Haut-débit dépistage des Variations récalcitrant dans la biomasse lignocellulosique: Total lignine, la lignine monomères et enzymatique sucre sortie

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les résidus de prétraitement thermochimique et d'hydrolyse enzymatique entre des variantes apparentées de biomasse. Cela est réalisé en premier lieu en préparant les échantillons de biomasse pour les tests par réduction de taille, ainsi que par extraction de l'amidon et des sucres solubles. La deuxième étape consiste à distribuer la biomasse avec une grande précision dans des plaques réacteurs à haut débit compatibles thermochimiquement.

Les échantillons sont prétraités dans un réacteur à vapeur. Ensuite, les échantillons sont digérés avec une cellulase commerciale standard pendant trois jours afin d'hydrolyser la cellulose et l'hémicellulose. La dernière étape consiste à déterminer le glucose et le xylose libérés lors de l'hydrolyse enzymatique à l'aide des dosages GO pod et XDH.

En fin de compte, la quantification à haut débit du glucose et du xylose est utilisée pour déterminer la libération relative de sucres entre les échantillons, exprimée en gramme de sucre par gramme de biomasse initiale. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes à l'échelle du laboratoire, telles que le prétraitement et l'hydrolyse enzymatique à petite échelle, est qu'elle peut être réalisée simultanément sur des centaines, voire des milliers d'échantillons. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la conversion de la biomasse, notamment quels cultivars ou variants sont plus propices à la conversion en sucres et en produits ultérieurs.

Ainsi, les implications de cette technique peuvent être étendues à la compréhension de la structure et de la fonction de la paroi cellulaire, car les mutations que nous introduisons dans la voie de biosynthèse de la paroi cellulaire peuvent être analysées afin de détecter des modifications chimiques structurales. Cette méthode peut en effet fournir des informations sur les composants récalcitrants de la paroi cellulaire végétale. Elle peut également être appliquée à d'autres aspects de la conversion de la biomasse, tels que l'étude de l'activité enzymatique et des effets synergiques.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car celle-ci implique de grands ensembles d'échantillons de variantes de biomasse qui doivent être manipulés de manière identique et simultanée à l'échelle du milligramme. Cela nécessite donc des robots spécialisés et un équipement adapté. Pour commencer la procédure, transférez environ 250 milligrammes de biomasse préalablement broyée provenant d'un sac antistatique barré vers un sachet de thé numéroté, enroulez soigneusement le sachet en veillant à replier les extrémités par-dessus la biomasse afin d'éviter toute perte durant le retrait de l'amidon et l'extraction. Ensuite, fermez chaque sachet en l'entourant de fil de cuivre recouvert d'étain et enregistrez le numéro du sachet pour chaque échantillon barré.

Ajoutez 500 millilitres d'une solution enzymatique déstarchante préparée au préalable dans un récipient en plastique. Ajoutez ensuite 120 sachets de thé à la solution tampon enzymatique pour un protocole de traitement par lots. Après incubation dans un agitateur, rincez et faites tremper la biomasse dans plusieurs litres d'eau déionisée pendant 30 minutes, suite à un rinçage exhaustif de la biomasse déstarchée.

Pour éliminer les sels tampons, placez les sachets dans une colonne en chaussette pour l'extraction. Configurez le reflux en chaussette avec de l'éthanol à 95 % et extrayez les échantillons pendant 24 heures. Une fois l'extraction terminée, déroulez les sachets et remettez la biomasse séchée dans le tube d'origine portant le code-barres.

Sacs antistatiques Transférez au moins 50 milligrammes de la biomasse séchée dans un entonnoir codé à barres. Scannez les codes-barres des sacs antistatiques et de l’entonnoir récepteur afin d’assurer un suivi précis des échantillons. Après chargement des entonnoirs sur un robot de pesée solide, pesez robotiquement cinq milligrammes des échantillons séchés dans de l’acier inoxydable résistant aux acides.

Les plaques 96 puits pèsent trois répliques de chaque échantillon réparties autour de la plaque afin de minimiser les variations localisées. Ensuite, ajouter 250 microlitres d'eau déionisée dans chaque puits et sceller les plaques avec du ruban en POLYTÉTRAFLUOROÉTHYLÈNE ou PTFE à dos adhésif en silicone. À l'aide d'une pointe de fer à souder d'un huitième de pouce, percer le ruban PTFE à chaque orifice de vapeur.

Pour chaque plaque, fixer fermement les plaques à l'aide de joints en PTFE renforcé de verre d'une épaisseur de 0,031 pouce placés entre les plaques, ainsi que des plaques vides en haut et en bas de la pile. Prétraiter les échantillons à l'aide d'un réacteur à vapeur réglé à 180 degrés Celsius pendant 17,5 minutes. Une fois terminé, refroidir les plaques du réacteur à 50 degrés Celsius en les inondant d'eau déionisée.

Lorsque les plaques sont refroidies, les centrifuger dans un rotor à godets oscillants à 1700 ×g pendant 20 minutes. Ensuite, retirer le film supérieur.

Ajouter 40 microlitres de la solution mère d'enzyme à 8 % préparée précédemment dans chaque puits. Après avoir refermé avec un nouveau ruban en PTFE, placer la plaque scellée dans une pince magnétique pour plaque. Mélanger délicatement les échantillons par retournement au moins 15 fois et incuber à 50 degrés Celsius pendant 70 heures. Après l'incubation, les plaques réacteurs sont mélangées et centrifugées.

Ensuite, le robot de manipulation des liquides est utilisé pour effectuer la quantification du glucose et du xylose à l'aide de dosages colorimétriques enzymatiques, respectivement la xylose déshydrogénase (XDH) pour le xylose et la glucose oxydase, peroxydase (GO POD) pour le glucose. La plateforme est configurée avec des réservoirs contenant les réactifs GO POD et XDH, ainsi que de l'eau pour la dilution et des supports de pointes de 200 microlitres à 96 canaux pour chaque réactif. Ces pointes sont réutilisées pour plusieurs plaques de réacteurs.

Le plateau contient également des embouts jetables de 200 microlitres pour le retrait de l'eau et l'ajout des étalons de sucre, ainsi que des étalons de sucre préparés. À partir des vials HPLC du carrousel de stockage, le robot introduit trois plaques microtitration transparentes, une pour réaliser la dilution du mélange d'hydrolyse et une chacune pour les dosages XDH et GoPod. Le préhenseur déplace les quatre plaques vers des positions sur le plateau.

Des embouts monocoups de 100 microlitres à 96 canaux sont amenés sur le plateau à partir du carrousel pour être utilisés lors du transfert du réacteur à la plaque de dilution, puis de la plaque de dilution aux plaques XDH et go pod. À l’aide du pipeteur à huit canaux à interstice variable, l’eau ajoutée avant le prétraitement est retirée des trois puits situés dans chaque coin de la plaque de réacteur afin d’éviter tout transfert vers la plaque de dilution. Ces 12 puits étant destinés aux étalons de sucres à l’aide de la tête de pipetage à 96 canaux.

Une fois les trois pointes retirées de chaque coin, 180 microlitres d'eau sont ajoutés dans les puits de la plaque de dilution. Après avoir changé les pointes, les réactifs XD, H et go pod sont transférés depuis leurs réservoirs respectifs vers leurs plaques d'essai respectives à l'aide de la tête de pipetage à 96 canaux.

Pendant ce processus, les étalons de sucre sont ajoutés dans les trois puits de chaque coin de la plaque de dilution. Après être passé à des embouts plus petits, on utilise la tête de pipetage à huit canaux pour transférer 20 microlitres de surnageant d'hydrolyse dans la plaque de dilution, puis la plaque est mélangée par tri. L'échantillon doit être aspiré près de la surface du liquide afin de limiter l'encrassement des embouts par les particules de biomasse.

Après le mélange, 20 microlitres sont transférés séquentiellement à l’aide de la tête de pipetage à 96 canaux vers les plaques XDH et go pod. Après chaque mélange effectué par trier, les pointes de réacteur d’échantillons et les plaques de dilution sont replacées dans un support de déchets sur le carrousel ; les plaques XDH et go pod sont retirées et placées sur un support de carrousel séparé, puis laissées au repos pendant une heure avant d’être lues au spectrophotomètre, à l’aide d’un lecteur de plaques 96 puits ultraviolet-visible.

Régler la longueur d'onde mesurée à 510 nanomètres et enregistrer l'absorbance par rapport à un témoin réactif. Ensuite, régler la longueur d'onde mesurée sur le lecteur de plaques à 340 nanomètres et enregistrer l'absorbance à l'aide d'une petite spatule. Dispenser environ quatre milligrammes de la biomasse préparée dans un creuset en acier inoxydable de 80 microlitres conçu pour l'échantillonneur automatique du spectromètre de masse.

À l’aide d’un perforateur standard, produire manuellement des disques filtrants en verre à partir de feuilles en fibres de verre de type ad, puis charger les échantillons dans les supports du distributeur automatique à l’aide de pinces en les répartissant aléatoirement dans les cupules afin d’éviter tout biais dû à la dérive du spectromètre dans le temps. Après avoir effectué l’étalonnage et saisi les paramètres appropriés dans le spectromètre de masse, démarrer l’acquisition des données et attendre au moins 60 secondes pour obtenir suffisamment de données en vue de la collecte des spectres de fond. Enfin, lancer la méthode automatisée du distributeur automatique en utilisant un débit de gaz vecteur hélium de 0,9 litre par minute.

Un exemple de tendances est une étude portant sur la récalcitrance de 755 variants naturels de peuplier prélevés dans le nord-ouest du Pacifique. Les résultats indiquent que, lorsque le rapport entre la seringue et le guil augmente, la récalcitrance diminue jusqu'à un rapport d'environ deux, au-delà duquel l'amélioration de la récalcitrance se stabilise. Des valeurs aberrantes peuvent être observées ici, dans le cas où le gène PT quatre CL un a été sous-régulé.

Dans le peuplier, plusieurs des cent cultivars analysés présentent clairement une augmentation des composés récalcitrants, comme en témoigne la libération réduite de sucres. Différentes variétés de paille de blé cultivées sur plusieurs sites et récoltées après diverses variations des conditions de croissance ont donné lieu à 20 populations distinctes selon les combinaisons des variables ci-dessus. Ces ensembles d'échantillons sont facilement distinguables et indiquent des variables positives et négatives.

Pour les pyrolyses récalcitrantes, la spectrométrie de masse en faisceau moléculaire peut être utilisée pour évaluer les changements dans la composition de la paroi cellulaire. Les fragments spectraux de masse sont attribués à différents monomères de lignine. Lors de la comparaison d'un échantillon riche en lignine à un échantillon riche en glucides, les différences dans les données spectrales sont apparentes.

L'utilisation de données de spectrométrie de masse, couplée à une analyse en composantes principales, est illustrée ici. Le graphique des contributions des composantes principales peut aider à identifier quels caractères chimiques sont expliqués dans le graphique de classification des scores, ainsi qu'à clarifier quels caractères varient entre les groupes d'échantillons. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour analyser des milliers d'échantillons par semaine si elle est correctement appliquée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d'être aussi constant que possible et de ne comparer que des échantillons appartenant à un ensemble apparenté.

Ainsi, après son développement, cette technique a ouvert la voie à d'autres chercheurs pour travailler sur des méthodes de criblage à haut débit et d'autres domaines relatifs à la récalcitrance des parois cellulaires végétales, en utilisant des substances telles que les liquides ioniques et les prétraitements alcalins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer, manipuler et analyser correctement de grands ensembles d'échantillons de biomasse à l'échelle microscopique afin de détecter des différences de récalcitrance, grâce à la réduction de taille et à l'extraction, au prétraitement thermochimique et à l'hydrolyse enzymatique. Veuillez vous rappeler que le travail avec des pressions élevées, de la vapeur et des équipements automatisés est extrêmement dangereux, et que toutes les précautions de sécurité doivent être prises, telles que le port d'équipements de protection individuelle, ainsi que la mise en place de dispositifs de sécurité verrouillés sur tous les équipements pendant l'exécution de ces procédures.