Name: Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Apprenez à identifier les bactéries pathogènes rares par spectrométrie de masse MALDI-TOF et séquençage du gène 16S ARNr. Cette méthode rapide améliore le diagnostic microbiologique clinique.

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Les auteurs tiennent à remercier le professeur Enno Jacobs pour son soutien continu.

1. Extraction de l&#39;ADN bactérien <ol><li> Préparation de la solution PBS <ol><li> Peser 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O et 8,80 g de NaCl dans un flacon et remplir avec de l&#39; eau distillée jusqu&#39;à un volume final de 1000 ml. Ajuster le pH à 7,4. Pour utilisation finale filtrer la solution à travers une bactérie résistant (0,22 um) filtre. </li></ol></li><li> Les bactéries d&#39;extraction d&#39;ADN de bactéries à Gram négatif <ol><li> Streak le matériel du patient sur ​​les milieux de culture approprié (par exemple, Columbia gélose au sang), d&#39; identifier et d&#39; isoler les agents pathogènes potentiels. </li><li> Préparer une culture pure et effectuer la coloration de Gram, afin de déterminer morphotype et pour confirmer la pureté et de la culture 49. </li><li> Choisissez une seule colonie bactérienne et le transférer avec un usage unique boucle d&#39;inoculation 1 pi dans un tube de réaction de 2,0 ml stérile qui contient 1 ml de solution PBS. </li><li> Incuber cette suspension dans un thermomixer à 95 ° C pendant 10 min. Après incubation, laisser l&#39;extrait bactérien (contenant l&#39;ADN dissous) refroidir à la température ambiante et soit l&#39; utiliser directement pour l&#39; amplification ou conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure (figure 1a). </li></ol></li><li> Les bactéries d&#39;extraction d&#39;ADN de bactéries à Gram positif <ol><li> Streak le matériel du patient sur ​​les milieux de culture approprié (par exemple, Columbia gélose au sang), d&#39; identifier et d&#39; isoler les agents pathogènes potentiels. Effectuer la coloration de Gram pour confirmer morphotype de la culture. </li><li> Préparer une culture pure et effectuer la coloration de Gram afin de déterminer morphotype et de confirmer la pureté de la culture. </li><li> Choisir une seule colonie bactérienne avec un mélange 1 ul de boucle d&#39;inoculation stérile et en suspension dans 500 ul de solution PBS dans un tube réactionnel de 2,0 ml. </li><li> Ajouter 500 ul de perles de verre et le transfert du tube vers un homogénéisateur oscillant, fonctionnant à une fréquence et une amplitude maximale (50 Hz), pendant 5 min. Utilisez perles de verre de 1,0 mm de diamètrepour perturber les parois cellulaires bactériennes. </li><li> Incuber ce tube pendant 10 min à 95 ° C et laisser refroidir à température ambiante. Utilisez l&#39;extrait soit directement pour la réaction PCR ou conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol></li></ol> 2. ADNr 16S PCR <ol><li> Préparation de Amorces d&#39;amplification <ol><li> Utilisez les amorces TPU1 (5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) comme amorce avant et RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#39;) comme amorce inverse 25. Préparer une solution d&#39;amorce d&#39;actions avec DNAse et RNAse eau libre, ayant une concentration de 100 pmol / pl (100 uM) et diluer davantage à une solution de travail à 10 pmol / ul. Stocker l&#39;amorce stock et la solution de travail à -20 ° C ou utiliser directement. </li></ol></li><li> Préparation du mélange de PCR <ol><li> 1 ul de chaque amorce, 1 ul de dNTP mix (100 mM), 2,5 ul de l&#39;extrait d&#39;ADN, 5 pi de tampon de PCR 10x (contenant 25 mM de MgL&#39; eau libre PCR Cl 2), 0,25 ul Taq polymérase (5 unités / ul) et 39.25 ul DNase et RNase dans un 200 tube de réaction ul stérile. </li></ol></li><li> Protocole de PCR <ol><li> Démarrer le programme de PCR construit de la manière suivante: Tout d&#39;abord, une étape d&#39;incubation initiale à 95 ° C pendant 5 min, ce qui est nécessaire pour activer la Taq-polymérase. En second lieu, 35 cycles d&#39;amplification contenant une 1 min. étape de dénaturation à 95 ° C, à 1 min. l&#39;étape d&#39;hybridation d&#39;amorce à 50 ° C, et une étape d&#39;extension d&#39;amorce de 1,5 min à 72 ° C. Troisièmement, une extension finale de 10 min à 72 ° C. Enfin, la réaction PCR est refroidie à 4 ° C. NOTE: Staphylococcus aureus et H 2 O servent de contrôle positif et négatif (figure 1b). </li><li> Placer le tube contenant le mélange de réaction PCR dans le thermocycleur et démarrer le programme. </li></ol></li><li> La purification du produit PCR NOTE: Afin de purifier le produit de PCR, plusieurs protocoles soitou à base d&#39;enzymes avec une matrice d&#39;adsorption de silice peuvent être utilisées. Le nettoyage PCR en une seule étape utilisée ici utilise deux réactions enzymatiques hydrolytiques. Alors que exonucléase I (Exo I) supprime l&#39;ADN simple brin, de la phosphatase alcaline de crevette (SAP) hydrolyse dNTP non constituées en société. La deuxième procédure est basée sur une technique d&#39;adsorption sur membrane de silice avec un sel élevé de liaison rapide - lavage - cycle d&#39;élution faible teneur en sel. <ol><li> Ajouter 1,5 ul d&#39;un mélange enzymatique contenant à la fois Exo I et SAP au produit PCR de 25 ul, mélanger soigneusement et transférer à un thermocycleur l&#39;application d&#39;un protocole simple de 15 premières minutes à 37 ° C puis 15 min à 80 ° C. Stocker le produit PCR purifié soit à -20 ° C ou l&#39;utiliser directement comme cible pour l&#39;étiquetage de PCR. </li></ol></li></ol> 3. ADN Agarose Gel Electrophoresis <ol><li> Préparation du tampon d&#39;électrophorèse (TBE-tampon) <ol><li> Titrer 54,0 g (445 mM) de base TRIS 27,5 g (445 mM) d&#39;acide borique et 20 ml d&#39;une EDTA 0,5 M (10mM) solution à pH 8,0 avec NaOH dans un flacon et de le remplir avec de l&#39;eau distillée à un volume total de 1000 ml. Ensuite diluer ce tampon 5x 1:10 avec de l&#39;eau distillée (0,5x TBE) pour l&#39;électrophorèse. </li></ol></li><li> Préparation du tampon de chargement <ol><li> Mélanger 250 mg de bleu de bromophénol, 250 mg de xylène - cyanol FF et 15 g de polysaccharose (Matériaux de table) dans un flacon. Ensuite, remplissez-le avec du tampon 0,5x TBE à un volume total de 100 ml. Aliquoter le colorant de charge à 1 ml portions et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Coulée du gel Agarose <ol><li> Peser électrophorèse standard de 6 g d&#39;agarose à 300 ml de tampon 0,5x TBE (voir section 3.1.1) dans un ballon, pour préparer un 2% (p / v) gel d&#39;agarose. Ensuite, mettre le mélange d&#39;agarose dans un four à micro-ondes, chauffer point près d&#39;ébullition jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est complètement dissous et la solution semble claire. </li><li> Laissez-les refroidir suffisamment agarose fondu et ajouter 10 ul d&#39;un 1% (p / v) de bromure d&#39;éthidium actions solution. Verser la solution dans un moule et placer un peigne de gel (permettant 30 puits) dans le casting. Retirer le peigne lorsque le gel est complètement solidifié et mettre le gel dans la chambre d&#39;électrophorèse contenant un tampon 0,5x TBE. NOTE: Le bromure d&#39;éthidium est toxique et mutagène. Par conséquent, il doit être manipulé avec précaution. Il est conseillé d&#39;utiliser des gants en nitrile. Il y a des taches de l&#39;acide nucléique intercalant d&#39;autres qui peuvent être utilisés comme une alternative non toxique. </li></ol></li><li> Electrophorèse sur gel d&#39;agarose des produits de PCR NOTE: Afin de vérifier la bonne taille des amplicons PCR et pour estimer la concentration d&#39;ADN du produit PCR purifié est séparé dans un gel d&#39;agarose. <ol><li> Introduire à la pipette 2 pi de tampon de charge dans un tube de réaction PCR et ajouter 8 ul du produit de PCR. Ce mélange pipeter dans les puits du gel. Ajouter 8 ul d&#39;un marqueur de taille moléculaire en poids (échelle d&#39;ADN) dans un puits séparé pour estimer la taille du produit de PCR. </li><li> Appliquerune tension constante à 10 V / cm et arrêter l&#39;électrophorèse, dès que le marqueur de bleu de bromophénol ait atteint environ les ¾ de la longueur totale du gel. Visualisez les fragments PCR séparés en utilisant un transilluminateur UV (longueur d&#39;onde 302 nm) et les documenter à l&#39;aide d&#39;un système de gel documentation. Estimer la quantité d&#39;ADN par comparaison visuelle avec l&#39;échelle de l&#39;ADN. Consommerait environ 10 ng comme cible pour le marquage par PCR. </li></ol></li></ol> 4. Sanger séquençage <ol><li> Cycle Sequencing PCR REMARQUE: Effectuer l&#39;étiquetage PCR dans une réaction de 10 ul en utilisant un kit commercial (tableau Matériaux). <ol><li> Ajouter 2 ul de mélange maître de réaction 5x, 2 ul de la préparation d&#39;ADN, 1,5 pi de solution ou TPU1 RTU4 de travail (10 pmol / pl) et 4,5 pi de DNAse et de RNAse eau libre. </li><li> Mettez ce mélange réactionnel de séquençage dans un thermocycleur et exécuter un autre PCR. Au total, ce procédé 25 cycles consistant en une étape de dénaturation (96 ° C,10 sec), une étape de recuit (45 à 60 ° C, 5 secondes) et une étape d&#39;extension (60 ° C, 2 min). Enfin, refroidir la réaction à 4 ° C. </li></ol></li><li> Purification de la réaction de séquençage <ol><li> Purifier le mélange de réaction de marquage en utilisant des colonnes de spin commerciales pour la purification PCR (Tableau Matériaux). </li><li> Charge 10 pi de la réaction de séquençage à la matrice de filtration sur gel pré-hydraté et d&#39;effectuer une étape de centrifugation à 750 g pendant 3 min. REMARQUE: Par l&#39;utilisation de cette procédure terminateurs de colorant non incorporés sont retenus dans la matrice de gel. </li><li> Sécher ensuite l&#39;éluat aqueux dans un concentrateur sous vide. Centrifuger à 2500 g pendant 20 à 30 min à 40 ° C pour achever la sécheresse. </li><li> Ajouter 10 ul de formamide fortement désionisée puis dénaturent à 90 ° C pendant 2 minutes et refroidir le mélange sur la glace. Pipette 10 pi des échantillons dénaturés sur une plaque de 96 pi. Stocker le produit PCR séché et nettoyé à -20 ° C si l&#39;analyse està effectuer à un moment ultérieur. </li></ol></li><li> Le séquençage de l&#39;ARNr 16S génique et analyse de la séquence d&#39;ADN REMARQUE: Effectuer une analyse de séquence sur un séquenceur automatisé (tableau des matériaux). Le séquenceur utilisé ici est un système d&#39;électrophorèse capillaire à base de fluorescence automatisé qui analyse les 4 échantillons en même temps (tableau 50 cm 4-capillaire) avec un polymère liquide 67 (figure 1c). <ol><li> Placer la plaque de microtitrage dans le séquenceur. Ecrire une feuille d&#39;échantillon (enregistrement de plaque) comme prévu dans 2, l&#39; enregistrer et démarrer le séquençage run / analyse qui suit les étapes indiquées en 1. NOTE: Durée d&#39;une course de séquence est 2 heures et fournit des données de 800 à 1000 pb. </li><li> Ouvrir le logiciel d&#39;analyse de séquence (tableau Materials). Les données de séquence sont données sous forme de fichier texte (.seq) et un fichier contenant l&#39;électrophorégramme y compris les valeurs de qualité (QV) (.ab1). REMARQUE: Base de l&#39;appel est automatiquement parformé par le logiciel d&#39;analyse de séquence et l&#39;électrophorégramme sous - jacent est contrôlé visuellement (par exemple, la hauteur du pic, la séparation des pics) avant que la séquence soit utilisée pour d&#39; autres applications. </li><li> Comparer le fichier de séquence d&#39;ADN conservé à l&#39;algorithme BLAST base de données NCBI nr en utilisant (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide). </li></ol></li></ol> 5. SM MALDI-TOF NOTE: Le spectromètre de masse utilise un 337 nm N 2 laser et est exploité par un logiciel de commande spécifique (tableau des matériaux). Les spectres sont enregistrés en mode linéaire et une gamme de masse entre 2.000 à 20.000 Da est couvert. L&#39; interprétation des données et la répartition des scores aux échantillons est effectuée en temps réel par un logiciel d&#39;analyse (tableau des matériaux) (Figure 1d). <ol><li> Préparation des bactéries pour MALDI-TOF MS <ol><li> Cultiver les bactéries d&#39;intérêt (par exemple, Myroides odoratimimus) sur Columbia gélose au sang contenant 5% de sang de cheval à 37 ° C pendant 18 à 24 heures, en fonction de la souche bactérienne (figure 2a). Effectuer la coloration de Gram pour vérifier l&#39;morphotype de l&#39;organisme sous enquête, ainsi que la pureté de la culture. </li><li> Utilisez un cure - dent en bois pour le transfert d&#39; une seule colonie bactérienne à un puits de 96 puits cible en acier (Figure 2b et 2c). Spot 1 pi d&#39;acide formique à 70% au-dessus de l&#39;organisme séché à l&#39;air sur la cible en acier et laisser sécher pendant environ 2-3 min. </li><li> Ensuite, recouvrir la tache avec une solution de matrice 1 ul, contenant 50 mg / ml CHCA (acide α-cyano-4-hydroxycinnamique) dans un solvant organique (50% d&#39;acétonitrile, l&#39; acide trifluoroacétique à 2,5%, 47,5% de H 2 O). NOTE: La méthode de superposition acide (sur la méthode de préparation des plaques) peut être utilisé pour améliorer la qualité des spectres de masse. Il a été démontré que les bactéries Gram-positives comme une «attaque acide» va augmenter le scoreLues des spectres mesurés 45. NOTE: En variante , un système de préparation automatisée d&#39;échantillons (tableau des matériaux) peut être utilisé dans lequel un contact libre des taches de 1 ul de 70% d&#39; une solution d&#39;acide formique et, après un premier cycle de séchage, la solution de matrice 1 ul sont appliqués sur le frottis bactérien. Les échantillons sont ensuite séchés dans des conditions normalisées à 60% d&#39;humidité relative et sont prêts à l&#39;emploi pour l&#39;analyse. </li><li> Laissez le frottis avec la matrice recouverte d&#39;air sec à nouveau pendant environ 5 min dans une hotte. Ce frottis bactérien avec la matrice appliquée est maintenant stable pendant de nombreuses heures. NOTE: frottis bactériens sans matrice peuvent ne pas être stable en raison de la dégradation des protéines. </li></ol></li><li> Exécution de la MS Analyse MALDI-TOF <ol><li> Introduction d&#39;échantillons <ol><li> Ouvrez le logiciel de contrôle de nos MMIS (tableau Matériaux). </li><li> Aérer le port de chargement d&#39;échantillon du spectromètre de masse en appuyant sur la touche IN / OUT de l&#39;instrument. </li><li> Ouvrez le port de chargement après un clic et insérer la plaque cible MALDI-TOF MS avec le frottis bactérien séché ainsi que la matrice. </li><li> Fermez le port et évacuer à nouveau. Observez vide et quand il atteint 4,5 x 10 -6 mbar démarrer la mesure. </li></ol></li><li> Analyse des échantillons <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;analyse de nos MMIS (Matériaux Table) et cliquez sur le menu &quot;Fichier&quot;. Sélectionnez &quot;Nouvelle classification&quot; et un nouveau &quot;assistant de classification en temps réel MALDI Biotyper&quot; fenêtre ouvre. Tapez le nom du projet, par exemple les &quot;mesure de Myroides projet_1, dans le champ&quot; Nom du projet &quot;et appuyez sur le bouton&quot; Nouveau &quot;. Dans le cadre de la nouvelle boîte de dialogue nommé&quot; Nouveau projet &quot;vérification du nom du projet et procéder en appuyant sur le bouton&quot; OK &quot;. </li><li> Dans le «Assistant de classification Biotyper MALDI en temps réel&quot; observer la fenêtre &quot;placement Analyte&quot; ouvert. Sélectionnez les positions cibles (par exemple, A1, A2, A3 ...), droit-click toute position sélectionnée (indiquée par un carré bleu) et sélectionnez &quot;Ajouter des échantillons&quot;. Dans le tableau ouvert automatiquement le type d&#39;affichage de nom échantillon, ID d&#39;échantillon et éventuellement un commentaire. Cliquez sur le bouton &quot;Suivant&quot; pour continuer. </li><li> Dans le «Assistant de classification Biotyper MALDI en temps réel&quot; observer la &quot;Sélection de MALDI méthodes de Biotyper&quot; fenêtre ouverte. Sélectionnez &quot;Bruker Taxonomie&quot; de &quot;MSPs des arbres taxonomiques&quot; et cliquez sur &quot;Suivant&quot; pour continuer. </li><li> Dans le «Assistant de classification Biotyper MALDI en temps réel&quot; observer la fenêtre &quot;Résumé du projet&quot; ouvert. Vérifiez les entrées insérées données ci-dessus pour le projet de classification réelle. Lancer la classification exécuter en appuyant sur ​​le bouton &quot;Terminer&quot; (Figure 2d - f). La mesure commence automatiquement lorsque le vide approprié est atteint. </li><li> Suivez la course de classement jusqu&#39;à ce que la mesure est terminée avec succès. Voir le tableau des résultats en til «MALDI Biotyper Realtime Myroides Classification projet de mesure projet_1&quot; ouvrir le menu &quot;Affichage&quot; et cliquez sur &quot;Résultats&quot;. </li><li> Voir les &quot;Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classification Résultats&quot; en tant que fichier HTML dans le navigateur web par défaut. Imprimer et enregistrer les résultats. </li></ol></li><li> Mesurer une norme quotidienne avant de test pour l&#39;analyse échantillonner pour calibrer l&#39;instrument et effectuer instrument validation hebdomadaire (instrument d&#39;auto-test). NOTE: Pendant les spectres MALDI-TOF mesure sont analysés en temps réel par le logiciel d&#39;analyse (tableau des matériaux). Une liste des dix espèces avec leurs scores respectifs est donné et est introduit dans le système d&#39;information de laboratoire (LIS) pour le reporting. </li><li> Évaluer de façon critique les résultats MALDI-TOF MS (voir des résultats représentatifs) et, le cas échéant, inclure d&#39;autres tests, tels que les profils biochemical- et antibiotiques susceptibilité ou le séquençage des gènes ARNr 16S et, si nécessaire, coloration de Gram pourattribuant une espèce bactérienne au rapport microbiologique. </li></ol></li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Deux MALDI-TOF et le séquençage du gène de l&#39;ARNr 16S offrent la possibilité d&#39;identifier un grand nombre de bactéries différentes. MALDI-TOF MS est une méthode rapide et peu coûteuse, qui est facile à manipuler et de grandes bases de données de spectres de masse bactérienne sont disponibles. Pour cette raison, MALDI-TOF MS est un coût moyen rapide, efficace et fiable pour mener des études de dépistage axés sur les bactéries pathogènes rares 17,20,39,51. Dans une étude prospective comparant MALDI-TOF ...

Identification sécurisée des agents pathogènes rares dans le diagnostic de routine est entravée par le fait que les méthodes culturales et biochimiques classiques sont encombrants et parfois discutable. En outre, un laboratoire de microbiologie diagnostique doit traiter un grand nombre d&#39;agents pathogènes, allant de quelques centaines à plusieurs milliers par jour, ce qui nécessite l&#39;utilisation de systèmes automatisés. En plus de la gestion d&#39;un débit journalier élevé, l&#39;identification précise des espèces bactériennes est nécessaire. Cela est justifié car ils diffèrent dans leur modèle de sensibilité aux antimicrobiens et l&#39; identification correcte fournit donc le clinicien des informations essentielles pour choisir les antibiotiques appropriés (par exemple, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43. systèmes d&#39;identification microbienne automatisée (MUAS) appliquent un ensemble normalisé de réactions enzymatiques pour caractériser les propriétés métaboliques des isolats bactériens <sup&gt; 13,15,16,26,27. Bien que les cartouches utilisées dans ces systèmes utilisent un grand nombre de différentes réactions biochimiques, par exemple, 47 dans la carte GN du MUAS utilisé dans cette étude 52, ce permis de stratégie identification sécurisée seulement pour un ensemble limité de bactéries. En outre, la base de données, un système expert avancé, est clairement axé sur la détection de bactéries pertinentes et hautement pertinentes d&#39;importance médicale 13,15,16,36. Deux autres systèmes, largement utilisés dans les laboratoires, appliquent également cette approche biochimique pour l&#39;identification bactérienne. Des études récentes démontrent une précision d&#39;identification comparable entre les MUAS utilisés dans cette étude et l&#39; un des concurrents (93,7% et 93,0% respectivement), tandis que le 3 ème MUAS a une précision d&#39;identification de seulement 82,4% sur les espèces de niveau 35. Ces écarts peuvent être expliqués par la qualité des références de données d&#39;identification sous-jacentes, les versions de kits et de logiciels, les différences de metabolisme et la compétence du personnel technique 35,36. Deux systèmes automatisés MALDI-TOF MS (MALDI-TOF système d&#39;identification microbienne, IHMs) sont principalement utilisés. Ces systèmes permettent la détection d&#39;un grand nombre d&#39;espèces bactériennes en fonction de leurs spectres de masse des protéines d&#39;empreintes digitales. Par exemple, la base de données des IHMs utilisées contient des spectres de référence 6000. Les systèmes d&#39;identification basés sur la spectrométrie de masse offrent une détection rapide et fiable d&#39;une grande variété de micro - organismes , y compris les agents pathogènes rares 11,48,51. À ce jour , seulement quelques comparaisons directes sont disponibles entre les IHMs utilisés dans cette étude et son concurrent 19,33. Selon Daek et al. Les deux systèmes offrent un taux de précision de l&#39; identification similaire élevé, mais les IHMs utilisés dans cette étude semble être plus fiable dans l&#39; identification des espèces 19. gènes distincts De même, les techniques moléculaires adressage bien conservées mais aussi ( <em&gt; par exemple, ADNr 16S ou rpoB) permettent une identification claire des espèces 3,22,61. Parmi ceux - ci, l&#39;ADNr 16S est le gène le plus largement utilisé de ménage en raison de sa présence dans toutes les bactéries 34. Sa fonction reste inchangée et , finalement, avec environ 1 500 pb, il est assez long pour être adapté à la bio-informatique 14,34. De nombreux chercheurs considèrent ARNr 16S analyse génétique comme «étalon-or» pour l&#39; identification bactérienne 21. Cela est dû au fait que quelques laboratoires utilisent des techniques d&#39;hybridation ADN-ADN à ce jour pour l&#39; identification des rares ou nouvelles bactéries 14,34. En outre, de plus en plus des bases de données sont disponibles qui peuvent être utilisés pour l&#39; analyse de l&#39; ARNr 16S des gènes 50. Cependant, il doit être pris en compte que les systèmes de détection basés sur l&#39;ADNr 16S ont une sensibilité limitée par rapport aux protocoles de PCR standard. En outre, l&#39;approche moléculaire est sophistiquée, du temps et nécessite un personnel hautement qualifié, ainsi queinstallations de laboratoire dédiées et est, par conséquent, pas facilement mis en œuvre dans le diagnostic de routine 55. En outre, il a été montré que la combinaison d&#39;au moins deux procédés différents d&#39;identification des bactéries conduit à l&#39;identification des souches très précis. La combinaison de séquençage MALDI-TOF MS et ADNr 16S permet d&#39;identifier un grand nombre de différentes espèces bactériennes avec une grande précision. Récemment , la combinaison de l&#39; analyse du gène MALDI-TOF MS et ARNr 16S a été présenté pour l&#39; identification bactérienne étudier les questions épidémiologiques et des agents pathogènes rares 56.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, eau de qualité HPLC, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml ; nchen, Allemagne</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Lyser de tissus LT</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>85600</td><td>Homogénéisateur oscillant</td></tr><tr><td>Billes de verre 1,0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Allemagne</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixeur 5436</td><td>Eppendorf, Hambourg, Allemagne</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit (1,000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Amorce Forward TPU1 (5&acute ;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, Ulm, Allemagne&nbsp ;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Amorce inversée RTU4 (5&acute ;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&acute ;)</td><td>biomers.net, Ulm, Allemagne&nbsp ;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler&nbsp ;</td><td>Eppendorf, Hambourg, Allemagne</td><td>-&nbsp ;</td><td>Thermocylcer</td></tr><tr><td>Tube à réaction 1,5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>72,692</td><td></td></tr><tr><td>Tube à réaction 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>72,693,005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Allemagne</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Allemagne</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp ;</td><td>Sharp Electronics, Hambourg,</td><td></td> <td>Allemagne-Micro-ondes</td></tr><tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-sel déshydraté ; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Allemagne</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 à 1 000 pb</td><td>Eurogentec, L&uuml ; ttich, Belgique</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml ; nchen, Allemagne</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xylène cyanol FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml ; nchen, Allemagne</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp ;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Allemagne-Solution</td><td></td></tr> <tr><td>de bromure d’éthidium 1 % (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml ; nchen,</td><td></td> <td>Allemagne-Gel-documentation system&nbsp ;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 réactions)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Royaume-Uni</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer (10x) avec EDTA&nbsp ;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di formamide (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analyseur génétique</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>-</td><td>Séquenceur</td></tr><tr><td>MicroAmp Plaque de réaction optique 96 puits avec code-barres</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur génétique 3130, base de plaque 96 puits</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur génétique 3130, retenue de plaque 96 puits</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur génétique 3130, puits Septa à plaques</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur génétique 3130, polymère POP-7, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analyseur génétique, réseau de 4 capillaires, 50 cm</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de séquençage 5.4</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Allemagne</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Brême,</td> <td>Allemagne-Notre</td> <td>mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute ; rieux, N&uuml ; rtingen, Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Brême,</td> <td>Allemagne-Logiciel</td> <td>de contrôle de l’appareil</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Brême,</td> <td>Allemagne-Logiciel</td> <td>d’analyse</td></tr><tr><td>&alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1&nbsp ; g</td><td>Bruker Daltonik, Brême, Allemagne</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Étalon d’étalonnage des peptides II</td><td>Bruker Daltonik, Brême, Allemagne</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 cible acier poli</td><td>Bruker Daltonik, Brême, Allemagne</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp ;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxy&nbsp ;</td><td>Bruker Daltonik, Brême, Allemagne</td><td>Réf. 1836007</td><td>Système automatisé de préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>Vitek 2&nbsp ;</td><td>bioM&eacute ; rieux, N&uuml ; rtingen, Allemagne&nbsp ;</td><td></td><td>Notre</td></tr><tr><td>aMIS MicroScan&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Allemagne</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade ; Système de microbiologie automatisé</td><td>BD, Heidelberg, Allemagne</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><<tr><td>i>Staphylococcus aureus&nbsp ;subsp.&nbsp ; aureus&nbsp ; Rosenbach (ATCC&reg ; &nbsp ; 25923&commerce ;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France</td><td></td><td>Contrôle positif pour la PCR&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

identification des bactéries pathogènes rares par 16s arnr gene séquençage et maldi-tof ms

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Il y a un certain nombre d&#39;agents pathogènes bactériens rares et, par conséquent, décrit insuffisamment qui sont signalés à causer des infections graves en particulier chez les patients immunodéprimés. Dans la plupart des cas, seules quelques données, pour la plupart publiées sous forme de rapports de cas, sont disponibles qui enquête sur le rôle de ces agents pathogènes comme un agent infectieux. Par conséquent, afin de clarifier le caractère pathogène de ces micro-organismes, il est nécessaire de mener des études épidémiologiques qui comprennent un grand nombre de ces bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude de surveillance doivent répondre aux critères suivants: l&#39;identification des souches doit être précise selon la nomenclature en cours de validité, ils devraient être faciles à manipuler (robustesse), économique dans le diagnostic de routine et ils doivent générer comparables les résultats entre les différents laboratoires. En général, il existe trois stratégies pour identifier des souches bactériennes dans un cadre de routine: 1) l&#39;identification phénotypique caractérisant le Biochemical et métaboliques propriétés des bactéries, 2) les techniques moléculaires telles que le séquençage du gène ARNr 16S et 3) la spectrométrie de masse comme une approche basée roman protéome. Etant donné que la spectrométrie de masse et les approches moléculaires sont les outils les plus prometteurs pour l&#39;identification d&#39;une grande variété d&#39;espèces bactériennes, ces deux méthodes sont décrites. Les progrès, les limites et les problèmes potentiels lors de l&#39;utilisation de ces techniques sont discutées.

MALDI-TOF MS est une nouvelle méthode rapide et peu coûteuse pour le diagnostic de routine microbiologiques. Bactérienne identification des espèces par MALDI-TOF MS produit des spectres principalement composé de protéines ribosomiques , mais aussi d&#39; autres &quot;protéines très conservées avec des fonctions internes de maintien affectés dans une mesure minimale par les conditions environnementales&quot; 17 base de données .La de cette MMIS contient un grand nombre de spect...

La spectrométrie de masse à temps de vol laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) et les techniques moléculaires (séquençage du gène de l’ARNr 16S) permettent d’identifier des pathogènes bactériens rares dans les diagnostics de routine. L’objectif de ce protocole réside dans la combinaison des deux techniques qui permet d’obtenir des données plus précises et plus fiables.

Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

L'objectif général de ce protocole de spectrométrie de masse MALDI-TOF est d'améliorer le typage des agents pathogènes rares grâce à une procédure rapide et économique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la microbiologie diagnostique, en permettant une identification rapide de bactéries pathogènes rares. Aujourd'hui, nous allons parler d'odoratimimus et des bactéries du genre Myroides.Pour démontrer la méthode et discuter de l'interprétation des résultats. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car le transfert de bactéries, la superposition avec des matrices et l'interprétation des résultats exigent des compétences techniques et une expertise en microbiologie. Nous avons eu pour la première fois l'idée d'utiliser la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour dépister des bactéries rares lorsque nous avons eu un patient dans notre hôpital souffrant d'une infection du pied diabétique provoquée par Myroides odoratimus.Commencez ce protocole par l'extraction de l'ADN bactérien, la PCR de l'ADN ribosomique 16S et le séquençage de Sanger, comme décrit dans le protocole écrit. Utilisez un cure-dent en bois pour transférer une colonie bactérienne unique dans un puits d'une plaque cible en acier à 96 puits. Déposez un microlitre d'acide formique à 70 % sur l'organisme séché à l'air sur la cible en acier, puis laissez sécher environ deux à trois minutes.Couvrez la tache avec un microlitre de solution matricielle contenant 50 mg/ml de CHCA dans un solvant organique composé de 50 % d'acétonitrile, 2,5 % d'acide trifluoroacétique et 47,5 % d'eau. Laissez sécher à l'air la tache et la matrice déposée pendant environ cinq minutes dans une hotte. Pour introduire les échantillons, purgez le port de chargement des échantillons du spectromètre de masse en appuyant sur le bouton entrée/sortie de l'appareil.Ouvrez le port de chargement et insérez la plaque cible du spectromètre de masse MALDI-TOF MS contenant le frottis bactérien séché avec la matrice. Fermez le port et faites à nouveau le vide. Surveillez la pression et, lorsque celle-ci atteint 4,5 millions de millibar, démarrez la mesure.Ouvrez le logiciel d'analyse MMIS et cliquez sur le menu Fichier. Sélectionnez Nouvelle classification, une nouvelle fenêtre intitulée Assistant de classification en temps réel MALDI Biotyper s'ouvrira alors. Saisissez le nom du projet dans le champ Nom du projet, puis cliquez sur Nouveau. Dans la nouvelle boîte de dialogue nommée Nouveau projet, vérifiez le nom du projet et poursuivez en cliquant sur le bouton OK.Dans l'Assistant de classification en temps réel du MALDI Biotyper, observez la fenêtre de placement de l'analyte. Sélectionnez les positions cibles, cliquez avec le bouton droit sur une position sélectionnée et choisissez Ajouter des échantillons. Dans la vue de tableau ouverte automatiquement, saisissez le nom de l'échantillon, l'identifiant de l'échantillon et, éventuellement, un commentaire.Cliquez sur le bouton Suivant pour continuer. Ensuite, observez la fenêtre de sélection des méthodes MALDI Biotyper. Sélectionnez Bruker Taxonomy dans les MSP provenant des arbres taxonomiques, puis cliquez sur Suivant pour poursuivre.Ensuite, observez la fenêtre de résumé du projet. Vérifiez les entrées insérées indiquées ci-dessus pour le projet de classification actuel. Lancez l'exécution de la classification en cliquant sur le bouton « Terminer ».Les mesures démarrent automatiquement lorsque le vide approprié est atteint. Suivez l'analyse de classification jusqu'à ce que la mesure soit terminée avec succès. Une fois la mesure terminée, ouvrez le menu « View » et cliquez sur « Results » pour afficher le tableau des résultats dans le projet MALDI Biotyper Real Time Classification Project One.Visualisez les résultats de classification du MALDI Biotyper de Bruker-Daltonik sous forme de fichier html dans le navigateur web par défaut. Imprimez et enregistrez les résultats. Les spectres présentés ici ont été obtenus par spectrométrie de masse MALDI-TOF et sont mesurés et classifiés en temps réel.Les spectres se voient attribuer un nom d'espèce et une valeur de score reflétant la qualité de la mesure. Des scores supérieurs à 2,300 indiquent une identification d'espèce hautement probable. Un score compris entre 2,000 et 2,300 indique une identification d'espèce fiable.Un score inférieur à 1,700 et 2,000 indique une identification probable de l'espèce. Un score inférieur à 1,700 est non fiable. L'identification de pathogènes bactériens cultivés en culture pure sur un milieu solide prend deux à trois minutes.Il est important de rappeler que les agents pathogènes bactériens rares ne peuvent être détectés par spectrométrie de masse MALDI-TOF que si les instruments contiennent de manière fiable les spectres appropriés. Dans le cas contraire, il est nécessaire de les intégrer en incorporant des spectres MaSDA provenant de souches typées de leurs isolats caractérisés. Lorsque les résultats du score ne permettent pas une identification formelle de la souche, des méthodes complémentaires, telles que le profilage biochimique ou le séquençage de l’ADNr 16S, peuvent être appliquées.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la détection bactérienne, elle peut également être appliquée à d'autres microorganismes tels que les champignons ou les anaérobies. En outre, on peut mesurer la résistance bactérienne. N'oubliez pas de travailler avec une matrice qui est une substance dangereuse : portez des gants, des lunettes de protection et travaillez sous une hotte.En outre, il est absolument nécessaire de sécher complètement la matrice et de bien l'étaler afin d'éviter les projections dans la chambre d'analyse.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

L'application de laser désorption / ionisation de temps assistée par matrice de vol (MALDI-TOF), la spectrométrie de masse (MS) directement à un bouillon de culture de sang accélère l'identification de bactéries. La méthode présentée est une méthode rapide et fiable pour l'identification des bactéries à Gram négatif directement à partir de bouillon de culture de sang.

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

Ce travail détaille les procédures d’identification rapide des bactéries à l’aide de MALDI-TOF MS. Les procédures d’identification comprennent l’acquisition du spectre, la construction de bases de données et les analyses de suivi. Deux méthodes d’identification, basées sur les coefficients de similarité et les méthodes basées sur les biomarqueurs, sont présentées.

L&#39;utilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA)

Mass phyloproteomics la spectrométrie (MSPP) a été utilisé pour taper une collection de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolats au niveau de la souche par rapport à multilocus sequence typing (MLST).

typage de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Les isolats utilisant PhyloProteomics basés sur la spectrométrie de masse (MSPP)

Ce manuscrit décrit un protocole normalisé détaillé du séquençage de haut débit 16 s rRNA-amplicon. Le protocole introduit un protocole intégré, en uniforme, possible et peu coûteux à partir de prélèvement d’échantillons fécaux au moyen d’analyses de données. Ce protocole permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons contenant des normes rigoureuses et plusieurs contrôles.

Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage

IDBac est un pipeline bioinformatique à base de spectrométrie de masse open source qui intègre des données provenant à la fois de protéines intactes et de spectres de métabolites spécialisés, recueillis sur des matériaux cellulaires extraits de colonies bactériennes. Le pipeline permet aux chercheurs d'organiser rapidement des centaines à des milliers de colonies bactériennes en groupes taxonomiques putatifs, et de les différencier davantage en fonction de la production spécialisée de...

Utilisation du pipeline Open-Source MALDI TOF-MS IDBac pour l'analyse des protéines microbiennes et des données spécialisées sur les métabolites

Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

Nous présentons ici un protocole pour l’identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l’analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l’effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l’identification des protéines.

Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

Ce protocole permet une évaluation rapide et rentable de la composition microbienne des produits laitiers en combinant la culturomique avec la SM MALDI-TOF. Il fournit des résultats de taxonomie comparables au séquençage de l’ARNr 16S avec un délai d’exécution plus court que les méthodes de culture traditionnelles.

Évaluation de l’innocuité microbienne des laiteries à l’aide du profilage protéomique bactérien via l’approche MALDI

Une méthode simple pour l'identification de pathogènes bactériens priorité est d'utiliser le phage journaliste génétiquement modifiés. Ces phages journaliste, qui sont spécifiques à leur espèce hôte particulier, sont capables de transduire rapidement une réponse de signal bioluminescent aux cellules hôtes. Nous décrivons ici l'utilisation de phages journaliste pour la détection...

Phage »Bioluminescent&quot; Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

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L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Apprenez à identifier les bactéries pathogènes rares par spectrométrie de masse MALDI-TOF et séquençage du gène 16S ARNr. Cette méthode rapide améliore le diagnostic microbiologique clinique.

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