Name: Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min
Description: Apprenez à préparer des bicouches lipidiques fonctionnalisées sur support plan pour l'étude des protéines membranaires. Cette méthode combine microscopie à fluorescence et réflexion totale interne pour une détection moléculaire optimale.

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MA a été soutenue par une bourse de Schrödinger du Fonds scientifique autrichien (FWF, J3086-B11) et remercie la Max-Planck-Society for soutien financier et administratif. GS a été soutenu par le Fonds Science et technologie de Vienne (WWTF, LS13-030). JH a été soutenu par le Fonds Science et technologie de Vienne (WWTF, LS14-031).

1. Génération et fonctionnalisation de Planar SLBS <ol><li> Le mélange des lipides <ol><li> Pour arriver à une DGS NTA-Ni / 90% composition POPC lipidique de 10% dissoudre 45 mg de POPC et 6,9 mg DGS NTA-Ni dans le chloroforme dans 250 ml de ballon à fond rond. Gardez le volume de chloroforme faible (juste quelques ml) pour s&#39;évaporer dans la prochaine étape. Pour une / 99% composition lipidique POPC 1% DGS NTA-Ni utiliser 49,5 mg et 0,69 mg POPC DGS NTA-Ni. </li><li> Retirer le chloroforme à l&#39;évaporateur rotatif lentement - une augmentation supérieure à la température ambiante est pas nécessaire. Alternativement, sauter hors l&#39;intérieur d&#39;une hotte chimique dans un flux de gaz inerte comme l&#39;azote ou l&#39;argon. Ce faisant tourner constamment dans le ballon afin de permettre l&#39;égalité de dépôt de lipide de séchage sur la moitié inférieure du ballon à fond rond. </li><li> Une fois que la majorité du chloroforme est évaporé, fixer le ballon à un vide O / N pour éliminer le chloroforme quantitativement. NOTE: Cette étape est essentielle pour éviter la contaminationdes protéines et des cellules avec du chloroforme toxique à des étapes ultérieures et d&#39;assurer la fluidité bicouche lipidique. </li></ol></li><li> La génération de petites vésicules unilamellaires (SUV&#39;S) à partir de lipides séchés NOTE: petites vésicules unilamellaires (SUV) sont entre 20 nm et 100 nm de diamètre et peuvent être facilement réalisés par les bains à ultrasons. Lipid extrusion, un procédé alternatif, peut donner lieu à des véhicules utilitaires sport et, en fonction de la taille des pores du filtre appliqué à l&#39;extrusion, également de grandes vésicules unilamellaires (LUV), qui sont 100 nm à 1000 nm. Cependant, les VUS sont les mieux adaptés pour former SLBS. <ol><li> VUS à travers les bains à ultrasons (montrés dans la vidéo): <ol><li> Dégazer PBS. Suspendre le mélange lipidique séché avec les 250 ml à fond rond en fiole de 10 ml de PBS dégazé. </li><li> Remplissez la fiole avec un gaz inerte comme l&#39;azote ou l&#39;argon, le fermer avec un bouchon et sceller le flacon avec du ruban autoclave. </li><li> Placer la fiole scellée dans un bain sonique et soniquer la suspension lipidique unet 120 à 170 W jusqu&#39;à ce qu&#39;il est devenu clair. Cela prend entre 30 et 60 min. </li><li> Surveiller la progression de la vésicule formation spectro-photométrique: s&#39;ensuivre que l&#39;absorption de l&#39;émulsion non diluée en comparaison PBS reste constante à 234 nm (comme un indicateur approximatif de la concentration lipidique), mais devrait chuter de manière significative à 550 nm (en raison de la diffusion de lumière réduite via des particules plus grosses). </li><li> Pour obtenir un culot de vésicules unilamellaires non-lourds, qui interfèrent avec la formation d&#39;un SLB contiguë, le culot suspension de vésicules par centrifugation à 150 000 xg pendant 1 heure à 25 ° C et ensuite pendant 8 heures à 288 000 xg, 4 ° C. </li><li> Filtrer le surnageant à travers un filtre à seringue ayant un diamètre de pore de 0,2 um. </li><li> Mesurer la DO à 234 nm et 550 nm pour contrôler la clarté de la préparation de vésicules et la quantité de lipide gauche. </li><li> Stocker les vésicules à 4 ° C sous atmosphère d&#39;argon ou d&#39;azote. Eventuellement, utiliser suspension de vésicules pour la préparation bicouchependant plusieurs mois. </li></ol></li><li> VUS par extrusion lipides: <ol><li> En bref, passer la suspension lipidique plusieurs fois à travers un filtre avec une taille de pores de 0,1 um. Quel que soit le procédé de fabrication, centrifuger la suspension de vésicules deux fois (1h, 150.000G, 25 ° C, puis 8 heures, 4 ° C, 288000 g) pour obtenir un culot de vésicules non-unilamellaires qui sont plus lourds. NOTE: Lorsqu&#39;il est conservé à 4 ° C sous gaz inerte, vésicules peuvent être utilisés pour la préparation de bicouche pendant plusieurs mois. </li></ol></li></ol></li><li> Formation d&#39;un SLB et de charge avec des protéines <ol><li> Traiter 24 x 50 mm 1,5 # lames de verre avec un mélange 3: 1 d&#39;acide sulfurique concentré et 30% de peroxyde d&#39;hydrogène pendant 30 min. NOTE: En raison de la nature agressive du mélange prendre un soin particulier, c.-à-porter une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité, comme indiqué dans la vidéo! </li><li> Rincer les lames de verre sous un courant d&#39;ddH 2 O d&#39;un vaporisateur. Placez-les sur un stand de téflon et les laisser sécherpendant 10 à 30 min. </li><li> Retirer la lame de fond de verre de 8 ou 16 chambres ainsi, remplir le fond avec de la colle époxy et placer soigneusement une lame de verre propre et sec sur le fond de chambre de colle-couverte. Laissez la colle durcir pendant environ 10 min. Retirer l&#39;excès de colle à partir du bas. REMARQUE: un joint étanche entre la lame de verre et la chambre peut également être facilement obtenue avec l&#39;utilisation d&#39;un bi-composant pâte à modeler de silicone dentaire, qui durcit en 10 à 30 min. Ce sceau est pas aussi ferme que la colle époxy, mais résiste à la fatigue physique régulière. Après l&#39;expérience, il peut être facilement retiré de la chambre, qui est alors réutilisable dans des expériences ultérieures. </li><li> Pipette 120 pi (60 pi) d&#39;une suspension de lipides 10 fois PBS-dilué dans chaque puits d&#39;une 8 (16) - ainsi chambre (préparé comme décrit ci-dessus) et de laisser la forme bicouche pendant 20 min. Rincer soigneusement la bicouche deux fois avec 15 ml de PBS. Une fois la bicouche est formée, elle doit toujours être immergé dans un tampon et ne jamais être exposé à l&#39;air. </li&gt; <li> Remplir chaque puits tout le chemin avec PBS, puis décoller 330μl (chambre 8 puits) ou 165μl (chambre 16 puits). Il ya 350μl (175μl) dans le puits. Ajouter 50 pi (25 pi) de cocktail contenant des protéines à étiquette His dilué dans du PBS à chaque puits (400 ou 200 pi final) et incuber à température ambiante pendant 60 min dans l&#39;obscurité. La densité de la protéine de surface peut être ajustée en faisant varier la concentration en protéines au cours de cette étape d&#39;incubation. </li><li> Rincez chaque puits deux fois avec 15 ml de PBS. NOTE: En règle générale, SLBS doit être utilisé dans des expériences pas plus de 6 heures après leur chargement avec de la protéine. Au cours de cette période, la récupération de fluorophore après photoblanchiment reste jusqu&#39;à 95% et aucune perte de protéine associée à deux couches peut être détectée. La densité de protéines doit être déterminé avant l&#39;expérience (voir ci-dessous). </li><li> Etape facultative: Pour tester la liaison non-spécifique de la protéine la DGS NTA-Ni contenant SLB, laver le SLB fois avec du PBS contenant 300 mM d&#39;imidazole. Le proprotéine devrait sortir complètement. </li></ol></li></ol> 2. Microscope Setup <ol><li> Pour la construction d&#39;un système de microscopie capable de détecter la fluorescence des fluorochromes simples référer aux recommandations formulées dans l&#39;introduction. </li></ol> 3. Mesures de puissance REMARQUE: Les fluorophores peuvent être facilement saturés de lumière d&#39;excitation en excès. Cela accélère photoblanchiment sans autre gain en émission et devrait donc être évité. Pour optimiser l&#39;éclairage échantillon la densité de puissance d&#39;excitation doit être mesurée directement sur l&#39;échantillon. Ces mesures peuvent également servir de référence pour de futures expériences. En outre, sachant que le rapport entre la puissance d&#39;entrée et de sortie laser est utile lors de l&#39;évaluation où la lumière est perdue dans le système d&#39;imagerie. <ol><li> Déplacer le faisceau d&#39;excitation dans la position verticale de sorte que sa sortie de l&#39;objectif dans un angle de 90 °. </li><li> Placez la tête de l&#39;appareil de mesure de la puissance au-dessus of la poutre et mesurer la puissance du faisceau (= P). Documenter le résultat. </li><li> Utilisation du périscope, tourner la poutre dans la position de la FRBR et l&#39;image d&#39;une bicouche fluorescent homogène intacte. Pour éviter le blanchiment et la CCD saturation du signal lieu une densité neutre (ND) filtre avec une densité optique (DO) de 2 à 3 dans le chemin de la lumière d&#39;excitation. <ol><li> Mesurer les comptes intégrés de l&#39;ensemble du champ lumineux (= je Total). De plus, mesurer la taille de la zone éclairée (A = au total). Mesurer les comptes intégrés (= je Centre) de la tache centre maximum illuminée ainsi que la taille de la tache (= Un centre). </li></ol></li><li> Mesurer le signal de fond par pixel (= B) soit à l&#39;extérieur ou la zone éclairée sans illumination de l&#39;échantillon. </li><li> Soustraire le signal d&#39;arrière-plan à partir des résultats mesurés à 3.). Pour ce faire, en multipliant le nombre de pixels de la zone en question (zone éclairée tout ou point central) avec le fondcoups par pixel. (= Je Total - A .B totale et je centre - Un centre .B). </li><li> Diviser le intégré et fond signal corrigé du point central par le signal intégré et fond corrigé de l&#39;ensemble du domaine de l&#39;éclairage. NOTE: Le résultat indique la fraction de la puissance totale située dans le centre spot (= (centre de I - Un centre .B) / (I Total - A .B totale)). Multiplication de ce résultat avec la puissance P mesurée en 2.) les résultats dans la puissance de la lumière éclairant le point central. </li><li> Déterminer la taille de la tache Un centre de μm². Pour cette diviser la taille de pixel appareil photo en um par le grossissement de l&#39;objectif, de prendre la place du résultat que μm² par pixel. <ol><li> Alternativement mesurer la taille de pixel dans l&#39;image avec l&#39;utilisation d&#39;un micromètre placé sur le microscope et de prendre la place du résultat que la zone par pixel. Multiply cette valeur par le nombre de pixels situés dans le centre spot pour arriver à la zone de spot lumineux. </li></ol></li><li> Divisez la puissance P éclairant le point central par la taille de la tache de centre A de centre, μm² pour calculer l&#39;intensité d&#39;éclairage par 2 um. Un exemple est donné sur la figure 6. </li><li> Valeurs de densité de puissance mesurée dans la FRBR non-éclairage sont généralement plus bas que ceux présents dans la FRBR illumination 13, qui dépendent également de l&#39;angle exacte à laquelle la lumière laser est totalement réfléchie. Pour arriver à des densités de puissance présents sous un éclairage FRBR, image calibrée billes fluorescentes de diamètre de 0,1 um à la fois dans la non-FRBR et la FRBR. Le rapport des intensités de fluorescence talon mesuré dans TIRF et non en mode TIRF représente le facteur de conversion C, ce qui permet la conversion de valeurs de densité de puissance mesurés dans celles efficace sous éclairage TIRF (équation 1). la densité de puissance </em&gt; FRBR = C • densité de puissance non-FRBR (équation 1) avec C = intensité de talon T IRF / intensité de talon non TIRF </li></ol> 4. des mesures de densité <ol><li> Déterminer le signal moyen de fluorophores individuelles situées sur une bicouche. Les molécules du CMH bicouche attachée chargées avec des peptides fluorescents sont idéales à cet effet puisque la protéine: label stoechiométrie est exactement un. Si l&#39;eau de Javel nécessaire toutes les étiquettes sur la bicouche dans le champ de vision et laissez la fluorescence récupérer de visualiser fluorophores simples. <ol><li> Enregistrez les images en succession rapide (par exemple, appliquent une acquisition de streaming de protocole) et de suivre la mobilité des molécules uniques sur plusieurs trames. Pour plus d&#39;informations, se reporter à la figure 7. </li></ol></li><li&gt; Marquez le point d&#39;illumination centrale dans la bicouche comme ROI. Mesurer la ROI, la variance de la densité de puissance d&#39;éclairage (qui est proportionnelle à l&#39;intensité de fluorescence) devrait être idéalement inférieure à 15%. <ol><li> Déterminer une seule molécule et de la fluorescence en vrac que dans ce ROI. Intégrer le signal d&#39;un retour sur investissement, ce qui est assez grand pour capturer 99% ou plus de la fonction d&#39;étalement de point de l&#39;émetteur unique. Lorsque l&#39;on utilise un appareil photo avec une taille de pixel de 16-20 pm (indiqué dans les spécifications de l&#39;appareil du fabricant), un objectif à grossissement de 100 fois et une ouverture numérique égale ou supérieure à 1,45, prendre une région de 7 par 7 pixels avec la pic d&#39;intensité situé dans le centre de la place. </li><li> Pour déterminer le signal de fond, intégrer les chiffres d&#39;un carré de 7 par 7 de pixel voisin, qui ne contient pas un signal de fluorescence. Soustraire le fond du signal de la molécule unique pour déterminer la valeur corrigée pour seule molécule fluorescence. Sélectionnez seulement les signaux, qui sont encore visibles dans la trame suivante. </li></ol></li><li> Répétez l&#39;étape 4.2 cinquante à plusieurs centaines de fois. La moyenne du signal de fond corrigée. Si vous le souhaitez, tracer les valeurs d&#39;intensité molécules simples comme un histogramme. Facultatif: profiter d&#39;un plugin approprié de logiciels open-source (par exemple ImageJ) ou de traiter les données en utilisant un logiciel commercial (par exemple Metamorph, Molecular Devices). Les utilisateurs expérimentés peuvent écrire leur propre programme d&#39;analyse dans Matlab ou logiciels similaires. </li><li> Placez un filtre de densité neutre de 2 ou plus dans la voie d&#39;excitation et de prendre des images d&#39;une bicouche fluorescente contenant des protéines marquées avec le même fluorophore. Enregistrer l&#39;intensité de pixel moyenne dans le même ROI utilisée pour des mesures d&#39;intensité molécule unique. Noter le temps d&#39;exposition des mesures de fluorescence en vrac. Mesurer au même endroit sans éclairage pour soustraction de fond. </li><li> Pour déterminer la densité de la protéine à l&#39;intérieur de la bicouche, multipliez la fluorescence en vrac intensité de pixel moyenne de fond corrigée déterminée à l&#39;étape 4 par le nombre de pixels par micron carré (par exemple 41.5), par 100 (si un filtre ND avec une DO de 2 a été employé) ou 1000 (si un ND filtre avec un diamètre extérieur de 3 a été utilisé) et le temps d&#39;exposition utilisée dans l&#39;étape 2 et le diviser par le signal moyen unique de molécule déterminée à l&#39;étape 3, le temps d&#39;exposition utilisée dans l&#39;étape 2 et le nombre de fluorophores par protéine. </li></ol> 5. Vérification de l&#39;intégrité de la bicouche <ol><li> Préparer une bicouche fluorescent et le placer sur la platine du microscope, comme décrit ci-dessus. </li><li> Réglez la mise au point et prendre une image de la bicouche en mode FRBR. Appliquer une impulsion de l&#39;eau de Javel courte mais intense de non-FRBR mode pour l&#39;ablation de la fluorescence dans un petit retour sur investissement en forme de disque. </li><li> Prenez une image de la bicouche en mode basse FRBR d&#39;intensité immédiatement après le blanchiment et ensuite tous les cinq à dix secondes pour contrôler la vitesse de récupération de fluorescence. </li><li> Move à une zone différente sur la bicouche et de suivre les étapes 2 et 3. prendre une autre image dans le mode faible intensité FRBR 5 min après l&#39;impulsion de l&#39;eau de Javel. Déterminer l&#39;intensité que je poste l&#39;eau de Javel dans le domaine de l&#39;eau de Javel et le comparer à l&#39;intensité avant le blanchiment I 0 au début de l&#39;expérience (pas de blanchiment aurait eu lieu) pour calculer la fraction immobile (SI) comme suit: Fraction Immobile SI (%) = (I 0 - je poste l&#39;eau de Javel) / (I 0 - fond) x 100, avec un fond = intensité mesurée dans le ROI sans lumière d&#39;excitation appliquée Le CI doit être inférieure à 10% (de préférence moins de 5%). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier en compétition.

Microscopie seule molécule offre la possibilité unique d&#39;étudier le comportement des protéines au sein de leur environnement cellulaire natif. L&#39;imagerie moléculaire devient donc de plus en plus attrayant pour un large communauté scientifique, encore beaucoup de scientifiques de la vie encore détourner de l&#39;investissement initial dans la technologie et de l&#39;expertise. Le principal avantage résultant de l&#39;assemblage de son propre système d&#39;imagerie est qu&#39;il peut être facilement ajustée aux besoins spécifiques de chacun. Comme l&#39;a suggéré ici, un non-FRBR faisceau d&#39;excitation peut être facilement mis en œuvre dans plus d&#39;un chemin de lumière de la FRBR existante, si la photo-blanchiment rapide et défini (ou -Activation) de fluorophores et les ligands est souhaitée, par exemple lors de FRAP ou ligands expériences uncaging 14 . L&#39;introduction d&#39;un diviseur de faisceau d&#39;émission permet l&#39;enregistrement simultané d&#39;au moins deux et, dans certains cas jusqu&#39;à quatre canaux fluorescents. La liste des extensions est par essence limitée uniquement parsa propre imagination. Par exemple, la mise en oeuvre d&#39;une roue de filtre motorisée d&#39;émission dans la voie d&#39;émission permet une commutation rapide entre un maximum de dix chaînes fluorescents différents. En combinant deux roues à filtres d&#39;émission motorisés (équipés chacun de 10 fentes de filtrage) en série, jusqu&#39;à 18 canaux fluorescents pouvant être lu. Imagerie basée sur la FRBR-peut être complété par des mesures de mobilisation du calcium et des réflexions perturbatrices Microscopie (IRM) après intégration d&#39;un chemin de la lampe d&#39;excitation Xénon ou Mercury. IRM est la méthode de choix pour visualiser la mesure dans laquelle les cellules sont attachés à la surface du verre ou un SLB et peuvent donc fournir des informations critiques lors de l&#39;interprétation des données d&#39;imagerie à base de la FRBR. L&#39;établissement d&#39;un faisceau d&#39;excitation élargie à l&#39;aide d&#39;un miroir dichroïque et un laser simples supplémentaire de 405 nm permet la réalisation microscopie photoactivation de localisation (PALM) ou stochastique de reconstruction microscopie optique (STORM), à savoir deux superresolutméthodologies d&#39;ions avec une précision de positionnement inférieure à la limite de diffraction de la lumière visible 15,16. Cependant, le succès expérimental est non seulement une question de matériel approprié. Pour profiter pleinement de l&#39;imagerie basée FRBR-bruit réduit, les cellules doivent prendre contact pour une surface de façon à ne pas imposer des contraintes sur la surface de la cellule ou qui interfère avec la physiologie de leur membrane plasmique. SLBS fonctionnalisés avec des protéines appropriées pour l&#39;adhésion cellulaire dépassent bien adapté à cet effet, car tous les ligands SLB-embarqués sont latéralement mobile et ajuster leur position latérale dans la bicouche en réponse au récepteur dynamique de liaison et de ségrégation. Pour fabriquer SLBS de façon reproductible, il est préférable de commencer avec les VUS de haute pureté. Comme décrit ici, il est donc essentiel d&#39;éliminer les vésicules multilamellaires, qui sont également produits au cours de la sonication, en deux étapes d&#39;ultracentrifugation i que ceux-cinterfere avec la formation de SLBS contiguës comportant une grande fluidité. SLBS de forme de haute qualité que sur des surfaces verre propre. Une fois les lames de verre nettoyés doivent être utilisées immédiatement ou stockées dans le vide. Surtout, SLBS ne doivent jamais être exposés à l&#39;air car cela entraînerait leur rupture. SLB laver implique, comme le montre, le tampon de rinçage à l&#39;utilisation d&#39;une pipette sérologique, car cela est non seulement une procédure sauver, mais aussi de gagner du temps. Pendant la récolte et la purification des protéines résidentes SLB l&#39;utilisation de détergents devrait être évitée. En effet détergent permettra de réduire considérablement la mobilité de la protéine, même lorsqu&#39;il est présent en quantités infimes. Pour contourner la nécessité pour le détergent tous ensemble, l&#39;expression soluble de ligands tag équipée polyhistidine sécrétée est recommandé dans les cellules de mammifères ou d&#39;insectes. Si le repliement des corps d&#39;inclusion de E. coli est nécessaire, la prudence doit être appliqué pour éliminer les détergents efficacement des corps d&#39;inclusion avant leur chômage et de repliement. Un avantage majeur de l&#39;emploi SLBS résultats de leur nature modulaire et reconstitutive, ce qui permet spécifiquement à disséquer le rôle d&#39;une interaction récepteur-ligand donné pour l&#39;activation des cellules et l&#39;adhésion cellulaire. À cet égard, il est important de mentionner que DGS NTA-Ni devrait être présent à 10% dans le SLB afin d&#39;empêcher les protéines en compétition pour les sites de liaison NTA-NI. Quand on emploie SLBS hébergeant seulement 1% ou 2% DGS NTA-Ni, une réduction de l&#39;association des espèces de protéines de polyhistidine marqués donné peut être remarqué, en particulier en cas de co-incubation de quantités d&#39;une deuxième espèce de protéine de polyhistidine étiqueté croissante (non publié observation). Ce phénomène est pas observée lorsque l&#39;on travaille avec SLBS comportant 10% DGS NTA-Ni. Bien que nous ayons jamais observé la liaison non spécifique de toute protéine polyhistidine étiqueté testé pour SLBS contenant DGS NTA-Ni, cette possibilité devrait être testé lors de l&#39;introduction d&#39;une protéine pour la première fois,À cette fin, nous recommandons l&#39;utilisation de SLBS dépourvues de DGS NTA-Ni (la protéine ne devrait pas lier). Deuxièmement, lorsque vous utilisez un contenant SLB DGS NTA-Ni, la protéine doit se détacher complètement après le lavage du SLB avec du PBS contenant 300 mM d&#39;imidazole. Un autre avantage important d&#39;employer SLBS est que les interactions transitoires et les événements de signalisation peuvent être surveillées avec une meilleure résolution spatio-temporelle 17-19. Ceci est au moins en partie à cause d&#39;un processus de liaison en trois dimensions est essentiellement réduite à deux dimensions d&#39;imagerie, en particulier lors de l&#39;enregistrement en mode FRBR bruit atténué. L&#39;utilisation de SLBS est compatible avec la détection du signal de molécule unique, une condition préalable pour la microscopie de photo-activé localisation (PALM) ou stochastique microscopie de reconstruction optique (Storm), c.-à-microscopie superrésolution avec une résolution inférieure à la limite de diffraction 15,16. Ces modalités d&#39;imagerie spéciales permettent seule molécule Förster Resonance Energy Traexpériences nsfer conçus pour visualiser les interactions protéine-protéine individuelles dans un environnement synaptique 20. Cette approche est expliquée en détail dans une publication JoVE appelé 21 &quot;mesure de la liaison en utilisant un test basé sur la microscopie FRET-TCR-pMHC&quot;. Lors de l&#39;interprétation des expériences à base de SLB, il faut toujours garder à l&#39;esprit que toutes les propriétés d&#39;une membrane plasmique d&#39;une cellule vivante sont présentés par SLBS, et que quelques-unes des qualités manquantes pourrait affecter la physiologie sous enquête. Après tout, les protéines SLB-intégrés sont librement diffusent et non organisés en microdomaines membranaires comme la plupart de leurs homologues cellulaires sont 5,6,22. Feuilles de membrane de plasma immobilisée provenant de cellules adhérentes, qui conservent l&#39;architecture de la membrane plasmique de cellules vivantes dans une certaine mesure, ont été avec succès employée pour étudier l&#39;absorption d&#39;antigènes de membrane-embedded par les lymphocytes B 23. Toutefois, même une tellemembranes ne pas interagir avec un cytosquelette très dynamique et disposent d&#39;aucune marge de manœuvre car ils sont pris en charge par une surface de verre rigide. Compte tenu de ces divergences, il existe clairement un besoin pour SLBS ingénierie, qui offrent des moyens de compartimenter protéines dans un mode défini et qui sont pris en charge par des surfaces de flexibilité réglable ou par des surfaces qui changent leur rigidité en réponse à des impulsions lumineuses appliquées localement.

Comprendre les mécanismes par lesquels les protéines membranaires remplir leur fonction cellulaire peut souvent être une tâche difficile, parce que leurs modes d&#39;action sont souvent définis par des interactions de faible affinité, qui sont difficiles à détecter et à évaluer par des méthodes biochimiques classiques. Les protéines membranaires peuvent en outre être hautement enrichi dans des domaines membranaires spécifiques 5,6 ou former des structures d&#39;ordre supérieur dynamiques, qui peuvent modifier, en principe, leur activité biologique 7. Fluorescence de la molécule unique microscopie laser assistée non-invasive est ainsi devenue la méthode de choix pour étudier le comportement de la protéine dans des environnements cellulaires complexes. Ceci est vrai en particulier pour les processus biochimiques qui ont lieu à la membrane plasmique, car ceux-ci peuvent en principe être surveillés en mode bruit réduit réflexion interne totale (FRBR). Voici l&#39;illumination de l&#39;échantillon est restreint à une tranche jusqu&#39;à 200 nm-mince à proximité un verre surface, ce qui entraîne une perte importante en arrière-plan cellulaire et, en raison des caractéristiques de la lumière d&#39;excitation évanescente, également à une augmentation substantielle de l&#39;intensité du signal de fluorescence 8,9. Les deux aspects sont importants lorsque l&#39;objectif pour la résolution de position et temporelle dans la détection de la molécule unique. Planar SLBS ne sont pas seulement compatible avec la FRBR microscopie. Lorsque fonctionnalisé avec des ligands appropriés ils fournissent également un accès direct à l&#39;étude de la dynamique moléculaire de reconnaissance cellule-cellule comme ils se produisent dans les cellules immunitaires ou d&#39;autres cellules. Ils peuvent également être utilisés simplement pour positionner cellules mobiles et autrement non adhérentes suffisamment à proximité de la lame de verre de telle sorte que de telles cellules peuvent être imagés dans TIRF illumination, ce qui est hautement souhaitable lorsque des expériences de conduction comportant un suivi de la molécule unique ou simple hyper-résolution sur la base molécule. A cette fin, les protéines doivent être chargées sur une SLB hautement mobile. Un avantage inhérent de la li utilisé<html> PID sont qu&#39;il n&#39;y a pas de liaison non spécifique des protéines à tous. En outre, SLBS peuvent être considérés comme liquides à deux dimensions avec une capacité inhérente de se guérir; irrégularités dans le support de verre sont compensées jusqu&#39;à un certain degré. Un protocole étape par étape est prévu pour générer bicouches très mobiles chargés de protéines d&#39;intérêt. La formation de SLBS planes est décrite, qui contiennent 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) comme ingrédient principal (90-99%) et le lipide fonctionnalisé synthétique et de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3 - {[N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique acide] succinyl} nickel sel (DGS NTA-Ni) en faible abondance (1-10%). POPC une porte acide gras saturé et un acide gras mono-insaturé et forme des bicouches lipidiques de haute fluidité même à température ambiante. DGS NTA-Ni se lie avec son groupe de tête à la queue poly-histidine et sert de point d&#39;ancrage pour des protéines poly-histidine de choix (figure 1). &quot;&gt; Fait important, le matériel de microscopie doit inclure un certain nombre de périphériques qui sont décrits ci-dessous. Avec les informations fournies et quelques connaissances de base de l&#39;optique et la physique des lasers, tout biologiste devrait être en mesure de construire une installation unique d&#39;imagerie par molécule. Excitation échantillon devrait idéalement être réalisée sur un microscope inversé en mode de réflexion interne totale (FRBR) que ce régime réduit la lumière parasite et de fond excessif résultant autrement de cellulaire auto-fluorescence 9. Pour ce faire, un objectif de la FRBR capable spéciale (voir ci-dessous) et l&#39;illumination laser sont nécessaires. Certaines expériences auront besoin de temps d&#39;illumination dans la gamme de la milliseconde et exploité en succession rapide. Pour gagner du temps d&#39;éclairage ou pour éviter le blanchiment inutiles causés par l&#39;éclairage répétitive il est souvent utile de diviser la lumière émise en deux ou plusieurs canaux spectraux. Cela permet la lecture simultanée de deux ou plusieurs profils d&#39;émission, qui peuvent devenir un facteur important lorsque conducTing expériences impliquant le transfert d&#39;énergie par résonance Förster (FRET). Voici l&#39;émission résultant d&#39;une impulsion de lumière d&#39;excitation unique peut être enregistrée à la fois du donneur FRET et accepteur FRET (comme l&#39;émission sensibilisés). La caméra doit capturer suffisamment de photons avec suffisamment faible fond de visualiser fluorophores simples pendant le temps d&#39;éclairage. Logiciels devra être à la hauteur de synchroniser excitation fermeture et l&#39;acquisition de l&#39;image. Une vue d&#39;ensemble est donnée ci-dessous et à la figure 2: Objectif de la FRBR capable: Pour la FRBR éclairage axé sur les objectifs de l&#39;ouverture numérique (NA) de l&#39;objectif doit être égale ou supérieure à 1,4 en utilisant des lames de verre standard (n = 1.515) 9. Grossissement peut varier entre 60x à 150 fois. L&#39;objectif devrait être corrigé chromatiquement pour permettre confocalité lors de l&#39;imagerie des fluorophores différents. Lasers: Le nombre de disponibles laseoptions de R a considérablement augmenté au cours des dernières années. Modernes électroniquement modulables diodes lasers à onde continue sont rentables et peuvent être exploités avec une fréquence sans précédent et la vitesse. Plus coûteux lasers à ions de gaz à exceller dans la qualité de faisceau laser, mais nécessitent fermeture externe (voir ci-dessous) et souvent vaste (eau) de refroidissement. Excitation volets: modulateurs acousto-optique (AOM) permettent fermeture rapide en succession rapide 10. Pour la fermeture étanche de la combinaison d&#39;un AOM avec des volets mécaniques est recommandée. De cette façon, le chauffage étendue de l&#39;OMA dues à l&#39;exposition de lumière continue est évitée et la lumière fuite de l&#39;AOM dans la position d&#39;arrêt est annulé. Les lentilles sont utilisés pour élargir les faisceaux laser et de les concentrer sur le plan focal arrière de l&#39;objectif. De cette façon, la lumière d&#39;excitation laisse l&#39;objectif comme un faisceau parallèle (Figure 3), qui est nécessaire pour l&#39;illumination de la FRBRl&#39;échantillon. Le déplacement du point focal au sein du plan focal arrière du centre à la périphérie de l&#39;objectif va changer l&#39;angle sous lequel le faisceau quitte l&#39;objectif, mais pas l&#39;emplacement de la tache laser sur l&#39;échantillon (Figure 3), qui est une fonction de la géométrie globale du faisceau. Éclairage FRBR découle à un angle critique, qui peut être ajustée en utilisant un jeu de miroirs fonctionnant comme un périscope pour traduire le point focal du laser dans le plan focal de l&#39;objectif. Les lentilles doivent être corrigées chromatiquement et peuvent être utilisés dans un ensemble de deux ou trois lentilles. Un système à trois lentille se compose de deux lentilles qui agissent comme un télescope pour élargir le faisceau laser (et donc le point d&#39;illumination à l&#39;échantillon) et une troisième lentille pour focaliser le faisceau élargie dans le plan focal arrière de l&#39;objectif (Figure 4). Ces deux fonctions (télescope et mise au point) peuvent également être obtenus par une combinaison de deux lentilles seulement (voir Figure 4). &quot;jove_content&quot;&gt; Miroirs devrait être d&#39;au moins 95% de réflexion pour éviter la perte de la lumière laser. Pour chaque réglage du faisceau d&#39;un ensemble de deux miroirs est généralement appliqué comme tel arrangement est suffisante pour ajuster précisément quel angle et la position d&#39;un faisceau laser. Superpositions dichroïques reflètent et transmettent la lumière de différentes longueurs d&#39;onde spécifiées et sont utilisés pour superposer ou séparer les faisceaux de deux lasers. Polychroic filtres sont plus complexes que les filtres dichroïques et sont nécessaires pour refléter la lumière d&#39;excitation entrant et sortant de transmettre la lumière d&#39;émission de l&#39;échantillon. Ils sont placés dans le cube de filtre entre l&#39;objectif et la lentille de tube du microscope. Nettoyez les filtres: Selon le type d&#39;employé laser d laser nettoyer les filtres avec une bande passante de transmission étroite doit être placé dans le faisceau laser droite après avoir quitté le laser. Filtres Notchsont conçus pour absorber efficacement la lumière laser avec une bande passante étroite et transmettre toute autre lumière. Ils sont placés dans le chemin d&#39;émission pour filtrer toute lumière d&#39;excitation de laser parasite. Cependant, les filtres notch fonctionnent uniquement à 0 ° angle entrant. Si la largeur de bande du filtre Notch est très forte, les différents angles entrants ne soient pas reflétés plus. Blocage de la lumière laser laser collimaté est pas affectée, mais la lumière diffusée en retour pourrait ne pas être efficacement empêché d&#39;atteindre la caméra. Roues à filtres motorisés équipés de roues de filtres appropriés peuvent être facilement placés dans la voie d&#39;excitation et d&#39;émission et permettent une commutation simple entre les différentes intensités lumineuses (lorsqu&#39;il est équipé de filtres ND) ou canaux fluorescents (lorsqu&#39;il est placé devant une lampe à arc xénon ou mercure ratiométrique imagerie de calcium ou en face de la caméra pour sélectionner pour le fluorophore électroluminescente). 50:50 cube diviseur de faisceau cun être utilisés pour diviser les faisceaux laser en deux trajets de faisceaux d&#39;excitation séparés et aussi de les combiner en face du périscope. Diviseur de faisceau (trajet d&#39;émission): Pour l&#39;acquisition rapide d&#39;images sans avoir besoin de changements de filtres physiques, le faisceau d&#39;émission est divisée en un canal décalée vers le bleu et décalée vers le rouge. En principe, les diviseurs de faisceau peuvent être construits en utilisant un coin dichroïque ou un ensemble de miroirs et un miroir dichroïque pour séparer le faisceau d&#39;émission d&#39;une manière dépendant de la longueur d&#39;onde. Deux filtres d&#39;émission sont nécessaires pour nettoyer les canaux émis. Filtre spatial: filtrage spatial du faisceau d&#39;excitation est parfois nécessaire de retirer des rayons de lumière non parallèles émis par des faisceaux laser de faible qualité. Un filtre spatial est constitué d&#39;un télescope de deux lentille avec un petit trou placé exactement au point focal de deux lentilles. De cette façon, la lumière parasite résultant de parties non parallèles du faisceau laser devient efficacement bloqué. Such conditions doivent être remplies lors de l&#39;établissement microscopie basée sur la FRBR. Les augmentations de filtrage spatial avec de petits trous d&#39;épingle, qui sont plus difficiles à placer dans le point focal, et avec des focales plus petits de la première lentille. Pour réduire les effets causés par les aberrations d&#39;objectif, il est avantageux d&#39;utiliser à la place de lentilles simples de haute qualité et les objectifs de microscope corrigé à l&#39;infini avec un faible grossissement (10x ou 20x). Periscope: Une configuration périscope est nécessaire de traduire le faisceau laser focalisé dans le plan focal arrière de l&#39;objectif, une condition préalable pour l&#39;imagerie de la FRBR. Il peut être facilement construit à partir de deux miroirs deux pouces, une étape de translation pour ajuster le premier miroir et un poste de positionnement du deuxième miroir pour réfléchir le faisceau concentré élargi et d&#39;excitation dans le microscope (Figure 5). Appareil photo: rétro-éclairé Electron multipliant Charge Coupled Devices (EMCCD) sont couramment utilisés pourl&#39;enregistrement de signaux de molécules simples. Ceci est en raison de leur rendement quantique élevé (jusqu&#39;à 95%), vitesse d&#39;acquisition (jusqu&#39;à 30 MHz) et relativement faible bruit. Refroidissement à -80 ° C réduit le bruit thermique et est soutenu par un certain nombre de caméras EMCCD actuellement disponibles. Une limitation de la technologie EMCCD est que le bruit de la caméra augmente linéairement avec la fois le gain de la caméra et le signal étant capturée. Cela ne veut pas le cas avec les scientifiques CMOS (sCMOS) appareils photo, qui sont nettement moins coûteux et fonctionnent grâce à l&#39;architecture particulière de la puce sCMOS également beaucoup plus rapide que les caméras EMCCD. Toutefois, un problème associé à la technologie CMOS est que l&#39;acquisition d&#39;images n&#39;a pas toujours un certain degré d&#39;une lecture quantitative sur un niveau unique molécule, car chaque pixel possède une sensibilité de détection différent. En principe, ceci peut être compensé par pixel normalisation, mais cette procédure est loin d&#39;être triviaux 11. Voilà pourquoi nous hésitons encore à nouveauféliciter caméras sCMOS pour la microscopie de molécule unique, mais compte tenu de l&#39;évolution rapide de cette technologie, les caméras sCMOS pourraient bientôt devenir la caméra de choix. Lenteur caméras CCD à balayage caméras éviter le bruit et les pixel écart lié amplification tous ensemble et de soutenir les plus rapides des taux d&#39;acquisition si elles peuvent être utilisées dans un mode dit «cinétique». Dans ce mode, l&#39;ensemble de la puce de la caméra, sauf pour une région d&#39;intérêt (ROI) est masqué, ce qui permet d&#39;employer la puce elle-même comme un périphérique de stockage. Après le retour sur investissement est exposé pour la première fois, les charges résultant sont décalés dans la zone masquée de la ligne puce de pixel par ligne de pixels, où l&#39;image est protégée contre de futures exposition à la lumière. Une fois que le déplacement de toutes les lignes de la ROI dans la zone masquée est terminée (dans la plage inférieure à la milliseconde), elle-même la ROI est prêt pour la prochaine exposition. Ce cycle est répété jusqu&#39;à ce que toutes les lignes de pixels de la puce CCD sont facturés. La puce est ensuite lu lentement avec nettement Redubruit de lecture CED. Par exemple sur une puce de pixels 1000 x 1300, 20 ROI de 50x50 pixels peuvent être enregistrées en succession rapide. Parce que les images restent sur la puce pendant un temps considérable avant d&#39;être lu, il est essentiel de veiller à masquage de haute qualité et à refroidir la caméra (par exemple avec de l&#39;azote liquide) comme un moyen de réduire le bruit thermique excessive. Certaines caméras EMCCD prennent également en charge le mode cinétique. Logiciel: Calendrier des lasers, des volets, AOMS et exposition de l&#39;appareil ainsi que le stockage d&#39;image correcte font partie intégrante de toute expérience d&#39;imagerie succès. En principe, de nombreuses opérations définies peuvent être programmées avec des logiciels disponibles qui viennent avec la caméra. Progiciels commerciaux supportent un grand nombre de périphériques matériels, qui peuvent être mises en œuvre avec peu de savoir-faire technique. Générateur d&#39;impulsion, d&#39;acquisition de données (DAQ) conseil (avec canaux de sortie analogiques et numériques) et l&#39;oscilloscope: Un générateur d&#39;impulsions est unexcellent choix pour convertir des impulsions de déclenchement en impulsions de temps et de tension définie. De cette façon, les lasers peuvent être contrôlés précisément pour la puissance de sortie et au moment opportun de la milliseconde à la gamme inférieure à la milliseconde. Cartes DAQ avec sorties analogiques atteindre le même et sont facilement intégrés dans la carte mère de l&#39;ordinateur via les slots PCI. La durée d&#39;impulsion, amplitude et la fréquence sont vérifiées avec un oscilloscope. Boîtier de l&#39;ensemble du trajet du faisceau d&#39;excitation: Pour éviter des fluctuations dans le profil d&#39;excitation due à convections de l&#39;air tout le trajet du faisceau d&#39;excitation doit être joint à partir de son environnement de laboratoire. Cette mesure est particulièrement important lors de la conduite microscopie FRBR. Les composants optiques sont également protégés contre la poussière et l&#39;oeil humain à partir de l&#39;exposition de lumière laser. Boîtiers peuvent être facilement construire à partir de carton noir, qui peut être acheté dans les magasins de fournitures d&#39;arts. Pour déterminer la fluidité de la reprise SLB fluorescence après Photobleaching (FRAP) 12 mesures sont effectuées. Pour FRAP l&#39;existence de deux chemins de faisceau d&#39;excitation est conseillé (voir Figure 3). Le premier trajet de faisceau est conçu pour l&#39;image de la fluorescence de la bicouche. Cela peut être fait dans la configuration de la FRBR et avec une faible intensité lumineuse. Le second trajet de faisceau devrait permettre une impulsion de blanchiment courte mais intense et doit être configuré dans le mode non-TIRF, de sorte qu&#39;il quitte l&#39;objectif le long de l&#39;axe optique. Une ouverture ronde peut être placé dans le trajet du faisceau d&#39;excitation (voir la Figure 8) pour projeter un profil de blanchiment parfaitement rond avec des bords définis. Pour l&#39;image de cette ouverture sur le plan de l&#39;objet, sa position optimale serait dans le plan focal de l&#39;objectif 3 (voir Figure 3). Toutefois, en raison de la longue distance focale de cette lentille, une image d&#39;ouverture d&#39;une qualité suffisante peut également être générée, lorsque l&#39;ouverture est placée au niveau de positions décalées légèrement. Après avoir effectué til imagerie expérience, les données brutes doivent être analysés de manière appropriée. Plusieurs protocoles étape-par-étape sont offerts, qui couvrent le réglage des paramètres principaux (par exemple de puissance d&#39;éclairage et de temps, angle FRBR), l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données.

<table><tbody><tr><td>#1.5 lames de verre</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>250ml fiole à fond rond</td><td>VWR</td><td>201-1357</td><td></td></tr><tr><td>50:50 séparateur de faisceau cubes</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td></td></tr><tr><td>Modulateur acousto-opitcal C1205-2</td><td>Isomet-seulement</td><td></td> <td>nécessaire si des lasers CW, qui ne peuvent pas être modulés, sont utilisés</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20009</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20006</td><td></td></tr> ruban <tr><td>autoclave</td><td>VWR</td><td>489-1312</td><td>ou tout autre tabe collant thermostable</td></tr><tr><td>Mini-extrudeuse Avanti</td><td>Avanti Lipids</td><td>610000</td><td>alternative au sonicateur à bain</td></tr><tr><td>Sonicateur à bain QSONICA Q700</td><td>QSONICA</td><td>Séparateur de faisceau Q700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cairn</td><td>P280/210/MLS</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml ; chi évaporateur rotatif</td><td>VWR</td><td>531-0837</td><td></td></tr><tr><td>appareil photo</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td>voir le texte du manuscrit pour les alternatives</td></tr><tr><td>concentrées peroxyde d’hydrogène</td><td>Roth</td><td>9683.1</td><td></td></tr><tr><td>acide sulfurique concentré</td><td>Roth</td><td>X944.2</td><td></td></tr><tr><td>colle époxy</td><td>Uhu</td><td>45705</td><td>Uhu plus sofortfest 2min</td></tr><tr><td>roue à filtres</td><td>Sutter instruments</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Chambres LabTek VWR</td><td></td><td>734-2062</td><td></td></tr><tr><td>laser&nbsp ;</td>Des variantes différentes de <td>Toptica</td><td></td> <td>(longueurs d’onde 375 - 785 nm) sont disponibles</td></tr><tr><td>lentille</td><td>Thorlabs, Newport-DGS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NTA-Ni (lipide)</td><td>Avanti Lipids</td><td>790404C</td><td>déjà en version délivrée résolue par Choroform de la variante au sel nicekl est recommandée</td></tr><tr><td>POPC (lipide)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850457C</td><td>déjà en version livrée résolue par Choroform est recommandé</td></tr><tr><td>microscope Zeiss Axiovert 200</td><td>Miroirs Zeiss</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Filtres</td><td>optiques Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td></td> Les jeux de filtres <td>AHF, Chroma, Semrock</td><td></td> <td>sont disponibles pour de nombreuses combinaisons différentes de colorants</td></tr><tr><td>oscilloscope</td><td>BK Precision&nbsp ;</td><td>2120C</td><td></td></tr><tr><td>phosphate tamponné salin (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>dégazer avant utilisation</td></tr><tr><td>périscope</td><td>Thorlabs</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>alternative au wattmètre à colle époxy</td></tr><tr><td>Lasermate-Q</td><td>Coherent-n’importe</td><td></td> <td>quel wattmètre sensible dans la gamme spectrale utilisée fera l’affaire</td></tr><tr><td>générateur d’impulsions</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SRS DG535&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>filtre spatial</td><td>Thorlabs</td><td>KT310/M</td><td></td></tr><tr><td>filtre seringue 0.2&micro ; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Objectif apochromatique 100x, NA 1,46</td><td>Zeiss</td><td>440782-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>tubes Roth</td><td></td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>pour l’ultracentrifugation polycarbonate 1,00 mm, 11 mm x 32 mm ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>45237</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ultracentrifugeuse&nbsp ;</td>Rotor d’ultracentrifugeuse <td>Thermo Fisher</td><td>RC M150GX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Spectrophotomètre UV Thermo Fisher</td><td>S120-AT2</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c</td><td>Thermo</td> <td>Fisher-pompe à</td><td></td></tr> <tr><td>vide</td><td>VWR</td><td>181-0248</td><td></td></tr></tbody></table>

bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur planar pris en charge

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

En l’espace d’une seule décennie, la microscopie à molécule unique est passée d’un domaine isolé partagé uniquement par des physiciens ayant une solide expérience en optique et en physique des lasers à une discipline qui bénéficie aujourd’hui d’une vive attention de la part des scientifiques de la vie de tous les milieux 1. En effet, l’imagerie d’une seule molécule a le potentiel unique de révéler le comportement des protéines in situ dans les cellules vivantes et de découvrir l’organisation cellulaire avec une résolution sans précédent inférieure à la limite de diffraction de la lumière visible 2. Les bicouches lipidiques planes (SLB) supportées par du verre sont un outil puissant pour amener les cellules en suspension à une proximité suffisante de la lame de verre pour qu’elles puissent être facilement imagées en mode d’éclairage à réflexion interne totale 3,4 à bruit réduit. Ils sont très utiles pour étudier la dynamique des protéines dans des événements associés à la membrane plasmique aussi divers que la formation de contacts cellule-cellule, l’endocytose, l’exocytose et la reconnaissance immunitaire. Des procédures simples sont présentées : comment générer de manière reproductible des SLB hautement mobiles fonctionnalisées par des protéines, comment déterminer la mobilité des protéines à l’intérieur et comment mesurer les densités de protéines à l’aide de la détection de molécules uniques. Il montre comment construire un système de microscopie à molécule unique rentable avec des capacités d’éclairage TIRF et comment le faire fonctionner dans l’expérience.

L&#39;architecture du système de microscopie à fluorescence molécule unique est décrit en détail sur la figure 2. Éléments individuels tels que des composants optiques et autres composants matériels sont décrits dans l&#39;introduction. Les chemins de faisceau d&#39;excitation optiques, qui donnent lieu à une manière définie à la FRBR et non FRBR-éclairage, sont présentés et expliqués dans les figures 3 à 5. Notez l&#39;emplacement du répartiteur 50:50 faisceau devant le premier miroir de périscope positionné sur un étage de translation micrométrique (figure 5). Ce séparateur de faisceau se superpose le faisceau TIRF utilisés pour l&#39;imagerie (indiqué en vert) et le faisceau non TIRF (indiqué en rouge) utilisée pour le blanchiment ou l&#39;activation locale de l&#39;ouverture définie par l&#39;échantillon de lumière à médiation (comme indiqué sur la figure 3). Les chemins combinés légers (Figure 5, indiquées en orange) sont reflétées par le second miroir de périscope dans le port arrière du MICR inverséoscope. Comme cela est expliqué dans la Figure 4 et présenté sur la figure 2, la mise en place de deux ou trois lentilles convexes élargit les profils de faisceau laser et focalise les faisceaux laser sur le plan focal arrière de l&#39;objectif de donner naissance à deux faisceaux collimatés éclairer l&#39;échantillon dans TIRF et , respectivement, en non-FRBR. Un exemple de valeurs d&#39;intensité mesurées nécessaires pour le calcul de la densité de puissance sur l&#39;échantillon est représentée sur la Figure 6. Le signal d&#39;arrière-plan moyenne à être déduit des intensités mesurées dans la zone éclairée et central (utilisé pour l&#39;imagerie), est déterminée dans une région à l&#39;intérieur de la champ de vision, qui ne sont pas éclairé par le faisceau laser (ici 7089 des chiffres). Les intensités de fond corrigée moyenne des illuminés (1684) et les chiffres de la zone centrale (4830) des chiffres sont ensuite multipliés par les tailles de région correspondant à donner lieu à des intensités intégrées (1.47110 x 8 chiffres pour la zone éclairée et 3.424 x 10 7 chiffres pour la zone centrale). Le rapport des intensités intégrées dans les régions centrales et illuminés donne la fraction de la puissance globale éclairer la zone centrale (0,23 ou 23%). Comme le montre le film, la puissance globale doit être déterminé à l&#39;objectif avec l&#39;utilisation d&#39;un compteur d&#39;énergie en mode d&#39;éclairage non-FRBR. Dans notre exemple elle est ajustée à 5 mW, ce qui donne lieu à une puissance de 5 mW x 0,23 = 1,15 mW à l&#39;intérieur de la zone centrale. Depuis 41.5 pixels quantité dans notre exemple à 1 pm 2, la zone centrale a une taille de 7089 pixels /41.5 pixels x 2 = 170,8 pm pm 2. Divisant la puissance de la lumière éclairant la zone centrale (1,15 mW) par ce domaine (170,8 um 2) donne une puissance moyennela densité de 0,7 kW / cm 2 dans la zone centrale. Figure 7 présente des images et des résultats d&#39;intensité correspondantes de fluorophores simples acquises en succession rapide (100 images par seconde, soit avec un laps de temps de 10 ms). Pour la quantification de l&#39;intensité moyenne du signal d&#39;une zone rectangulaire de sept par sept (= 49), qui couvre pixels du signal de fluorescence, est déterminée. En outre, le signal de moyenne de l&#39;arrière-plan est déterminée à l&#39;intérieur d&#39;une zone rectangulaire de sept par sept pixels situés à proximité du signal de la molécule unique. Le signal de fond moyen corrigé est multiplié par le nombre de pixels dans la région (= 49) pour donner lieu à une molécule signal unique (indiqué en gras). Une expérience FRAP représentant conçu pour évaluer la mobilité des protéines marquées par fluorescence SLB-associés est représenté dans la figure 8. Remarque sur la figure 8A l&#39;repetitive utilisation d&#39;une faible intensité faisceau d&#39;imagerie élargi et l&#39;utilisation unique d&#39;une seconde plus étroite et l&#39;ouverture définie faisceau de haute intensité pour l&#39;ablation de fluorochrome rapide en deuxième point de temps zéro. Fond soustrait intensités moyennes dans le cercle jaune, qui a été normalisée par la valeur d&#39;intensité initiale moyenne avant l&#39;impulsion de blanchiment, sont tracées sur la figure 8B contre le temps pour enregistrer la vitesse et l&#39;ampleur de la fluorescence a récupéré. Comme le montre, plus de 90% (indiqué par la ligne verte) de l&#39;intensité de bicouche initiale a récupéré dans les 75 secondes suivant l&#39;ablation fluorochrome. En conséquence, moins de 10% des protéines noyées dans la SLB indiqués sont immobiles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> Figure 1. Plan schématique d&#39;un système SLB. (A) sont constitués de SLBS POPC (90-99%) et le lipide synthétique DGS N-NTAi (1-10%). Ils se forment spontanément lorsque les surfaces de verre propres sont chargés de VUS comprenant des lipides correspondant. (B) Une fois formés, ces SLBS peuvent être facilement décorées avec des protéines solubles étendues soit avec un C- ou une étiquette N-terminale contenant douze histidines (12H, pour Exemple Les molécules de co-stimulation B7-1 et la molécule d&#39;adhésion dimères de ICAM-1) ou de protéines étendus avec deux étiquettes contenant six histidines chaque (2x6H, par exemple un dimère αβMHC classe II). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> Figure 2. Vue d&#39;ensemble des chemins d&#39;excitation et de faisceau d&#39;émission. Lasers à ions de gaz (par exemple Ar + ou Kr +) peut être actionné pour fermeture rapide avec l&#39;utilisation de mo optique acousto<html> dulators. Lasers diodes sont aujourd&#39;hui disponibles dans de nombreuses longueurs d&#39;onde et représentent une excellente alternative, car ils peuvent être modulés par voie électronique dans la microseconde-rage. Notez que les faisceaux laser peuvent être facilement ajustées par deux miroirs (dichroïques) et divisé et combiné avec l&#39;utilisation de simples diviseurs de faisceau pour donner naissance à deux ou plusieurs trajets de faisceau. Dans cet exemple, un faisceau d&#39;imagerie de la FRBR (pour surveiller les événements) et un faisceau d&#39;eau de Javel (soit à des fluorophores de blanchiment ou photo-activer molécules en cage dans une manière d&#39;ouverture défini) sont utilisés. Les deux chemins d&#39;excitation peuvent être actionnés indépendamment l&#39;un de l&#39;autre grâce à l&#39;utilisation de volets supplémentaires. Le périscope permet de traduire les faisceaux laser focalisés dans le plan focal arrière de l&#39;objectif de générer un éclairage FRBR de l&#39;échantillon. L&#39;image de fluorescence peut être divisée spectralement à l&#39;aide d&#39;un diviseur de faisceau d&#39;émission avant l&#39;acquisition à l&#39;aide d&#39;une caméra ultra-sensible (par exemple, EM-CCD ou une caméra CMOS scientifique)..com / files / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> Figure 3. Réglage de l&#39;éclairage de la FRBR en traduisant le faisceau focalisé dans le plan focal arrière de l&#39;objectif. Comme le montre le point de focalisation du faisceau laser est déplacé dans le plan focal arrière de l&#39;objectif du centre vers la périphérie par la translocation de la poutre (en utilisant un miroir agencement de périscope). En conséquence, un faisceau parallèle dans l&#39;objectif laisse un éclairage incliné jusqu&#39;à un angle critique est atteinte au cours de laquelle se produit une réflexion interne totale. Le champ évanescent est généré à l&#39;interface verre-média où la réflexion totale se produit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette fi</a><html> figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> Figure 4. systèmes optiques simples pour focaliser le faisceau laser dans le plan focal arrière de l&#39;objectif. Soit trois ou deux lentilles sont nécessaires pour élargir le faisceau laser et de se concentrer sur le plan focal arrière de l&#39;objectif de la FRBR. Deux systèmes de lentilles contiennent moins d&#39;erreurs de lentilles associées que des systèmes à trois lentilles et peut-être mieux adapté pour générer le faisceau d&#39;imagerie de la FRBR. Trois lentilles pourraient être préférable lorsque l&#39;on vise pour l&#39;élargissement du faisceau défini et un spot d&#39;éclairage avec des arêtes vives, comme cela serait nécessaire pour les études utilisant la photo-activation ou -bleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. annoté photographie de la trajectoire du faisceau à l&#39;arrière du microscope à fluorescence. Comme cela est déjà indiqué dans la figure 2 une canne mettre en oeuvre facilement deux faisceaux d&#39;excitation, l&#39;un à TIRF (indiqué en vert), l&#39;autre en mode non TIRF (indiqué en rouge). Ceux-ci deviennent superposées à l&#39;aide d&#39;un diviseur de faisceau 50/50 (BS). Lentilles convexes (L1 et L2) sont positionnés dans les poutres respectives pour les focaliser sur le plan focal arrière de l&#39;objectif (non représenté). Un périscope constitué de deux miroirs (M1 et M2) guide les deux faisceaux à travers l&#39;orifice d&#39;entrée dans le microscope. Le premier miroir (M1) peut être déplacé à l&#39;aide d&#39;un étage de translation (TS) (en tournant une vis micrométrique comme indiqué) pour déplacer une de faisceaux en position TIRF. Une fois la FRBR a été établi, le second faisceau (utilisé pour la photo-blanchiment ou -Activation, indiquée ici en rouge) peut être réglé indépendamment de la poutre de la FRBR à quitter le but dans la non-FRBRMode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> Figure 6. Mesure de la puissance dans la zone centrale de la tache d&#39;éclairage. Comme il est indiqué choisi régions appropriées d&#39;intérêt, qui reflètent fond, l&#39;ensemble de la zone éclairée (IA) et la zone centrale (CA), où les événements seront ensuite enregistrées. Soustraire les valeurs de fond de ceux enregistrés pour IA et CA et intégrer les intensités en multipliant intensités moyennes corrigées avec le nombre de pixels présents dans chaque zone (= des intensités intégrées). Diviser l&#39;intensité intégrée de CA par celle de IA pour arriver à la proportion de la puissance du faisceau d&#39;éclairage du CA (dans cet exemple: 23%). Déterminer la puissance de la lumière d&#39;éclairage le CA en multipliant la puissance du faisceau global (ici: 5 mW) avec la proportion éclairant le CA (ici: 0,23). Pour déterminer la taille de la zone centrale de multiplier la zone (ici: 7089 pixels) avec un facteur pixel à zone conversion de taille (ici: 1 / 41,5 um 2 pixel -1). Pour arriver à la densité de puissance moyenne de l&#39;excitation lumineuse éclairant le CA, diviser la puissance (ici: 1,15 mW) par la taille de la Californie. (Ici: 170,8 um 2) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> Figure 7. La quantification des signaux de molécules uniques. (A) Cours Temps de fluorophores simples sur une SLB. Une région de taille 7 x 7 pixels d&#39;intérêt (ROI, jaune) est placé autour du signal pour la quantification. Arrière-plan est déterminée à partir de l&#39;un 7 x 7 pixels voisinsROI (vert). (B) quantifiée intensités moyennes de pixels sont répertoriées. Pour déterminer le signal de la molécule unique, des valeurs de fond (ROI vert) sont soustraites des valeurs de signal (ROI jaune) et multipliées par 49. (C) seule molécule intensités d&#39;un fluorophore sont en fonction du temps. Notez que le ms point de temps 90 est omis que le fluorophore est dans le processus de blanchiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> Figure 8. Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) analyse pour déterminer l&#39;intégrité du SLB. (A) FRAP a été effectuée sur une double couche de transport IEk / CMC-Alexa Fluor 647. Chaque image 10 de l&#39;expérience est représenté. (B) FRAP quantification de l&#39;expérience représentée sur (A). Les valeurs indiquent la moyenne des intensités (I) à l&#39;intérieur de la ROI jaune représenté en (A) divisé par l&#39;intensité initiale (I o) avant le blanchiment. Points de données rouges sont affichés dans (A), la ligne verte représente 0,9 récupération des intensités originales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La préparation de bicouches lipidiques planes fonctionnalisées par du verre, la détermination de la mobilité des protéines à l’intérieur et la mesure des densités de protéines sont présentées ici. Une feuille de route pour la construction d’un microscope à réflexion interne totale à bruit réduit est esquissée, qui permet de visualiser des fluorochromes résidents d’une seule bicouche avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Dans cette vidéo, nous montrerons comment préparer et caractériser des bicouches lipidiques planes fonctionnalisées de manière biologique. Nous décrirons également en détail l'architecture d'un microscope à réflexion totale interne doté de capacités de détection de molécules uniques. Nous mesurerons la densité de puissance d'excitation, la fluidité et la densité de protéines de la bicouche lipidique.Commençons par une brève introduction aux bicouches lipidiques supportées sur verre plan. Lorsque de petits vésicules unilamellaires entrent en contact avec une surface de verre propre, ils éclatent et s'étendent pour former une bicouche lipidique continue. Sur un coussin d'eau, nous choisissons généralement le matériau PALM.Le POPC (phosphocholine d'oléine) est le lipide prédominant car il permet la formation de bicouches lipidiques fluides à température ambiante et à 37 degrés Celsius. Pour la fonctionnalisation, nous ajoutons du nickel nitrilotriacétate, un lipide synthétique portant un groupe terminal chélatant le nickel, qui fixe les protéines marquées par une polyhistidine. Par exemple, la molécule co-stimulatrice B7-1, la molécule d'adhésion ICAM-1 et la molécule MHC chargée en peptide marquée par fluorescence pour la reconnaissance par les lymphocytes T, comme illustré ici. Toutefois, ce système de bicouche peut en principe être utilisé pour étudier des processus totalement différents dans divers systèmes biologiques.En raison de la nature du système planaire, les événements de fluorescence peuvent être surveillés en mode de réflexion totale interne, ce qui réduit considérablement le bruit de fond cellulaire et convient très bien à la microscopie de fluorescence monocellulaire. Pour la préparation des lipides, on a besoin des lipides, de POPC et de chloroforme au nickel antiox, ainsi que d’un flacon rond propre. Dissoudre les lipides dans le rapport désiré et dans le chloroforme, puis les sécher sous vide comme indiqué ici. Après un traitement sous vide poussé pendant la nuit, les lipides forment un film à l’intérieur du flacon. Pour la réhydratation des lipides, utiliser du PBS dégazé, en ajoutant 10 millilitres de PBS dégazé au mélange lipidique sec.Ne pas mélanger. Pour éviter l'oxydation des lipides, remplir le flacon avec un gaz inerte tel que l'azote ou l'argon et faire tourner doucement le flacon. Les lipides forment une suspension laiteuse.Prélevez un petit échantillon servant de blanc pour le spectrophotomètre afin d'éviter les échanges gazeux lors de l'étape suivante. Il est très important de bien sceller le flacon contenant la suspension lipidique. Utilisez un ruban adhésif résistant à la chaleur, par exemple du ruban pour autoclave, assurant une protection contre l'air lors de la formation physique à l'aide d'un bain ultrasonique fermé.Après avoir mis en place le ballon, commencez la procédure de sonication à une puissance maximale de 170 watts. Soniquez pendant 60 minutes. En raison de la formation physique, la turbidité a fortement diminué.Cela peut être vérifié par spectrophotométrie à 550 nanomètres. Utilisez l'aliquote prélevée avant la sonication comme témoin. La densité optique à 230 nanomètres, qui indique la quantité de lipides, doit rester constante.Ici, nous remplissons de petites tubes d'ultracentrifugation avec un millilitre de suspension de vésicules et les plaçons dans un rotor à angle fixe d'un ultracentrifugeuse de table. Il est très important d'utiliser uniquement de petites vésicules unilamellaires pour la préparation du bicouche. Les vésicules multilamellaires plus grandes et plus denses, qui se forment également lors de la sonication, interfèrent avec la fluidité du bicouche et doivent donc être éliminées par centrifugation.Tout d'abord, nous effectuons une centrifugation pendant une heure à 150 000 G à température ambiante. Le surnageant obtenu est ensuite centrifugé huit heures supplémentaires à 288 000 G à quatre degrés Celsius. Les lamelles de verre doivent être très propres avant que les vésicules lipidiques puissent s'étendre dessus pour former une bicouche continue et fluide.À cette fin, nous plaçons des lamelles dans un monticule en téflon, que nous mettons ensuite dans un récipient en verre. Une grande prudence est requise : portez une protection oculaire, des gants de protection et une blouse de laboratoire, et travaillez dans une hotte chimique. Nous ajoutons une partie de peroxyde d'hydrogène à 30 %, puis trois parties d'acide sulfurique concentré, afin d'obtenir de l'acide peroxymonosulfurique, très réactif et oxydant.Ce mélange réagit violemment avec les substances organiques, y compris celles présentes sur la peau, les yeux et les vêtements. Il s'échauffe immédiatement. Incuber les lames pendant 30 minutes.Prenez le coverslip avec la pince. Rincez soigneusement l'acide des deux côtés du coverslip propre à l'aide d'eau distillée ou d'eau déionisée de haute qualité. Ensuite, placez la lame sur un support en téflon et laissez-la sécher pendant un maximum de 10 minutes afin de pouvoir produire plusieurs bicouches lipidiques individuelles simultanément. Nous collons les coverslips desséchés avec un adhésif à prise rapide.Colle époxy bi-composant destinée à une chambre Lab Tech à huit ou à 16 puits. Commencez par retirer soigneusement la lame de verre contenant les léptons de son cadre. Mélangez les deux composants de la colle selon un rapport un pour un.Étalez-le uniformément dans les rainures inférieures du cadre de la chambre. Placez la lame couvre-objet propre sur la partie inférieure du cadre de la chambre recouverte de colle. Veillez à ce que la colle soit uniformément répartie entre la lame de verre et le cadre en plastique.Laisser durcir la colle pendant 30 minutes. Diluer la suspension physique des lipides dans du PBS au ratio de un à dix et la filtrer à travers un filtre de 0,2 micron, en ajoutant 120 microlitres de cette dilution dans chaque puits d'une chambre à huit puits ou 60 microlitres dans chaque puits d'une chambre à 16 puits. S'assurer que toute la surface du verre est recouverte et attendre 20 minutes.Le bicouche est désormais formée. Pour éliminer les résidus, rincez chaque puits avec 30 millilitres de PBS. Évitez à tout prix l'exposition à l'air de la surface en verre, ce qui détruirait instantanément le bicouche. Veillez à ce que chaque puits contienne le même volume de tampon. Pour l'étape suivante de marquage par la protéine, remplissez complètement chaque puits puis retirez la calotte liquide.Prélvez 330 microlitres. Cela laissera environ 350 microlitres dans chacun. Pour décorer la bicouche avec des protéines, préparez un mélange maître contenant les protéines polyhistidine-tag de votre choix et ajoutez 50 microlitres de ce mélange dans chaque puits.Les protéines se lient au groupe t&ecirc;te anti-nickel du lipide sombre afin d'assurer des r&eacute;sultats reproductibles ; m&eacute;langez soigneusement mais d&eacute;licatement et incubez toujours pendant 60 minutes pour &eacute;liminer les prot&eacute;ines non li&eacute;es. Rincez &agrave; nouveau avec 30 millilitres de PBS. Concentrons-nous maintenant sur le mat&eacute;riel de microscopie.Tout d'abord, nous allons illustrer les exigences de la microscopie par réflexion totale interne pour la microscopie de gazon basée sur un objectif. Un objectif à immersion en huile avec une grande ouverture numérique est nécessaire. Le faisceau laser d'excitation incident est réfléchi par le miroir dichroïque et focalisé, à l’aide d’un ensemble de deux ou trois lentilles, uniquement sur le plan focal arrière de l’objectif.Ensuite, la lumière laser guide l'objectif sous forme d'un faisceau revêtu le long de l'axe optique. De cette manière, l'échantillon fluorescent est illuminé dans toute sa profondeur. Lorsque vous déplacez le faisceau perpendiculairement à l'axe optique, le faisceau reste collimaté, mais quitte l'objectif de façon inclinée.Si vous continuez la translation, vous atteindrez à un moment donné l'angle critique pour lequel le faisceau est entièrement réfléchi à l'interface entre la lame de verre et l'échantillon. L'intensité de l'onde évanescente résultante décroît exponentiellement et seules les structures situées à proximité immédiate de l'interface, jusqu'à plusieurs centaines de nanomètres, sont excitées. Nous illustrons maintenant comment focaliser manuellement le faisceau laser dans le plan focal arrière de l'objectif.À l'aide de trois ou deux lentilles avec les deux premières lentilles, le diamètre du faisceau laser est augmenté. Le rapport de leurs distances focales détermine la taille du spot d'illumination au niveau du plan de l'échantillon. Pour garantir que le faisceau reste collimaté, ajustez la distance entre ces lentilles de sorte qu'elle soit égale à la somme des deux distances focales.La troisième lentille sert à focaliser le faisceau élargi dans le plan focal arrière de l'objectif. Étant donné que la distance focale de cette lentille doit s'adapter aux dimensions du corps du microscope ainsi qu'à celles d'un périscope associé, elle doit être nettement plus longue dans notre cas, variant autour de 75 centimètres. La distance entre la deuxième et la troisième lentille n'a aucune influence sur les propriétés du faisceau.Par conséquent, l'espace à l'infini situé entre les éléments peut être utilisé pour modifier le faisceau de manière définie sans distorsions. Par exemple, vous pouvez insérer un diaphragme et projeter précisément sur le plan de l'échantillon. En substance, vous pouvez obtenir le même résultat en utilisant deux lentilles au lieu de trois.Le système à deux lentilles est moins défini, mais introduit moins d'aberrations de lentille. Des caractéristiques simples telles qu'un diaphragme peuvent encore être très bien mises en œuvre pour la modulation temporelle. Un laser à gaz, au fer ou à état solide doit être placé devant un obturateur fonctionnant à l'échelle des millisecondes, par exemple un obturateur mécanique ou un modulateur optique entièrement optique.Une bonne alternative est le laser à diode, qui peut être modulé électroniquement et ne nécessite pas d'obturateur externe. Deux miroirs suffisent à diriger le faisceau vers n'importe quel endroit et dans n'importe quelle direction. Comme mentionné précédemment, les deux lentilles servent à élargir le faisceau et à le focaliser sur le plan focal arrière de l'objectif du microscope.Nous pouvons transposer le faisceau pour la configuration en déplaçant le miroir inférieur du périscope sur un rail optique. Pour la détection d'images, nous utilisons une caméra très sensible. Par exemple, un dispositif à couplage de charge à multiplication électronique ou une deuxième faisceau laser de longueur d'onde différente peut être aligné dans le trajet du faisceau.À l'aide de miroirs et d'un filtre dichroïque superposé. Pour la détection simultanée en deux couleurs, nous plaçons un dispositif de séparation de faisceau disponible dans le commerce sur le trajet d'émission. Pour les expériences, il est très utile de disposer de deux trajets de faisceau d'excitation indépendants.Par exemple, l'une pour l'imagerie de surface et une deuxième pour le photoblanchiment ciblé ou l'activation. Cela peut être facilement réalisé en mettant en œuvre un ensemble de deux séparateurs de faisceau 50/50. Comme illustré dans notre schéma, deux systèmes différents de réglage de lentilles et de miroirs permettront d'obtenir deux profils de faisceau et deux angles de faisceau distincts.Par exemple, une ouverture élargie pour l'imagerie dans la zone tampon et une plus focalisée pour le blanchiment ou l'activation en dehors de cette zone. Une diaphragme peut être placée dans le faisceau hors zone tampon afin de façonner précisément la tache de blanchiment ou d'activation. Deux obturateurs supplémentaires, un pour chaque trajet du faisceau, permettent une commande indépendante d'activation du faisceau laser, en maintenant l'objectif sur un trajet rectiligne non incliné.Activez le puissancemètre et réglez-le sur la longueur d'onde du laser correspondante. Mesurez la puissance de la lumière laser au niveau de l'objectif et notez-la. Ensuite, déplacez le miroir situé derrière le microscope afin d'incliner le faisceau laser au niveau de l'objectif vers la position « turf ».Ne jamais regarder directement dans la lumière du laser. Dans le coin inférieur droit, on observe le profil d'intensité du laser d'excitation tel qu'il est visualisé par l'émission d'une bicouche marquée avec des protéines fluorescentes. Ici, nous utilisons une représentation en fausses couleurs afin de mettre en évidence les régions présentant des intensités différentes.Mesurez l'intensité moyenne du fond dans une région d'intérêt suffisamment grande. Cette valeur dépend des paramètres spécifiques de la caméra, tels que le gain EM et la vitesse de lecture, et devra être soustraite de toutes les intensités mesurées. Déterminez l'intensité moyenne dans toute la zone éclairée.Choisissez un diamètre suffisamment grand pour que les valeurs d'intensité en périphérie soient similaires à celles du fond de l'image de la caméra, puis mesurez l'intensité moyenne de la zone centrale. Cette zone définit la région d'intérêt dans laquelle les expériences de microscopie seront réalisées ultérieurement. Soustrayez maintenant la valeur moyenne d'intensité du fond à l'intensité des deux zones, celle éliminée et celle centrale.Ensuite, multiplier les intensités corrigées du fond par le nombre de pixels correspondant à la taille de la région afin d'obtenir les intensités intégrées. Définir l'intensité intégrée de la zone illuminée comme étant égale à un et calculer la fraction pour la zone centrale. La puissance mesurée avec le wattmètre.Dans notre cas, cinq milliwatts est directement proportionnel à l'intensité intégrée de toute la zone illuminée. Multipliez cette valeur par la fraction de puissance de la zone centrale pour déterminer la puissance dans la zone centrale. Dans notre exemple, 1,15 milliwatt, le facteur permettant de convertir le nombre de pixels en micromètres carrés dépend de la taille réelle des pixels de la puce de la caméra et du grossissement du trajet d'émission.On peut facilement le déterminer à l'aide d'une lame micrométrique. Dans notre exemple, la zone centrale correspond à 170,8 micromètres carrés. La densité de puissance correspond à la puissance mesurée divisée par la surface, soit 1,15 milliwatt divisé par 170,8 micromètres carrés, ou encore 0,007 milliwatt par micromètre carré.Cela correspond à 0,7 kilowatt par centimètre carré. Pour déterminer la fluidité de la bicouche, nous réalisons une expérience de récupération de fluorescence après photobléaching. Comme illustré dans la vidéo en bas à gauche, nous observons la bicouche fluorescente à faible densité de puissance.Dans la vidéo en bas à droite, vous pouvez voir la chambre correspondante du technicien de laboratoire au microscope. Nous réalisons ensuite un blanchiment d'une zone circulaire à l'aide d'impulsions brèves et de haute densité de puissance, puis nous surveillons la récupération à faible densité de puissance. Là encore, le montage offre un aperçu de l'expérience à différents points temporels, le temps zéro correspondant aux impulsions de blanchiment.Nous quantifions l'intensité moyenne de fluorescence corrigée du fond dans le cercle marqué et normalisons toutes les intensités mesurées par rapport à l'intensité au début de l'expérience. Avant les impulsions de blanchiment, nous traçons les valeurs d'intensité normalisées en fonction du temps. La valeur de saturation représente, dans notre cas, la fraction mobile, supérieure à 90 %. Tout d'abord, acquérez une image de la bicouche à faible densité de puissance d'excitation.Par exemple, en plaçant un filtre de densité optique ayant une valeur d'atténuation logarithmique de deux, on réduit la puissance d'un facteur 100. La durée d'exposition doit être constante tout au long de l'ensemble de la procédure et suffisante pour imager une force fluide unique à la densité de puissance non atténuée, dans notre cas, 10 millisecondes à 0,7 kilowatt par centimètre carré. Utilisez une représentation en fausses couleurs pour mettre en évidence les zones présentant des intensités différentes.Choisissez une région d’intérêt dans laquelle des mesures au niveau de la molécule unique seront effectuées ultérieurement, ainsi qu’une région de même taille. Pour la soustraction du fond, calculez l’intensité intégrée corrigée du fond. Retirez maintenant le filtre d’absorbance du trajet du faisceau d’excitation, soumettez la zone à un blanchiment et acquérez une image.Vous observerez des fluorophores individuels se diffusant dans la zone photodétruite. Les signaux individuels de fluorophore sont limités par la diffraction, avec un diamètre typique de deux à trois pixels ; sélectionnez une région de sept par sept pixels autour du signal de chaque molécule unique, ainsi qu'une seconde région adjacente. Pour la soustraction du fond, il est essentiel de quantifier uniquement le signal des fluorophores individuels.Par conséquent, il est préférable d'imaginer les protéines sur la couche BI avec un rapport biotine/protéine inférieur à un, ou bien des protéines spécifiquement marquées au SAT. Même avec un rapport biotine/protéine égal à un, comme illustré dans notre exemple, mesurez les intensités intégrées pour les deux régions et soustrayez le fond du signal afin de ne pas considérer le dernier événement observé dans notre exemple, car un blanchiment s'est probablement produit pendant l'exposition moyenne. Les signaux corrigés ici, nous effectuons cela pour un point fluorescent sur quatre, que nous observons sur neuf images.Cependant, cette procédure doit être effectuée sur au moins plusieurs centaines d'événements individuels de molécules. Revenons à notre image initiale de bicouche observée à une densité de puissance d'excitation atténuée. La densité moléculaire est déterminée en corrigeant l'intensité intégrée de la région d'intérêt pour une faible densité de puissance d'excitation, en la multipliant par cent et en la divisant par l'intensité moyenne d'une molécule unique et par la surface.Nous sommes confrontés à une densité de 421,4 unités de fluorescence par micron carré. Dans notre exemple, avec un rapport alimentation/protéine de un, cela correspond au même nombre de molécules par micron carré. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de préparer et de caractériser une bicouche lipidique fonctionnalisée par des protéines à l’aide de la microscopie de fluorescence monoculaire.De plus, vous devez être familiarisé avec les principes de base permettant de modifier et d'améliorer un microscope standard à cette fin. Nous utiliserons ultérieurement cette méthodologie pour déterminer la cinétique de liaison de l'antigène fixé sur une bicouche aux récepteurs T des cellules, mais de nombreuses autres applications fondées sur celle-ci sont certainement envisageables.

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