Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS
July 11th, 2016
La spectrométrie de masse à temps de vol laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et les techniques moléculaires (séquençage du gène de l’ARNr 16S) permettent d’identifier des pathogènes bactériens rares dans les diagnostics de routine. L’objectif de ce protocole réside dans la combinaison des deux techniques qui permet d’obtenir des données plus précises et plus fiables.
L’objectif global de ce protocole de spectrométrie de masse MALDI-TOF est d’améliorer le typage des agents pathogènes rares grâce à une procédure rapide et rentable. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie diagnostique, elle permet une édification rapide de pathogènes bactériens rares. Aujourd’hui, nous voulons parler de l’odoratimimus et des bactéries du genre Myroides.
Démontrer la méthode et parler de l’interprétation des résultats. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent la trouver difficile car le transfert de bactéries, la superposition avec des paramètres et l’interprétation des résultats nécessitent des compétences techniques et une expertise microbiologique. Nous avons eu l’idée d’utiliser MALD-TOF MS pour dépister des bactéries rares lorsque nous avons eu un patient dans notre hôpital souffrant d’une infection alimentaire diabétique causée par myroides odoratimus.
Commencer ce protocole par l’extraction de l’ADN bactérien, la PCR de l’ADN ribosomique 16S et le séquençage de Sanger comme décrit dans le protocole textuel. Utilisez un cure-dent en bois pour transférer une seule colonie bactérienne dans un puits d’une cible en acier de 96 puits. Placez un microlitre d’acide formique à 70 % sur l’organisme séché à l’air sur la cible en acier et laissez sécher pendant environ deux à trois minutes.
Superposez la tache avec un microlitre de solution matricielle contenant 50 mg/ml d’ACCH dans un solvant organique composé de 50 % d’acétonitrile, de 2,5 d’acide trifluoroacétique et de 47,5 % d’eau. Laissez sécher à l’air libre la matrice enduite et la matrice superposée pendant environ cinq minutes dans une hotte. Pour introduire les échantillons, aérez l’orifice de chargement des échantillons du spectromètre de masse en appuyant sur le bouton d’entrée/sortie de l’instrument.
Ouvrez l’orifice de chargement et insérez la plaque cible MALDI-TOF MS avec la matrice de frottis bactérien séché. Fermez le port et évacuez à nouveau. Observez le vide et lorsqu’il atteint 4,5 millions de millibars, commencez la mesure.
Ouvrez le logiciel d’analyse MMIS et cliquez sur le menu Fichier. Sélectionnez Nouvelle classification » et une nouvelle fenêtre appelée MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard » devrait s’ouvrir. Tapez le nom du projet dans le champ Nom du projet » et cliquez sur Nouveau, sous la nouvelle boîte de dialogue nommée Nouveau projet, vérifiez le nom du projet et continuez en cliquant sur le bouton OK ».
Dans l’assistant de classification en temps réel du biotypage MALDI, observez la fenêtre de placement de l’analyte. Sélectionnez les positions cibles, cliquez avec le bouton droit de la souris sur n’importe quelle position sélectionnée, puis sélectionnez Ajouter des échantillons. Dans la vue tabulaire ouverte automatiquement, saisissez le nom de l’échantillon, l’ID de l’échantillon et, éventuellement, un commentaire.
Cliquez sur le bouton Suivant pour continuer. Ensuite, observez la fenêtre de sélection des méthodes MALDI Biotyper. Sélectionnez Taxonomie de Bruker"dans les MSP des arbres de taxonomie et cliquez sur Suivant"pour continuer.
Ensuite, observez la fenêtre de résumé du projet. Vérifiez les entrées insérées ci-dessus pour le projet de classification réel. Lancez l’exécution du classement en cliquant sur le bouton « Terminer ».
Les mesures démarrent automatiquement lorsque le vide approprié est atteint. Suivez l’exécution de la classification jusqu’à ce que la mesure soit terminée avec succès. Une fois la mesure terminée, ouvrez le menu Affichage » et cliquez sur Résultats » pour afficher le tableau des résultats dans le projet de classification en temps réel MALDI Biotyper One.
Affichez les résultats de la classification du biotyper MALDI de Bruker-Daltonik sous forme de fichier html dans le navigateur Web par défaut. Imprimez et enregistrez les résultats. On trouvera ci-dessous les spectres obtenus par MALDI-TOF MS qui sont mesurés et classifiés en temps réel.
Les spectres se voient attribuer un nom d’espèce et une valeur de score reflétant la qualité de la mesure. Les scores supérieurs à 2,300 représentent une identification d’espèce très probable. Un score compris entre 2.000 et 2.300 indique une identification sûre de l’espèce.
Un score inférieur à 1.700 et 2.000 désigne une identification probable de l’espèce. Et un score inférieur à 1,700 n’est pas fiable. L’identification des agents pathogènes bactériens cultivés sur une culture pure sur un milieu solide prend deux à trois minutes.
Il est important de se rappeler que les bactéries pathogènes rares ne peuvent être détectées avec la MS MALDI-TOF que lorsque les instruments contiennent de manière fiable les spectres appropriés. Sinon, il doit être éliminé en intégrant les spectres MaSDA des souches typées de leurs isolats caractérisés. Dans le cas où les résultats du score ne conduisent pas à une identification sans équivoque de la souche, d’autres méthodes, telles que le profilage biochimique ou le séquençage de l’ADNr 16S, peuvent être appliquées.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la détection bactérienne, elle peut également être appliquée à d’autres micro-organismes tels que les champignons ou les anaérobies. De plus, la résistance aux bactéries peut être mesurée. N’oubliez pas de travailler avec une matrice qui est une substance dangereuse, portez des gants, des lunettes de protection et travaillez sous une cagoule.
De plus, il est absolument nécessaire de sécher la matrice et de bien l’étaler pour éviter les éclaboussures dans la chambre d’analyse.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Aperçu
Ce protocole décrit l'utilisation de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour améliorer l'identification des pathogènes bactériens rares. En intégrant cette méthode aux techniques moléculaires, les chercheurs peuvent obtenir des diagnostics plus précis en microbiologie.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Microbiologie
- Techniques diagnostiques
- Identification des pathogènes
Contexte
- La MALDI-TOF MS est un outil puissant pour le typage des pathogènes.
- Les pathogènes bactériens rares posent des défis dans les diagnostics de routine.
- Comprendre les limites des méthodes traditionnelles est crucial.
- Des compétences techniques sont requises pour une mise en œuvre efficace.
Objectif de l'étude
- Améliorer le typage des pathogènes rares.
- Fournir une procédure de diagnostic rapide et rentable.
- Démontrer la méthode en utilisant des exemples bactériens spécifiques.
Méthodes utilisées
- Spectrométrie de masse MALDI-TOF pour le dépistage des pathogènes.
- Séquençage du gène 16S rRNA pour l'identification moléculaire.
- Procédures techniques pour le transfert et le recouvrement bactériens.
- Interprétation des résultats de spectrométrie de masse.
Résultats principaux
- Identification réussie de Myroides odoratimimus.
- Diagnostic rapide démontré pour les pathogènes rares.
- Importance soulignée de l'expertise technique.
- Aperçus sur l'applicabilité de la méthode dans les contextes cliniques.
Conclusions
- La MALDI-TOF MS combinée aux techniques moléculaires améliore les diagnostics.
- La formation est essentielle pour une utilisation efficace de la méthode.
- Les applications futures pourraient élargir la portée de l'identification des pathogènes.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Accurate identification of rare bacterial pathogens is critical for diagnostic microbiology in biopharma R&D, particularly for immunocompromised patient populations. Integrating MALDI-TOF MS with 16S rRNA sequencing enables rapid, cost-effective species-level identification, supporting mechanistic de-risking in antimicrobial target validation. This combined approach improves predictive confidence in preclinical models by reducing false negatives in pathogen detection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming rare pathogen identity in infection models.
- Operational Value: Provides robust, nomenclature-compliant strain identification essential for reproducible target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through accurate pathogen characterization in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative score outputs (e.g., >2.300 for highly probable ID) that enable standardized hit confirmation in antimicrobial screens.
- Operational Value: Facilitates assay readiness via rapid (<3 min) pure-culture identification, improving screening throughput and scalability.
- Reproducibility Value: Ensures cross-lab comparability through standardized spectral matching and validated database reliance.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical continuity by validating rare pathogens in clinically relevant infection models.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions when score thresholds (2.000–2.300) confirm secure species identification.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment when pathogen presence correlates with host response in immunocompromised models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, where accurate pathogen identification informs mechanistic studies and lead compound assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming rare bacterial agents in infection models, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers assay-ready, validated biological systems with quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides score-based readouts (e.g., MALDI Biotyper classification) that enable objective condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through pathogen validation in disease-relevant systems, only when supported by source material.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable diagnostic capability across multiple rare pathogen projects, reducing redundant validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of false pathogen assignments, and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of pathogen identification across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in antimicrobial programs, capital efficiency via rapid diagnostics, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization of antimicrobial candidates using confirmed pathogen identities in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise for bacterial transfer, matrix overlay, and result interpretation.
- Dependent on MALDI-TOF MS instrumentation with updated taxonomic databases (e.g., Bruker Taxonomy) for accurate spectral matching.
- Necessitates standardized sample preparation protocols to ensure dry matrix and smear, preventing analyzer contamination.
- Requires fallback to 16S rRNA sequencing or biochemical profiling when MALDI-TOF scores fall below 1.700 for non-reliable identification.
- Involves safety protocols for handling hazardous matrix solutions (e.g., formic acid, acetonitrile) under fume hood with PPE.
