Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

Dans cette vidéo, nous allons montrer comment préparer et caractériser des bilaires lipidiques à support planaire biofonctionnalisés. Nous décrirons également en détail l’architecture d’un microscope à réflexion interne totale avec des capacités de détection de molécules uniques. Nous mesurerons la densité du pouvoir d’excitation, la fluidité et la densité protéique du calage lipidique.

Commençons par la courte introduction à la pose lipidique soutenue par le verre planaire. Lorsque de petites vésicules universelles rencontrent une surface de verre propre, elles éclatent et s’étendent pour former une bicouche lipidique contiguë. Sur un coussin d’eau, nous choisissons généralement le matériau de la paume.

L’oléphosphocholine ou POPC a le lipide prédominant car elle donne naissance à des bicouches lipidiques fluides à température ambiante et à 37 degrés Celsius. Pour la fonctionnalisation, nous ajoutons du nickel antiox, un lipide synthétique avec un groupe de tête chélateur de nickel, qui lie les protéines de marquage polyhistamine. Par exemple, la molécule de co-stimulation B sept un, la molécule d’adhésion, ICAM one, et la molécule MHC chargée de peptides marquée par fluorescence pour la reconnaissance des cellules T, comme montré ici, cependant, ce système bicouche peut en principe être utilisé pour traiter des processus entièrement différents dans une variété de systèmes biologiques.

En raison de la nature du système planaire, les événements de fluorescence peuvent être surveillés en mode de réflexion interne totale, ce qui réduit considérablement le fond cellulaire et est très bien adapté à la microscopie à fluorescence à molécule unique Pour la préparation des lipides, on a besoin des lipides, du chlore antiox POPC et nickel, et d’un flacon à fond rond propre pour dissoudre les lipides dans le rapport souhaité et le chloroforme et les sécher sous vide comme indiqué ici. Après un traitement sous vide poussé pendant la nuit, les lipides forment un film à l’intérieur du flacon. Pour la réhydratation des lipides, utilisez Degas PBS à 10 millilitres du Degas PBS pour le mélange de lipides séchés.

Ne pas mélanger. Maintenant, pour éviter l’oxydation des lipides, remplissez le ballon avec un gaz inerte tel que l’azote ou l’argon, faites pivoter le ballon. Les lipides forment une suspension laiteuse.

Prélevez un petit échantillon à blanc pour le spectrophotomètre afin d’éviter les échanges gazeux lors de l’étape suivante. Il est très important de bien fermer le ballon contenant la suspension lipidique. Utilisez un ruban adhésif stable à la chaleur, par exemple, un ruban autoclave où la protection de l’air pendant la formation physique à l’aide d’un bain à ultrasons fermé.

Après avoir monté le flacon, démarrez la procédure de sonication à une puissance maximale de 170 watts. Sonic Cade pendant 60 minutes. En raison de la formation physique, la turbidité a considérablement diminué.

Cela peut être vérifié par spectrophotométrie à 550 nanomètres. Utilisez l’aliquote prise avant la sonication comme une ébauche. La densité optique à 230 nanomètres, qui est indicative de la quantité de lipides, doit rester constante.

Ici, nous remplissons de petits tubes d’ultra-centrifugation avec une suspension d’un millilitre de plastique et les plaçons dans un rotor à angle fixe d’une ultracentrifugeuse de table. Il est très important de n’utiliser que de petites vésicules uni laina pour la préparation bicouche. Des vésicules multi laina plus grandes et plus denses, qui se forment également lors de la sonication, interfèrent avec la fluidité bicouche et doivent donc être pâlies et éliminées par centrifugation.

Tout d’abord, nous tournons pendant une heure à 150 000 G à température ambiante. Le sille obtenu est ensuite centrifugé pendant huit heures supplémentaires à 288 000 g à quatre degrés Celsius. Les lumières en verre doivent être très propres avant que les vésicules lipidiques ne puissent s’étendre sur elles pour former une bicouche contiguë et fluide.

Pour cela, nous plaçons des lamelles de couverture dans un monticule de téflon, que nous mettons ensuite dans un exercice de récipient en verre. Grande prudence lorsque des lunettes de protection, des gants de protection et une blouse de laboratoire et travaillent dans une armoire chimique. Nous ajoutons une partie de peroxyde d’hydrogène à 30 %, puis trois parties d’acide sulfurique concentré pour donner naissance à de l’acide perio monosulfurique très réactif et oxydatif.

Ce mélange réagit violemment avec les substances organiques, y compris celles de votre peau, de vos yeux et de vos vêtements. Il se réchauffe immédiatement. Incuber les lames pendant 30 minutes.

Saisissez la lamelle avec forcette Lavez soigneusement l’acide des deux côtés de la lamelle propre à l’aide d’eau distillée W ou d’eau syndiquée de haute qualité. Placez ensuite la lame sur un support en téflon et laissez-la sécher pendant 10 minutes maximum pour pouvoir produire plusieurs bicouches lipidiques individuelles à la fois. Nous collons des lamelles de recouvrement séchées à durcissement rapide.

Colle époxy à deux composants sur une chambre technique de laboratoire à huit puits ou à 16 puits. Tout d’abord, retirez soigneusement la diapositive de verre à lept d’origine de son cadre. Mélangez les deux composants de la colle dans un rapport de un pour un.

Répartissez-le uniformément dans les rainures inférieures du cadre de la chambre. Placez le couvercle propre sur le fond recouvert de colle du cadre de la chambre. Assurez-vous que la colle est uniformément répartie entre la glissière de verre et le cadre en plastique.

Laissez la colle durcir pendant 30 minutes. Diluez la suspension physique lipidique dans du PBS de un à 10 et filtrez-la à travers un filtre de 0,2 micron à 120 microlitres de cette dilution dans chaque puits d’une chambre à huit puits ou à 60 microlitres dans chaque puits d’une chambre à 16 puits. Assurez-vous que toute la surface vitrée est couverte et attendez 20 minutes.

La bicouche s’est maintenant formée Pour se débarrasser des résidus, rincez bien chaque fois avec 30 millilitres de PBS. Évitez à tout prix l’exposition à l’air de la surface du verre. Cela détruirait instantanément la bicouche pour s’assurer que chaque puits contient le même volume de tampon. Pour l’étape suivante de décoration des protéines, remplissez complètement chaque puits et retirez le dôme liquide.

Sortez 330 microlitres. Cela laissera environ 350 microlitres à l’intérieur de chacun. Eh bien, pour décorer la bicouche avec des protéines, préparez un mélange principal contenant des protéines techniques poly histamine de votre choix et ajoutez-en 50 microlitres dans chaque puits.

Les protéines se lient au groupe anti-tête nickel du lipide foncé pour garantir des résultats reproductibles, mélangées soigneusement mais soigneusement et incubent toujours pendant 60 minutes pour éliminer les protéines non liées. Laver à nouveau avec 30 millilitres de PBS. Concentrons-nous maintenant sur le matériel de microscopie.

Tout d’abord, nous illustrerons les exigences de la microscopie à réflexion interne totale pour la microscopie sur gazon basée sur l’objectif. Il faut un objectif à immersion dans l’huile avec une grande ouverture numérique. Le faisceau d’excitation laser entrant est réfléchi par le miroir dichroïque et focalisé via un ensemble de deux ou trois lentilles sur le plan focal arrière de l’objectif uniquement.

Ensuite, la lumière laser dirige l’objectif sous la forme d’un faisceau traité le long de l’axe optique. De cette façon, l’échantillon fluorescent est éclairé dans toute sa profondeur. Lorsque vous transplacez le faisceau perpendiculairement à l’axe optique, le faisceau reste assemblé, mais quitte l’objectif de manière inclinée.

Si vous continuez à transférer, vous atteindrez à un moment donné l’angle critique auquel le faisceau est totalement réfléchi à l’interface entre la lamelle de verre et l’échantillon. L’intensité de l’onde évanescente résultante décroît de façon exponentielle et seuls les étages quatre, qui se trouvent à proximité immédiate de l’interface jusqu’à plusieurs centaines de nanomètres, sont excités. Maintenant, nous illustrons comment focaliser manuellement le faisceau laser dans le plan focal arrière de l’objectif.

En utilisant trois ou deux lentilles avec les deux premières lentilles, le diamètre du faisceau laser est augmenté. Le rapport de leur distance focale détermine la taille du point d’éclairage dans le plan de l’échantillon. Pour vous assurer que le faisceau reste assemblé, ajustez la distance entre ces lentilles de manière à ce qu’elle soit égale à la somme des deux distances focales.

La troisième lentille est utilisée pour focaliser le faisceau élargi dans le plan focal arrière de l’objectif. Parce que la distance focale de cet objectif doit s’adapter aux dimensions du corps du microscope et à celles d’un périscope associé, elle doit être beaucoup plus longue dans notre cas, 75 centimètres variant. La distance entre les lentilles deux et trois n’a aucune influence sur les propriétés du faisceau.

Par conséquent, l’espace infini entre les deux peut être utilisé pour modifier le faisceau d’une manière définie sans distorsions. Par exemple, vous pouvez insérer une ouverture et projeter avec précision sur le plan de l’échantillon. En substance, vous pouvez obtenir la même chose en utilisant deux objectifs au lieu de trois.

Le système à deux lentilles est moins défini mais introduit moins d’aberrations de lentilles. Des fonctionnalités simples telles qu’une ouverture peuvent toujours être très bien mises en œuvre pour la modulation temporelle. Un laser à gaz, à fer ou à semi-conducteurs doit être placé devant un obturateur de portée milliseconde, par exemple, un obturateur mécanique ou un modulateur optique al.

Une bonne alternative est un laser à diode, qui peut être modulé électroniquement et ne nécessite pas d’arrêt externe. Deux miroirs suffisent pour orienter le faisceau vers n’importe quel endroit et dans n’importe quelle direction. Comme nous l’avons vu précédemment, les deux lentilles sont utilisées pour élargir le faisceau et le focaliser sur le plan focal arrière du microscope. Objectif.

Nous pouvons déplacer le faisceau pour la configuration du gazon en déplaçant le miroir inférieur du périscope sur un rail optique. Pour la détection d’images, nous utilisons une caméra très sensible. Par exemple, un dispositif couplé à la charge multiplicatrice d’électrons ou un second faisceau laser CCDA d’une longueur d’onde différente peut être aligné sur le trajet du faisceau.

Avec l’utilisation de miroirs et d’une superposition dichroïque. Pour la détection simultanée de deux couleurs, nous plaçons un dispositif de séparation de faisceau disponible dans le commerce dans le chemin d’émission. Pour les expériences, il est très utile d’avoir deux trajets de faisceau d’excitation indépendants en place.

Par exemple, un pour l’imagerie du gazon et un second pour le photoblanchiment ou l’activation ciblée. Cela peut être facilement réalisé en mettant en œuvre un ensemble de 2 séparateurs de faisceaux 50 50. Comme le montre notre illustration, deux systèmes différents de réglage de la lentille et du miroir donneront naissance à deux profils de faisceau et angles de faisceau individuels.

Par exemple, un élargi pour l’imagerie dans le gazon et un plus ciblé pour le blanchiment ou l’activation dans les autres gazons. Une ouverture peut être placée dans le faisceau non gazon pour façonner avec précision le point de blanchiment ou d’activation. Deux obturateurs supplémentaires, un pour chaque trajet de faisceau Activez un interrupteur de commande indépendant sur le faisceau laser, laissant l’objectif dans une trajectoire droite non inclinée.

Allumez le wattmètre et ajustez-le à la longueur d’onde laser correspondante. Mesurez la puissance de la lumière laser sur l’objectif et notez-la. Maintenant, déplacez le miroir derrière le microscope pour incliner le faisceau laser vers l’objectif en position gazon.

Ne regardez jamais directement dans la lumière laser. Dans le coin inférieur droit, vous voyez le profil d’intensité du laser d’excitation tel qu’il est visualisé par l’émission d’une bicouche décorée de protéines fluorescentes. Ici, nous utilisons une représentation de fausses couleurs pour mettre en évidence des régions d’intensités différentes.

Mesurez l’intensité moyenne de l’arrière-plan dans une zone d’intérêt suffisamment grande. Cette valeur dépend de paramètres spécifiques de la caméra, tels que le gain EM et la vitesse de lecture, et devra être soustraite de toutes les intensités mesurées. Déterminez l’intensité moyenne dans toute la zone éclairée.

Choisissez un diamètre suffisamment grand pour que les valeurs d’intensité à la périphérie soient similaires à celles de l’arrière-plan de la caméra, mesurez l’intensité moyenne de la zone centrale. Cette zone définit la région d’intérêt dans laquelle des expériences de microscopie seront réalisées ultérieurement. Maintenant, soustrayez la valeur moyenne de l’intensité de fond des intensités de la zone éliminée et de la zone centrale.

Ensuite, multipliez les intensités corrigées de l’arrière-plan par le nombre de pixels correspondant de la taille de la région pour obtenir des intensités intégrées. Réglez l’intensité intégrée de la zone éclairée sur un et calculez la fraction pour la zone centrale. La puissance mesurée avec le capteur de puissance.

Dans notre cas, cinq milliwatts sont directement proportionnels à l’intensité intégrée de l’ensemble de la zone éclairée. Multipliez cette valeur par la fraction de puissance de l’aire centrale pour déterminer la puissance dans l’aire centrale. Dans notre exemple, 1,15 milliwatt, le facteur de conversion du nombre de pixels en microns carrés dépend de la taille réelle des pixels de la puce de l’appareil photo et du grossissement de la trajectoire d’émission.

Il peut être facilement déterminé à l’aide d’une lame micrométrique. Dans notre exemple, l’aire centrale correspond à 170,8 microns carrés. La densité de puissance fait référence à la puissance mesurée divisée par l’aire et équivaut donc à 1,15 milliwatt divisé par 170,8 microns carrés ou 0,007 milliwatt par micron carré.

C’est 0,7 kilowatt par centimètre carré. Pour déterminer la fluidité de la bicouche, nous effectuons une récupération de fluorescence après photoblanchiment de l’expérience d’enveloppe. Comme le montre la vidéo en bas à gauche, nous imaginons la bicouche fluorescente à faible densité de puissance.

Sur la vidéo en bas à droite, vous pouvez voir la chambre technique de laboratoire correspondante sur le microscope. Nous blanchissons ensuite une zone circulaire avec les impulsions courtes à haute densité de puissance et surveillons la récupération à faible densité de puissance. Encore une fois, le montage donne un aperçu de l’expérience pour différents points temporels, le temps zéro étant les impulsions d’eau de Javel.

Nous quantifions l’intensité moyenne de fluorescence corrigée du bruit de fond à l’intérieur du cercle de marquage et normalisons toutes les intensités mesurées à l’intensité au début de l’expérience. Avant les impulsions d’eau de Javel, nous traçons les valeurs d’intensité normalisées en fonction du temps. La valeur de saturation représente la fraction mobile dans notre cas supérieure à 90 %Tout d’abord, prenez une image de la bicouche à faible densité de puissance d’excitation.

Par exemple, en plaçant un filtre de densité optique avec une valeur d’atténuation logarithmique de deux, cela réduit la puissance d’un facteur 100. Le temps d’exposition doit être constant tout au long de la procédure et suffisant pour imager une force de fluide unique à la densité de puissance non atténuée dans notre cas, 10 millisecondes à 0,7 kilowatt par centimètre carré. Utilisez une représentation de fausses couleurs pour mettre en évidence des zones d’intensités différentes.

Choisissez une région d’intérêt dans laquelle des mesures de molécule unique seront effectuées ultérieurement et une région de même taille. Pour la soustraction de l’arrière-plan, calculez l’intensité intégrée soustraite de l’arrière-plan. Retirez maintenant le filtre de densité optique du trajet du faisceau d’excitation, blanchissez la zone et prenez une image.

Vous verrez la force individuelle de la grippe se propager dans la zone blanchie. La force de grippe unique est limitée par la diffraction avec un diamètre typique de deux à trois pixels, prenez une région de sept par sept pixels autour de chaque signal de molécule unique et la deuxième région à proximité. Pour la soustraction de fond, il est important de quantifier le signal de la force Fluor unique uniquement.

Par conséquent, il est préférable d’imager les protéines de la couche BI avec un rapport protéine/protéine inférieur à un ou, pour les protéines spécifiquement marquées SAT. Encore plus de rapport alimentation/protéines de un, comme le montre notre exemple, mesurez les intensités intégrées pour les deux régions et soustrayez le bruit de fond du signal pour ne pas prendre le dernier événement observé montré dans notre exemple, car le blanchiment s’est probablement produit pendant l’exposition moyenne. Les signaux corrigés ici, nous le faisons pour une grippe sur quatre, que nous observons sur neuf images.

Cependant, cette procédure doit être effectuée pour au moins plusieurs centaines d’événements à molécule unique. Revenons à notre image bicouche originale observée à une densité de puissance d’excitation atténuée. La densité moléculaire est déterminée en corrigeant l’intensité intégrée de la région d’intérêt pour une faible densité de puissance d’excitation en multipliant par cent et en la divisant par l’intensité moyenne d’une molécule unique et l’aire.

Nous avons affaire à une densité de 421,4 force de fluor par micron carré. Dans notre exemple, avec un rapport alimentation/protéines de un, cela équivaut au même nombre de molécules par micron carré. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de préparer et de caractériser une bicouche lipidique fonctionnalisée par une protéine à l’aide de la microscopie à fluorescence à molécule unique.

De plus, vous devez connaître les principes de base pour modifier et mettre à niveau un microscope standard à cet effet. Nous utiliserons plus tard cette méthodologie pour déterminer la cinétique de liaison de l’antigène lié à la bicouche aux récepteurs des lymphocytes T liés aux cellules, mais de nombreuses autres applications basées sur celle-ci sont certainement réalisables.