurs FRET deviennent discernables dans une bicouche contenant 30 composants PMHC marqués ou plus par micromètre carré. Un exemple est présenté ici pour un décalage temporel global de 42 millisecondes.

Un événement FRET unique, marqué par un cercle rouge, devient visible aux deuxième et troisième points temporels. Il co-localise avec une seule molécule S5 marquée par un cercle vert. Dans cet exemple, l'événement FRET observable présente une durée de trace de deux ; collectez davantage de traces FRET individuelles comme indiqué dans le tableau, soit 128 traces.

Ensuite, calculez la somme cumulée complémentaire des traces, comme indiqué par les nombres verts, puis normalisez-les comme illustré par les valeurs normalisées du graphique, et ajustez-les à l’aide d’une fonction exponentielle simple. La valeur attendue est légèrement supérieure à 1,5 intervalle de temps. Cette valeur dépend du peptide du TCR, de la liaison avec le CMH et du photoblanchiment ; afin de pouvoir distinguer entre ces deux contributions, la valeur attendue doit être calculée pour au moins trois durées différentes.

Les décalages temporels représentent désormais toutes les valeurs d'espérance en fonction de leurs décalages temporels respectifs et ajustent les points de données à la fonction indiquée, qui contient ici la durée de vie de 2,12 secondes et la valeur d'espérance pour l'EXTINCTION PHOTOCHIMIQUE f Fred. La récupération du donneur après un blanchiment photochimique acceptable de f Fred, comme illustré ici et décrite plus en détail précédemment, peut être utilisée pour déterminer en quelques étapes seulement les constantes de dissociation bidimensionnelles telles qu'elles sont effectives au sein de la synapse immunologique.

Ici, nous concentrons notre analyse sur l'engagement du TCR et les agrégats de TCR où la liaison T-C-R-P-M-H-C est la plus marquée. Comme cela devient évident à partir des mesures présentées, les rendements F FRED varient considérablement selon les agrégats individuels de TCR.

Multiplier F fred par le facteur de proportionnalité C conduit à la saturation du TCR, un terme décrivant le rapport entre le nombre de TCR liés au PMHC et leur nombre total. C doit être déterminé une fois pour un ensemble spécifique de paires fre et pour le système FRE utilisé. À la fin de cette présentation, nous expliquerons plus en détail comment déterminer C, par exemple à l’aide de SI trois et SI cinq placés spécifiquement sur le fragment d’anticorps monovalent réactif au TCR et sur l’extrémité C du peptide lié au CMH. Cela correspond à environ deux constantes de dissociation bidimensionnelles synaptiques, qui peuvent être calculées à partir de la saturation du TCR appelée A et de la densité initiale de pmcs présente sur le bicouche lipidique.

La relation affichée est dérivée de la loi d'action de masse et est expliquée plus en détail dans l'article accompagnant ce film. Dans notre exemple, la densité initiale des PMC s'élève à 30 molécules par micron carré. Nous obtenons une distribution de Kd en 2D, efficaces dans la synapse des lymphocytes T, avec une valeur médiane d'environ 34 molécules par micron carré.

La distribution de la vitesse d'association peut être calculée à partir de la distribution de KD 2D synaptique et de la vitesse de dissociation correspondante ici, 0,41 par seconde, déterminée par analyse de traces de FRET monocellulaires à 24 degrés Celsius. La valeur médiane est d'environ 0,01 micron carré par molécule par seconde. En résumé, les mesures de FRET entre le TCR et le peptide CMH permettent une analyse complète de tous les paramètres cinétiques décrivant la dynamique de réaction en C deux.

Cette méthodologie peut en principe être généralisée à l'analyse d'autres interactions récepteur-ligand, car elles pourraient être essentielles à la reconnaissance entre cellules. Enfin, nous expliquons comment déterminer expérimentalement la constante C, nécessaire pour convertir les rendements en graisse en occupations du TCR. Cette procédure doit être effectuée une seule fois.

La constante déterminée C peut ensuite être utilisée pour toutes les expériences ultérieures dans lesquelles le même système fret avec les mêmes couples de fluorophores est appliqué. Dans cette procédure, nous avons fondamentalement rapporté les rendements fret mesurés dans des agrégats individuels de TCR, via la récupération du donneur après blanchiment photo du capteur, aux valeurs d'intensité correspondantes détectées dans le canal fret sensibilisé. Comme discuté précédemment, le rendement fret est déterminé à partir des images du canal donneur fret corrigées du fond avant et après l'ablation du capteur fret.

Le canal FRET sensibilisé doit être aligné avec le canal du donneur F et corrigé pour les fonds en X et Y. Le passage du donneur Fred et l'excitation croisée de l'accepteur Fred, comme indiqué ici, doivent être pris en compte. Une description détaillée de la correction du passage du donneur Fred et de l'excitation croisée de l'accepteur Fred est fournie dans l'article.

Accompagnant cette vidéo, calculez maintenant pour chaque groupe de TCR le rapport du signal de la cible provenant de l'image FRET corrigée et de l'image correspondante du donneur FRET corrigée. Déterminez le signal moyen corrigé pour les donneurs FRET uniques et pour les événements FRET de molécule unique, puis calculez le rapport. La saturation du TCR est ensuite obtenue en multipliant les deux rapports.

Tracez maintenant les rendements FRET déterminés pour les clusters individuels de TCR en fonction de leurs occupances en TCR. Le paramètre C est ensuite déterminé par régression linéaire, comme illustré ici. Dans notre exemple, il s'élève à environ deux.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'utiliser une bicouche lipidique fonctionnalisée par des protéines en combinaison avec la microscopie de fluorescence à molécule unique pour mesurer la cinétique de liaison synaptique entre PMHC et TCR. Toutes les étapes nécessaires, y compris la production de protéines, le marquage des lymphocytes T et les mesures finales de FRET, ont été abordées. En outre, l'analyse d'images a été détaillée, permettant d'obtenir des courbes d'activation des lymphocytes T et des valeurs de FRET.

Enfin, la méthodologie sous-jacente à la détermination des taux cinétiques d'association et de dissociation a été présentée. Une approche analogue peut en principe être utilisée pour déterminer d'autres interactions entre récepteurs synaptiques et ligands, bien que des modifications appropriées puissent s'avérer nécessaires.