Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

Dans cette vidéo, nous montrerons comment préparer et caractériser des bicouches lipidiques planes fonctionnalisées de manière biologique. Nous décrirons également en détail l'architecture d'un microscope à réflexion totale interne doté de capacités de détection de molécules uniques. Nous mesurerons la densité de puissance d'excitation, la fluidité et la densité de protéines de la bicouche lipidique.

Commençons par une brève introduction aux bicouches lipidiques supportées sur verre plan. Lorsque de petits vésicules unilamellaires entrent en contact avec une surface de verre propre, ils éclatent et s'étendent pour former une bicouche lipidique continue. Sur un coussin d'eau, nous choisissons généralement le matériau PALM.

Le POPC (phosphocholine d'oléine) est le lipide prédominant car il permet la formation de bicouches lipidiques fluides à température ambiante et à 37 degrés Celsius. Pour la fonctionnalisation, nous ajoutons du nickel nitrilotriacétate, un lipide synthétique portant un groupe terminal chélatant le nickel, qui fixe les protéines marquées par une polyhistidine. Par exemple, la molécule co-stimulatrice B7-1, la molécule d'adhésion ICAM-1 et la molécule MHC chargée en peptide marquée par fluorescence pour la reconnaissance par les lymphocytes T, comme illustré ici. Toutefois, ce système de bicouche peut en principe être utilisé pour étudier des processus totalement différents dans divers systèmes biologiques.

En raison de la nature du système planaire, les événements de fluorescence peuvent être surveillés en mode de réflexion totale interne, ce qui réduit considérablement le bruit de fond cellulaire et convient très bien à la microscopie de fluorescence monocellulaire. Pour la préparation des lipides, on a besoin des lipides, de POPC et de chloroforme au nickel antiox, ainsi que d’un flacon rond propre. Dissoudre les lipides dans le rapport désiré et dans le chloroforme, puis les sécher sous vide comme indiqué ici. Après un traitement sous vide poussé pendant la nuit, les lipides forment un film à l’intérieur du flacon. Pour la réhydratation des lipides, utiliser du PBS dégazé, en ajoutant 10 millilitres de PBS dégazé au mélange lipidique sec.

Ne pas mélanger. Pour éviter l'oxydation des lipides, remplir le flacon avec un gaz inerte tel que l'azote ou l'argon et faire tourner doucement le flacon. Les lipides forment une suspension laiteuse.

Prélevez un petit échantillon servant de blanc pour le spectrophotomètre afin d'éviter les échanges gazeux lors de l'étape suivante. Il est très important de bien sceller le flacon contenant la suspension lipidique. Utilisez un ruban adhésif résistant à la chaleur, par exemple du ruban pour autoclave, assurant une protection contre l'air lors de la formation physique à l'aide d'un bain ultrasonique fermé.

Après avoir mis en place le ballon, commencez la procédure de sonication à une puissance maximale de 170 watts. Soniquez pendant 60 minutes. En raison de la formation physique, la turbidité a fortement diminué.

Cela peut être vérifié par spectrophotométrie à 550 nanomètres. Utilisez l'aliquote prélevée avant la sonication comme témoin. La densité optique à 230 nanomètres, qui indique la quantité de lipides, doit rester constante.

Ici, nous remplissons de petites tubes d'ultracentrifugation avec un millilitre de suspension de vésicules et les plaçons dans un rotor à angle fixe d'un ultracentrifugeuse de table. Il est très important d'utiliser uniquement de petites vésicules unilamellaires pour la préparation du bicouche. Les vésicules multilamellaires plus grandes et plus denses, qui se forment également lors de la sonication, interfèrent avec la fluidité du bicouche et doivent donc être éliminées par centrifugation.

Tout d'abord, nous effectuons une centrifugation pendant une heure à 150 000 G à température ambiante. Le surnageant obtenu est ensuite centrifugé huit heures supplémentaires à 288 000 G à quatre degrés Celsius. Les lamelles de verre doivent être très propres avant que les vésicules lipidiques puissent s'étendre dessus pour former une bicouche continue et fluide.

À cette fin, nous plaçons des lamelles dans un monticule en téflon, que nous mettons ensuite dans un récipient en verre. Une grande prudence est requise : portez une protection oculaire, des gants de protection et une blouse de laboratoire, et travaillez dans une hotte chimique. Nous ajoutons une partie de peroxyde d'hydrogène à 30 %, puis trois parties d'acide sulfurique concentré, afin d'obtenir de l'acide peroxymonosulfurique, très réactif et oxydant.

Ce mélange réagit violemment avec les substances organiques, y compris celles présentes sur la peau, les yeux et les vêtements. Il s'échauffe immédiatement. Incuber les lames pendant 30 minutes.

Prenez le coverslip avec la pince. Rincez soigneusement l'acide des deux côtés du coverslip propre à l'aide d'eau distillée ou d'eau déionisée de haute qualité. Ensuite, placez la lame sur un support en téflon et laissez-la sécher pendant un maximum de 10 minutes afin de pouvoir produire plusieurs bicouches lipidiques individuelles simultanément. Nous collons les coverslips desséchés avec un adhésif à prise rapide.

Colle époxy bi-composant destinée à une chambre Lab Tech à huit ou à 16 puits. Commencez par retirer soigneusement la lame de verre contenant les léptons de son cadre. Mélangez les deux composants de la colle selon un rapport un pour un.

Étalez-le uniformément dans les rainures inférieures du cadre de la chambre. Placez la lame couvre-objet propre sur la partie inférieure du cadre de la chambre recouverte de colle. Veillez à ce que la colle soit uniformément répartie entre la lame de verre et le cadre en plastique.

Laisser durcir la colle pendant 30 minutes. Diluer la suspension physique des lipides dans du PBS au ratio de un à dix et la filtrer à travers un filtre de 0,2 micron, en ajoutant 120 microlitres de cette dilution dans chaque puits d'une chambre à huit puits ou 60 microlitres dans chaque puits d'une chambre à 16 puits. S'assurer que toute la surface du verre est recouverte et attendre 20 minutes.

Le bicouche est désormais formée. Pour éliminer les résidus, rincez chaque puits avec 30 millilitres de PBS. Évitez à tout prix l'exposition à l'air de la surface en verre, ce qui détruirait instantanément le bicouche. Veillez à ce que chaque puits contienne le même volume de tampon. Pour l'étape suivante de marquage par la protéine, remplissez complètement chaque puits puis retirez la calotte liquide.

Prélvez 330 microlitres. Cela laissera environ 350 microlitres dans chacun. Pour décorer la bicouche avec des protéines, préparez un mélange maître contenant les protéines polyhistidine-tag de votre choix et ajoutez 50 microlitres de ce mélange dans chaque puits.

Les protéines se lient au groupe tête anti-nickel du lipide sombre afin d'assurer des résultats reproductibles ; mélangez soigneusement mais délicatement et incubez toujours pendant 60 minutes pour éliminer les protéines non liées. Rincez à nouveau avec 30 millilitres de PBS. Concentrons-nous maintenant sur le matériel de microscopie.

Tout d'abord, nous allons illustrer les exigences de la microscopie par réflexion totale interne pour la microscopie de gazon basée sur un objectif. Un objectif à immersion en huile avec une grande ouverture numérique est nécessaire. Le faisceau laser d'excitation incident est réfléchi par le miroir dichroïque et focalisé, à l’aide d’un ensemble de deux ou trois lentilles, uniquement sur le plan focal arrière de l’objectif.

Ensuite, la lumière laser guide l'objectif sous forme d'un faisceau revêtu le long de l'axe optique. De cette manière, l'échantillon fluorescent est illuminé dans toute sa profondeur. Lorsque vous déplacez le faisceau perpendiculairement à l'axe optique, le faisceau reste collimaté, mais quitte l'objectif de façon inclinée.

Si vous continuez la translation, vous atteindrez à un moment donné l'angle critique pour lequel le faisceau est entièrement réfléchi à l'interface entre la lame de verre et l'échantillon. L'intensité de l'onde évanescente résultante décroît exponentiellement et seules les structures situées à proximité immédiate de l'interface, jusqu'à plusieurs centaines de nanomètres, sont excitées. Nous illustrons maintenant comment focaliser manuellement le faisceau laser dans le plan focal arrière de l'objectif.

À l'aide de trois ou deux lentilles avec les deux premières lentilles, le diamètre du faisceau laser est augmenté. Le rapport de leurs distances focales détermine la taille du spot d'illumination au niveau du plan de l'échantillon. Pour garantir que le faisceau reste collimaté, ajustez la distance entre ces lentilles de sorte qu'elle soit égale à la somme des deux distances focales.

La troisième lentille sert à focaliser le faisceau élargi dans le plan focal arrière de l'objectif. Étant donné que la distance focale de cette lentille doit s'adapter aux dimensions du corps du microscope ainsi qu'à celles d'un périscope associé, elle doit être nettement plus longue dans notre cas, variant autour de 75 centimètres. La distance entre la deuxième et la troisième lentille n'a aucune influence sur les propriétés du faisceau.

Par conséquent, l'espace à l'infini situé entre les éléments peut être utilisé pour modifier le faisceau de manière définie sans distorsions. Par exemple, vous pouvez insérer un diaphragme et projeter précisément sur le plan de l'échantillon. En substance, vous pouvez obtenir le même résultat en utilisant deux lentilles au lieu de trois.

Le système à deux lentilles est moins défini, mais introduit moins d'aberrations de lentille. Des caractéristiques simples telles qu'un diaphragme peuvent encore être très bien mises en œuvre pour la modulation temporelle. Un laser à gaz, au fer ou à état solide doit être placé devant un obturateur fonctionnant à l'échelle des millisecondes, par exemple un obturateur mécanique ou un modulateur optique entièrement optique.

Une bonne alternative est le laser à diode, qui peut être modulé électroniquement et ne nécessite pas d'obturateur externe. Deux miroirs suffisent à diriger le faisceau vers n'importe quel endroit et dans n'importe quelle direction. Comme mentionné précédemment, les deux lentilles servent à élargir le faisceau et à le focaliser sur le plan focal arrière de l'objectif du microscope.

Nous pouvons transposer le faisceau pour la configuration en déplaçant le miroir inférieur du périscope sur un rail optique. Pour la détection d'images, nous utilisons une caméra très sensible. Par exemple, un dispositif à couplage de charge à multiplication électronique ou une deuxième faisceau laser de longueur d'onde différente peut être aligné dans le trajet du faisceau.

À l'aide de miroirs et d'un filtre dichroïque superposé. Pour la détection simultanée en deux couleurs, nous plaçons un dispositif de séparation de faisceau disponible dans le commerce sur le trajet d'émission. Pour les expériences, il est très utile de disposer de deux trajets de faisceau d'excitation indépendants.

Par exemple, l'une pour l'imagerie de surface et une deuxième pour le photoblanchiment ciblé ou l'activation. Cela peut être facilement réalisé en mettant en œuvre un ensemble de deux séparateurs de faisceau 50/50. Comme illustré dans notre schéma, deux systèmes différents de réglage de lentilles et de miroirs permettront d'obtenir deux profils de faisceau et deux angles de faisceau distincts.

Par exemple, une ouverture élargie pour l'imagerie dans la zone tampon et une plus focalisée pour le blanchiment ou l'activation en dehors de cette zone. Une diaphragme peut être placée dans le faisceau hors zone tampon afin de façonner précisément la tache de blanchiment ou d'activation. Deux obturateurs supplémentaires, un pour chaque trajet du faisceau, permettent une commande indépendante d'activation du faisceau laser, en maintenant l'objectif sur un trajet rectiligne non incliné.

Activez le puissancemètre et réglez-le sur la longueur d'onde du laser correspondante. Mesurez la puissance de la lumière laser au niveau de l'objectif et notez-la. Ensuite, déplacez le miroir situé derrière le microscope afin d'incliner le faisceau laser au niveau de l'objectif vers la position « turf ».

Ne jamais regarder directement dans la lumière du laser. Dans le coin inférieur droit, on observe le profil d'intensité du laser d'excitation tel qu'il est visualisé par l'émission d'une bicouche marquée avec des protéines fluorescentes. Ici, nous utilisons une représentation en fausses couleurs afin de mettre en évidence les régions présentant des intensités différentes.

Mesurez l'intensité moyenne du fond dans une région d'intérêt suffisamment grande. Cette valeur dépend des paramètres spécifiques de la caméra, tels que le gain EM et la vitesse de lecture, et devra être soustraite de toutes les intensités mesurées. Déterminez l'intensité moyenne dans toute la zone éclairée.

Choisissez un diamètre suffisamment grand pour que les valeurs d'intensité en périphérie soient similaires à celles du fond de l'image de la caméra, puis mesurez l'intensité moyenne de la zone centrale. Cette zone définit la région d'intérêt dans laquelle les expériences de microscopie seront réalisées ultérieurement. Soustrayez maintenant la valeur moyenne d'intensité du fond à l'intensité des deux zones, celle éliminée et celle centrale.

Ensuite, multiplier les intensités corrigées du fond par le nombre de pixels correspondant à la taille de la région afin d'obtenir les intensités intégrées. Définir l'intensité intégrée de la zone illuminée comme étant égale à un et calculer la fraction pour la zone centrale. La puissance mesurée avec le wattmètre.

Dans notre cas, cinq milliwatts est directement proportionnel à l'intensité intégrée de toute la zone illuminée. Multipliez cette valeur par la fraction de puissance de la zone centrale pour déterminer la puissance dans la zone centrale. Dans notre exemple, 1,15 milliwatt, le facteur permettant de convertir le nombre de pixels en micromètres carrés dépend de la taille réelle des pixels de la puce de la caméra et du grossissement du trajet d'émission.

On peut facilement le déterminer à l'aide d'une lame micrométrique. Dans notre exemple, la zone centrale correspond à 170,8 micromètres carrés. La densité de puissance correspond à la puissance mesurée divisée par la surface, soit 1,15 milliwatt divisé par 170,8 micromètres carrés, ou encore 0,007 milliwatt par micromètre carré.

Cela correspond à 0,7 kilowatt par centimètre carré. Pour déterminer la fluidité de la bicouche, nous réalisons une expérience de récupération de fluorescence après photobléaching. Comme illustré dans la vidéo en bas à gauche, nous observons la bicouche fluorescente à faible densité de puissance.

Dans la vidéo en bas à droite, vous pouvez voir la chambre correspondante du technicien de laboratoire au microscope. Nous réalisons ensuite un blanchiment d'une zone circulaire à l'aide d'impulsions brèves et de haute densité de puissance, puis nous surveillons la récupération à faible densité de puissance. Là encore, le montage offre un aperçu de l'expérience à différents points temporels, le temps zéro correspondant aux impulsions de blanchiment.

Nous quantifions l'intensité moyenne de fluorescence corrigée du fond dans le cercle marqué et normalisons toutes les intensités mesurées par rapport à l'intensité au début de l'expérience. Avant les impulsions de blanchiment, nous traçons les valeurs d'intensité normalisées en fonction du temps. La valeur de saturation représente, dans notre cas, la fraction mobile, supérieure à 90 %. Tout d'abord, acquérez une image de la bicouche à faible densité de puissance d'excitation.

Par exemple, en plaçant un filtre de densité optique ayant une valeur d'atténuation logarithmique de deux, on réduit la puissance d'un facteur 100. La durée d'exposition doit être constante tout au long de l'ensemble de la procédure et suffisante pour imager une force fluide unique à la densité de puissance non atténuée, dans notre cas, 10 millisecondes à 0,7 kilowatt par centimètre carré. Utilisez une représentation en fausses couleurs pour mettre en évidence les zones présentant des intensités différentes.

Choisissez une région d’intérêt dans laquelle des mesures au niveau de la molécule unique seront effectuées ultérieurement, ainsi qu’une région de même taille. Pour la soustraction du fond, calculez l’intensité intégrée corrigée du fond. Retirez maintenant le filtre d’absorbance du trajet du faisceau d’excitation, soumettez la zone à un blanchiment et acquérez une image.

Vous observerez des fluorophores individuels se diffusant dans la zone photodétruite. Les signaux individuels de fluorophore sont limités par la diffraction, avec un diamètre typique de deux à trois pixels ; sélectionnez une région de sept par sept pixels autour du signal de chaque molécule unique, ainsi qu'une seconde région adjacente. Pour la soustraction du fond, il est essentiel de quantifier uniquement le signal des fluorophores individuels.

Par conséquent, il est préférable d'imaginer les protéines sur la couche BI avec un rapport biotine/protéine inférieur à un, ou bien des protéines spécifiquement marquées au SAT. Même avec un rapport biotine/protéine égal à un, comme illustré dans notre exemple, mesurez les intensités intégrées pour les deux régions et soustrayez le fond du signal afin de ne pas considérer le dernier événement observé dans notre exemple, car un blanchiment s'est probablement produit pendant l'exposition moyenne. Les signaux corrigés ici, nous effectuons cela pour un point fluorescent sur quatre, que nous observons sur neuf images.

Cependant, cette procédure doit être effectuée sur au moins plusieurs centaines d'événements individuels de molécules. Revenons à notre image initiale de bicouche observée à une densité de puissance d'excitation atténuée. La densité moléculaire est déterminée en corrigeant l'intensité intégrée de la région d'intérêt pour une faible densité de puissance d'excitation, en la multipliant par cent et en la divisant par l'intensité moyenne d'une molécule unique et par la surface.

Nous sommes confrontés à une densité de 421,4 unités de fluorescence par micron carré. Dans notre exemple, avec un rapport alimentation/protéine de un, cela correspond au même nombre de molécules par micron carré. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de préparer et de caractériser une bicouche lipidique fonctionnalisée par des protéines à l’aide de la microscopie de fluorescence monoculaire.

De plus, vous devez être familiarisé avec les principes de base permettant de modifier et d'améliorer un microscope standard à cette fin. Nous utiliserons ultérieurement cette méthodologie pour déterminer la cinétique de liaison de l'antigène fixé sur une bicouche aux récepteurs T des cellules, mais de nombreuses autres applications fondées sur celle-ci sont certainement envisageables.