Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS
11 juillet 2016
La spectrométrie de masse à temps de vol laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et les techniques moléculaires (séquençage du gène de l’ARNr 16S) permettent d’identifier des pathogènes bactériens rares dans les diagnostics de routine. L’objectif de ce protocole réside dans la combinaison des deux techniques qui permet d’obtenir des données plus précises et plus fiables.
L’objectif global de ce protocole de spectrométrie de masse MALDI-TOF est d’améliorer le typage des agents pathogènes rares grâce à une procédure rapide et rentable. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie diagnostique, elle permet une édification rapide de pathogènes bactériens rares. Aujourd’hui, nous voulons parler de l’odoratimimus et des bactéries du genre Myroides.
Démontrer la méthode et parler de l’interprétation des résultats. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent la trouver difficile car le transfert de bactéries, la superposition avec des paramètres et l’interprétation des résultats nécessitent des compétences techniques et une expertise microbiologique. Nous avons eu l’idée d’utiliser MALD-TOF MS pour dépister des bactéries rares lorsque nous avons eu un patient dans notre hôpital souffrant d’une infection alimentaire diabétique causée par myroides odoratimus.
Commencer ce protocole par l’extraction de l’ADN bactérien, la PCR de l’ADN ribosomique 16S et le séquençage de Sanger comme décrit dans le protocole textuel. Utilisez un cure-dent en bois pour transférer une seule colonie bactérienne dans un puits d’une cible en acier de 96 puits. Placez un microlitre d’acide formique à 70 % sur l’organisme séché à l’air sur la cible en acier et laissez sécher pendant environ deux à trois minutes.
Superposez la tache avec un microlitre de solution matricielle contenant 50 mg/ml d’ACCH dans un solvant organique composé de 50 % d’acétonitrile, de 2,5 d’acide trifluoroacétique et de 47,5 % d’eau. Laissez sécher à l’air libre la matrice enduite et la matrice superposée pendant environ cinq minutes dans une hotte. Pour introduire les échantillons, aérez l’orifice de chargement des échantillons du spectromètre de masse en appuyant sur le bouton d’entrée/sortie de l’instrument.
Ouvrez l’orifice de chargement et insérez la plaque cible MALDI-TOF MS avec la matrice de frottis bactérien séché. Fermez le port et évacuez à nouveau. Observez le vide et lorsqu’il atteint 4,5 millions de millibars, commencez la mesure.
Ouvrez le logiciel d’analyse MMIS et cliquez sur le menu Fichier. Sélectionnez Nouvelle classification » et une nouvelle fenêtre appelée MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard » devrait s’ouvrir. Tapez le nom du projet dans le champ Nom du projet » et cliquez sur Nouveau, sous la nouvelle boîte de dialogue nommée Nouveau projet, vérifiez le nom du projet et continuez en cliquant sur le bouton OK ».
Dans l’assistant de classification en temps réel du biotypage MALDI, observez la fenêtre de placement de l’analyte. Sélectionnez les positions cibles, cliquez avec le bouton droit de la souris sur n’importe quelle position sélectionnée, puis sélectionnez Ajouter des échantillons. Dans la vue tabulaire ouverte automatiquement, saisissez le nom de l’échantillon, l’ID de l’échantillon et, éventuellement, un commentaire.
Cliquez sur le bouton Suivant pour continuer. Ensuite, observez la fenêtre de sélection des méthodes MALDI Biotyper. Sélectionnez Taxonomie de Bruker"dans les MSP des arbres de taxonomie et cliquez sur Suivant"pour continuer.
Ensuite, observez la fenêtre de résumé du projet. Vérifiez les entrées insérées ci-dessus pour le projet de classification réel. Lancez l’exécution du classement en cliquant sur le bouton « Terminer ».
Les mesures démarrent automatiquement lorsque le vide approprié est atteint. Suivez l’exécution de la classification jusqu’à ce que la mesure soit terminée avec succès. Une fois la mesure terminée, ouvrez le menu Affichage » et cliquez sur Résultats » pour afficher le tableau des résultats dans le projet de classification en temps réel MALDI Biotyper One.
Affichez les résultats de la classification du biotyper MALDI de Bruker-Daltonik sous forme de fichier html dans le navigateur Web par défaut. Imprimez et enregistrez les résultats. On trouvera ci-dessous les spectres obtenus par MALDI-TOF MS qui sont mesurés et classifiés en temps réel.
Les spectres se voient attribuer un nom d’espèce et une valeur de score reflétant la qualité de la mesure. Les scores supérieurs à 2,300 représentent une identification d’espèce très probable. Un score compris entre 2.000 et 2.300 indique une identification sûre de l’espèce.
Un score inférieur à 1.700 et 2.000 désigne une identification probable de l’espèce. Et un score inférieur à 1,700 n’est pas fiable. L’identification des agents pathogènes bactériens cultivés sur une culture pure sur un milieu solide prend deux à trois minutes.
Il est important de se rappeler que les bactéries pathogènes rares ne peuvent être détectées avec la MS MALDI-TOF que lorsque les instruments contiennent de manière fiable les spectres appropriés. Sinon, il doit être éliminé en intégrant les spectres MaSDA des souches typées de leurs isolats caractérisés. Dans le cas où les résultats du score ne conduisent pas à une identification sans équivoque de la souche, d’autres méthodes, telles que le profilage biochimique ou le séquençage de l’ADNr 16S, peuvent être appliquées.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la détection bactérienne, elle peut également être appliquée à d’autres micro-organismes tels que les champignons ou les anaérobies. De plus, la résistance aux bactéries peut être mesurée. N’oubliez pas de travailler avec une matrice qui est une substance dangereuse, portez des gants, des lunettes de protection et travaillez sous une cagoule.
De plus, il est absolument nécessaire de sécher la matrice et de bien l’étaler pour éviter les éclaboussures dans la chambre d’analyse.
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Aperçu
Ce protocole décrit l'utilisation de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour améliorer l'identification de pathogènes bactériens rares. En combinant cette méthode à des techniques moléculaires, les chercheurs peuvent obtenir des diagnostics plus précis en microbiologie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Techniques de diagnostic
- Identification des agents pathogènes
Contexte
- La spectrométrie de masse MALDI-TOF est un outil puissant pour le typage des agents pathogènes.
- Les agents pathogènes bactériens rares posent des défis dans les diagnostics de routine.
- Il est essentiel de comprendre les limites des méthodes traditionnelles.
- Des compétences techniques sont nécessaires pour une mise en œuvre efficace.
Objectif de l'étude
- Améliorer la typisation des agents pathogènes rares.
- Proposer une procédure diagnostique rapide et rentable.
- Illustrer la méthode à l'aide d'exemples bactériens spécifiques.
Méthodes utilisées
- Spectrométrie de masse MALDI-TOF pour le dépistage des agents pathogènes.
- Séquençage du gène ARNr 16S pour l'identification moléculaire.
- Procédures techniques de transfert et de recouvrement bactériens.
- Interprétation des résultats de spectrométrie de masse.
Résultats principaux
- Identification réussie de Myroides odoratimimus.
- Démonstration de diagnostics rapides pour des pathogènes rares.
- Mise en évidence de l'importance de l'expertise technique.
- Apport de connaissances sur l'applicabilité de la méthode en milieu clinique.
Conclusions
- La MS par MALDI-TOF combinée à des techniques moléculaires améliore les diagnostics.
- Une formation est essentielle pour une utilisation efficace de la méthode.
- Les applications futures pourraient élargir le champ d'identification des agents pathogènes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'identification précise des agents pathogènes bactériens rares est essentielle pour la microbiologie diagnostique en recherche et développement biopharmaceutique, notamment pour les populations de patients immunodéprimés. L'intégration de la spectrométrie de masse MALDI-TOF à la séquençage de l'ARNr 16S permet une identification rapide et rentable au niveau de l'espèce, soutenant la réduction des risques mécanistiques lors de la validation des cibles antimicrobiennes. Cette approche combinée améliore la confiance prédictive dans les modèles précliniques en réduisant les faux négatifs dans la détection des agents pathogènes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en confirmant l'identité de pathogènes rares dans des modèles d'infection.
- Valeur opérationnelle : Fournit une identification robuste des souches conforme à la nomenclature, essentielle pour l'atténuation du risque ciblé reproductible.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille grâce à une caractérisation précise des pathogènes dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des résultats quantitatifs (par exemple, >2,300 pour une identification hautement probable) permettant une confirmation normalisée des hits dans les criblages antimicrobiens.
- Valeur opérationnelle : Facilite la préparation des tests grâce à une identification rapide (<3 min) à partir de culture pure, améliorant le débit et l'évolutivité du criblage.
- Valeur de reproductibilité : Assure la comparabilité entre laboratoires par un appariement spectral standardisé et une base de données validée de référence.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Relie la découverte à la continuité préclinique en validant les agents pathogènes rares dans des modèles d'infection cliniquement pertinents.
- Valeur opérationnelle : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque lorsque les seuils de score (2,000–2,300) confirment une identification fiable de l'espèce.
- Continuité translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs lorsque la présence de l'agent pathogène est corrélée à la réponse de l'hôte dans des modèles immunodéprimés.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la validation de la cible à l'évaluation préclinique, où l'identification précise de l'agent pathogène oriente les études mécanistiques et l'évaluation des composés candidats.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en confirmant la présence d'agents bactériens rares dans des modèles d'infection, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique.
- Dépistage : Fournit des systèmes biologiques prêts à l'essai et validés, dotés de sorties quantitatives, permettant une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Fournit des résultats basés sur un score (par exemple, classification MALDI Biotyper) permettant une comparaison objective des conditions et la validation des résultats positifs.
- Recherche translationnelle : Assure un lien avec la continuité préclinique grâce à la validation de pathogènes dans des systèmes pertinents pour la maladie, uniquement lorsque cela est étayé par les données sources.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité diagnostique réutilisable dans plusieurs projets portant sur des pathogènes rares, réduisant les efforts redondants de validation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles, réduction des attributions erronées de pathogènes et atténuation des risques mécanistiques.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de l'identification des pathogènes entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'engagement ou de retrait dans les programmes antimicrobiens, efficacité du capital grâce à des diagnostics rapides et réduction des risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation fondée sur les risques des candidats antimicrobiens à l'aide d'identités de pathogènes confirmées dans des modèles précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microbiologie pour le transfert bactérien, la superposition de la matrice et l'interprétation des résultats.
- Dépend d'un équipement MALDI-TOF MS doté de bases de données taxonomiques mises à jour (par exemple, Bruker Taxonomy) pour une correspondance précise des spectres.
- Exige des protocoles normalisés de préparation des échantillons afin d'assurer un dépôt sec de la matrice et de l'ensemencement, évitant ainsi une contamination de l'analyseur.
- Implique un recours à un séquençage de l'ARNr 16S ou à un profil biochimique lorsque les scores MALDI-TOF sont inférieurs à 1,700, ce qui rend l'identification non fiable.
- Implique des protocoles de sécurité pour manipuler des solutions matricielles dangereuses (par exemple, acide formique, acétonitrile) sous hotte aspirante et avec des équipements de protection individuelle (EPI).
