Name: Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez la détection de molécules uniques sans marquage en utilisant la technologie FLOWER à résonateur optique. Cette méthode avancée permet d'étudier le repliement des protéines et la cinétique de liaison en biochimie.

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Cette recherche a été financée en partie par un National Research Service Award (T32GM07616) de l’Institut national des sciences médicales générales.

1. installation expérimentale et la préparation d&#39;échantillons <ol><li> Fabriquer microtoroids utilisant la lithographie, la gravure, et la fonte de la procédure comme décrit précédemment 6. Fabriquer microtoroids sur le dessus d&#39;une plaquette de silicium (puce) qui ont typiquement un diamètre majeur de 80 à 100 um, et un diamètre mineur de 2 um. </li><li> Se détendre à peu près un mètre de fibre optique monomode (125 um gaine, 4,3 um de diamètre de champ de mode) de sa bobine de fibre. </li><li> Au milieu de la partie déroulée de la fibre optique, la bande un petit segment (2,5 cm) de la couche de polymère autour de la fibre optique en utilisant une pince à dénuder. Note: Ceci est la partie de la fibre optique qui sera utilisé pour coupler la lumière évanescente dans le microtoroid. </li><li> Nettoyez la fibre dénudée avec de l&#39;alcool de l&#39;isopropanol et un non pelucheux lingette. </li><li> Maintenez cette partie de la fibre en place à l&#39;aide d&#39;un support de fibre fait de pinces magnétiques. </li><li> Diluer la fibre dénudée à ~ 500 nm par melting et en tirant à l&#39;aide d&#39;un chalumeau à hydrogène et moteurs pas à pas deux mobiles dans des directions opposées à 60 um / min. Placez la fibre optique à l&#39;intérieur de la partie supérieure de la flamme, qui devrait être ~ 10 mm de hauteur. Arrêter tirant sur la fibre lorsque la transmission à travers la fibre arrête fluctuant, qui peut être surveillée soit visuellement (en regardant la lumière qui est diffusée latéralement à partir du clignotement de fibres sur et en dehors) ou en connectant la fibre à une photodiode qui est fixé à un oscilloscope . </li><li> Cliver une extrémité de la fibre optique et l&#39;insérer dans un adaptateur de fibre nue. Placer cette extrémité de la fibre à l&#39;entrée du photo-récepteur. </li><li> Fibre coupler l&#39;autre extrémité de la bobine de fibre à l&#39;aide d&#39;un laser par le coupleur de fibre optique. </li><li> Placez la puce microtoroid sur un porte-échantillon (acier inoxydable, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) en utilisant soit époxy ou ruban adhésif double face. </li><li> Monter le porte-échantillon sur une platine de positionnement qui se compose d&#39;une nano 3 axes de positionnement (nanocube) stade (voir la liste d&#39;équipement) sur le dessus d&#39;un micromètre à 3 axes. Effectuer toutes les expériences sur une table optique pneumatique isolé pour minimiser les vibrations. </li><li> Position grossière de la puce de l&#39;échantillon en utilisant le micromètre à 3 axes. </li><li> Alignez les contenant microtoroid puce parallèle à la fibre optique en utilisant la nano-positionneur. Remarque: Aligner le microtoroid à une distance d&#39;une longueur d&#39;onde de la lumière d&#39;entrée (~ 633 nm). Pour la visualisation de ce processus utiliser deux colonnes d&#39;imagerie (tube avec objectif et la caméra objective, voir la liste de l&#39;équipement) positionnée sur le dessus et sur le côté de la puce. </li><li> Optimiser la polarisation de la lumière laser dirigé à travers la fibre optique en utilisant un contrôleur en ligne de polarisation (voir la liste d&#39;équipement) avec un bouton pour ajuster la polarisation. Remarque: la polarisation optimale est obtenue lorsque l&#39;inclinaison mesurée dans la transmission de la fibre optique apparaît le plus étroit. Observez cette trempette sur un oscilloscope (voir l&#39;étape 2.2 pour plus de détails). </li><li> Constructionune chambre d&#39;échantillon par epoxying une lamelle de verre sur la platine porte-échantillon en utilisant une lame de microscope en verre comme un écarteur. Remarque: Un boîtier en plexiglas couvrant l&#39;ensemble de la configuration peut être utile pour minimiser les courants d&#39;air. Une petite ouverture devrait être laissée à la solution pour permettre à pomper à l&#39;aide de tubes. </li><li> Équilibrer thermiquement suspensions de particules ou de solutions aqueuses d&#39;une seule molécule ≥ 1 heure dans un bain d&#39;eau RT (~ 500 ml). Note: Les échantillons sont dilués à la concentration désirée dans des microtubes en utilisant les tampons associés spécifiées par le fabricant, par exemple, PBS ou HEPES. Si aucun événement de liaison est détecté, augmenter la concentration en sel du tampon. </li><li> Vortex particule de solutions contenant (1 ml) pendant environ 2 brièvement sec. </li><li> Injecter des solutions contenant des particules dans la chambre d&#39;échantillon à 1 ml / min en utilisant une pompe à seringue de 1 ml. </li><li> Après la chambre de l&#39;échantillon a rempli, éteignez la pompe seringue. </li><li> Attendre 30 secondes avant que les données d&#39;enregistrement afin de minimiserles effets des vibrations mécaniques résultant de l&#39;écoulement de fluide qui peuvent affecter la mesure. </li></ol> 2. Serrure de fréquence <ol><li> Re-coupler le tore à la fibre optique par déplacement du porte-échantillon avec la nanopositionneur, parce que le couplage sera perturbé en raison de l&#39;injection de fluide. </li><li> Localiser la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid par le balayage laser d&#39;entrée commandé par ordinateur par le biais d&#39;une variété de longueurs d&#39;onde. Effectuer cette opération par l&#39;envoi d&#39;un signal de tension de forme d&#39;onde triangulaire à un élément piézo-électrique à l&#39;intérieur de l&#39;unité de commande laser qui régule la longueur d&#39;onde du laser. Effectuer des expériences en utilisant la lumière visible (635 nm ± 2,5 nm) car il est faible absorption de la lumière dans l&#39;eau à cette longueur d&#39;onde. </li><li> Mesure de la transmission de la lumière à travers la fibre optique en branchant la sortie de la fibre optique en un photorécepteur auto-équilibré. Branchez la sortie du photorécepteur en un oscilloscope à l&#39;aide d&#39;un câble BNC. Observer on l&#39;oscilloscope que la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid, la transmission à travers la fibre optique diminue. </li><li> Fixez la sortie du photorécepteur à l&#39;entrée principale du blocage contrôleur de rétroaction (voir la liste d&#39;équipement) via un câble fréquence. </li><li> Exécutez le contrôleur de rétroaction de verrouillage de fréquence en mode de verrouillage automatique à l&#39;aide de verrouillage avec une fréquence de vibration de 2 kHz et une amplitude de l&#39;oscillation de longueur d&#39;onde 19 fm pic haut de. Empiriquement définir les paramètres proportionnelle intégrale dérivés dans la fenêtre du logiciel en utilisant les règles de réglage de Ziegler-Nichols 14. Remarque: Ces valeurs doivent seulement être réglé une fois au début de toutes les expériences. </li><li> Auto-verrouiller la longueur d&#39;onde du laser à la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid. Effectuez cette étape après remplissage de la chambre d&#39;échantillon. Remarque: Si le changement de longueur d&#39;onde est trop grand, alors le contrôleur de rétroaction perdra serrure et passe automatiquement en mode de balayage afin de localiser l&#39;emplacement de longueur d&#39;onde de résonance. Cette occurs pour décale longueur d&#39;onde supérieure à environ une largeur de raie (au moins 600 FM pour tous les systèmes étudiés ici). </li><li> Enregistrez la sortie du contrôleur de rétroaction à 20 kHz en utilisant une carte d&#39;acquisition de données 24 bits. Exporter les données dans un fichier texte via le logiciel d&#39;acquisition de données. </li></ol> 3. Traitement des données et de l&#39;analyse <ol><li> Transformée de Fourier les données dans MATLAB. </li><li> Passe-bas les données à l&#39;aide d&#39;un &quot;mur de briques&quot; filtre avec une coupure à 1 kHz pour éliminer la fréquence de vibration imposée de 2 kHz (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 1). </li><li> Encoche calcul de filtrer les données en utilisant une taille de fenêtre de 16 Hz. Note: Ceci est fait pour éliminer les sources connues de bruit, dans ce cas, 60 Hz bruit de ligne électronique et ses harmoniques, ainsi 100 Hz (en venant du pilote laser) et ses harmoniques (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 1). </li><li> Transformée de Fourier inverse les données dans le domaine temporel. </li><li> Filtre médian les données en utilisant une fenêtretaille de 1001 échantillons (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 2). </li><li> Repérez des changements progressifs dans la longueur d&#39;onde de résonance à l&#39;aide de l&#39;algorithme de recherche de l&#39;étape-Kerssemakers et al. 15. </li><li> Générer des histogrammes de l&#39;amplitude de chaque étape de liaison. </li><li> Calculer la taille des particules en utilisant l&#39;équation. (1) (voir la discussion). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Comme une particule se lie, la longueur d&#39;onde de résonance (λ) du tore augmente. Si une particule délie, la longueur d&#39;onde de résonance diminue en conséquence (un événement step-down). Le diamètre des particules (d) peut être déterminée par des histogrammes de l&#39;amplitude de chaque étape de longueurs d&#39;onde. La hauteur de chaque étape de la longueur d&#39;onde varie en raison de variations de la taille des particules lié et en raison de l&#39;emplacement sur le microtoroid où...

Des expériences simples de détection moléculaires sont utiles pour réduire la quantité d&#39;analyte utilisé dans des biocapteurs pour la détection précoce de la maladie, et pour examiner les propriétés fondamentales des molécules 3. Ces expériences sont généralement effectuées en utilisant des étiquettes, cependant, étiquettes ne sont pas toujours possible d&#39;obtenir pour une protéine particulière, augmenter le coût, peut perturber les événements à l&#39;étude, et peut être gênant, en particulier pour le temps réel sur le site des expériences ou point de service diagnostics de soins. L&#39;étalon-or actuel biocapteurs sans étiquette est la résonance plasmonique de surface 4, mais les systèmes de résonance de plasmon de surface commerciale ont généralement une limite inférieure de détection typique de l&#39;ordre de nM. Récemment, résonateurs optiques ont émergé comme une technologie prometteuse pour sans étiquette seule molécule biodétection 5. Résonateurs optiques travail basée sur le long terme (NS) confinement de la lumière 6,7. La lumière est évanescentecouplé dans ces dispositifs typiquement via une fibre optique. Lorsque la longueur d&#39;onde de la lumière passant par la fibre correspond à la longueur d&#39;onde de résonance du résonateur, la lumière efficacement couplé au résonateur. Ceci reflète la lumière couplée intérieurement totalement à l&#39;intérieur de la cavité du résonateur à générer un champ évanescent dans le voisinage de la périphérie du résonateur. Comme particules entrent dans le champ évanescent et se lient au résonateur, la longueur d&#39;onde de résonance des changements de résonateur en proportion du volume de la particule 8. En termes de capacité de détection, résonateurs microsphères ont précédemment été utilisé pour détecter la grippe A seule particules de virus (100 nm) 9,10. Récemment, résonateurs optiques microsphères plasmonically améliorée ont été utilisées pour détecter seul sérum albumine bovine molécules oligonucléotides 11 et 8-mères 12, mais cette approche limite la zone de capture des particules à 0,3 um 2 par device. Grandes biocapteurs de la zone de capture sont idéales pour maximiser les chances de détection de particules. Les technologies actuelles à base de solution sans étiquette biocapteurs avec de grandes (&gt; 100 um 2) zones de capture ont été limitées à la détection de particules de polystyrène ≥ 25 nm. Nous avons développé un système de biocapteur sans étiquette basée sur la technologie de résonateur optique connu sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) 13 (Figure 1) qui est capable de détecter en temps résolu de molécules simples en solution. FLEUR utilise la longue durée de vie des photons de résonateurs optiques microtoroid combinés à un verrouillage de fréquence commande de rétroaction, la détection équilibrée, et le filtrage de calcul pour détecter de petites particules jusqu&#39;à des molécules de protéines simples. L&#39;utilisation de la fréquence de verrouillage permet au système de toujours suivre la résonance de déplacement de la microtoroid que les particules se lient, sans la nécessité de balayer ou numériser la longueur d&#39;onde de laser surgrandes plages. Les principes de la fleur peuvent être utilisés pour améliorer les capacités de détection des autres techniques, y compris l&#39;amélioration plasmonique. Dans ce qui suit, les procédures pour effectuer FLEUR sont décrits.

<table><tbody><tr><td>Laser à diode accordable</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de rétroaction à verrouillage de fréquence</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Photorécepteur auto-équilibré</td><td>Newport</td><td>Model 2007</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de polarisation en ligne</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>Carte d’acquisition de données 24 bits</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Interleukine-2 humaine recombinante</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>billes de polystyrène 20 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Table optique</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Lentille d’objectif pour colonne d’imagerie</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Colonne d’imagerie (tube adaptateur)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD haute résolution pour colonne d’imagerie</td><td>Edmund Industrial</td><td>Optics NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

simple détection de molécule libre label-utilisation microtoroid optiques résonateurs

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Détecter de faibles concentrations de molécules jusqu&#39;à la limite de la molécule unique a un impact sur des domaines tels que la détection précoce de la maladie, et des études fondamentales sur le comportement des molécules. Techniques simples de détection de molécule utilisent couramment des labels tels que des marqueurs fluorescents ou quantum dots, cependant, les étiquettes ne sont pas toujours disponibles, augmenter le coût et la complexité, et peuvent perturber les événements étudiés. Résonateurs optiques ont émergé comme un moyen prometteur pour détecter des molécules simples, sans l&#39;utilisation d&#39;étiquettes. Actuellement, la plus petite particule détectée par un système de résonateur non-renforcée plasmonically optique nue en solution est un polystyrène 25 nm une sphère. Nous avons développé une technique connue sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) qui peut dépasser cette limite et d&#39;atteindre seule détection de molécule sans étiquette en solution aqueuse à 2. Comme échelles force du signal avec un volume de particules, notre travail représente un&gt; 100x improvement dans le rapport signal sur bruit (SNR) sur l&#39;état actuel de la technique. Voici les procédures à l&#39;origine FLEUR sont présentés dans le but d&#39;accroître son utilisation dans le domaine.

Événements de liaison des particules sont clairement vu que les changements de pas semblable à la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid au fil du temps (figure 2A). Les hauteurs de ces étapes sont présentés sous forme d&#39;histogramme à la figure 2B. Les figures 2-4 montrent des traces représentatives de la liaison des exosomes (de nanovésicules), des billes de silice de 5 nm, et simples humains interleukine-2 molécules, respectivement. Le...

Nous avons développé un système de biodétection sans marquage basé sur la technologie de résonateur optique connue sous le nom de résonateur évanescent optique à verrouillage de fréquence (FLOWER) qui est capable de détecter des molécules uniques en solution. Ici, les procédures qui sous-tendent ce travail sont décrites et présentées.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter des molécules uniques et des nanoparticules extrêmement petites sans utiliser d'étiquettes, grâce à une technique fondée sur la technologie des résonateurs optiques et le verrouillage de fréquence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines biochimiques tels que le repliement des protéines et la cinétique de liaison. Le principal avantage de cette technique est que la molécule cible n'a pas besoin d'être marquée pour être détectée.La configuration de cette technique consiste à coupler une puce micro OID à une fibre optique. Tout d'abord, se procurer une puce micro OID. Il s'agit d'une puce en silicium d'environ 6,5 millimètres sur 5,5 millimètres, sur laquelle un micro OID est fabriqué.Comme le montre cette image, le micro OID présente un diamètre majeur de 80 à 100 micromètres et un diamètre mineur de deux micromètres. Pour l'instant, mettez le composant de côté et préparez la fibre afin de coupler le composant. Utilisez une fibre monomode sur une bobine et déroulez environ un mètre de fibre.Prendre des pinces dénudeuses et les placer approximativement au milieu de la fibre déroulée. Les utiliser pour enlever un segment de 2,5 centimètres du revêtement polymère de la fibre. Cette zone dénudée constitue la région de couplage de la fibre.Après avoir dénudé la fibre, utilisez un chiffon sans peluches et de l'alcool isopropylique pour nettoyer la zone dénudée. Ensuite, utilisez un support de fibre équipé de pinces magnétiques pour maintenir la partie nettoyée en place. Pour l'étape suivante, disposez des moteurs pas à pas de manière à tirer la fibre dans des directions opposées.Positionner le support de fibre pour permettre l'attachement des moteurs pas à pas de chaque côté de la zone dénudée. En outre, fixer un laser à une extrémité de la fibre afin de servir de source lumineuse. Faire démarrer les moteurs pas à pas dans des directions opposées pour étirer la fibre et utiliser un chalumeau à hydrogène pour fondre la partie dénudée de la fibre.Surveillez constamment la lumière diffusée latéralement à partir de la fibre. Un clignotement indique que la transmission de la lumière à travers la fibre fluctue et qu'un amincissement supplémentaire est nécessaire. Lorsque le clignotement cesse, arrêtez de chauffer et d'étirer la fibre, qui aura été amincie à environ 500 nanomètres.Une fois la fibre amincie, débranchez la source lumineuse et retirez la fibre ainsi que son support de pince magnétique des moteurs récalcitrants. Ensuite, déplacez la fibre vers un banc isolé pneumatiquement équipé d'une plateforme de positionnement. Placez la fibre dans son support de pince magnétique sur un bloc de support devant la puce d'échantillon.La platine de positionnement est une platine de positionnement nanométrique à trois axes placée sur une micromètre à trois axes. En plus de la platine de positionnement nanométrique, des colonnes d'imagerie en vue supérieure et latérale permettent d'assister l'alignement. Poursuivez le travail avec la fibre en vous assurant que sa partie dénudée se trouve près de la platine de positionnement.Préparez-vous à introduire l'extrémité libre de la fibre dans le système de mesure. Après avoir clivé l'extrémité libre, insérez-la dans un adaptateur pour fibre nue. Utilisez cet adaptateur pour connecter la fibre à l'entrée d'un photorécepteur équilibré automatiquement relié à un oscilloscope.À présent, concentrez-vous sur l'autre extrémité de la fibre. Commencez par fixer cette extrémité à un coupleur optique. Ensuite, couplez la fibre à la sortie d'un polariseur en ligne dont l'entrée provient d'un laser à diode accordable et d'un séparateur de faisceau 50/50.Voici un schéma des connexions établies jusqu'à ce point. Notez que la deuxième sortie du séparateur de faisceau traverse un polariseur en ligne et sert de référence pour le récepteur photoélectrique équilibré automatiquement. L'étape suivante consiste à préparer le montage de la puce micro OID à l'aide d'un porte-échantillon en acier inoxydable.Utilisez du ruban adhésif double face pour fixer la puce au support d'échantillon. Placez ensuite la puce microscopique sur le dessus du support d'échantillon. Montez maintenant le support d'échantillon avec la puce sur la plateforme de positionnement nano.Ici, le support et la puce sont en place sur le plateau de positionnement avec le micromètre à trois axes. Positionnez grossièrement la puce d'échantillon par rapport à la fibre. Voici la puce et la fibre après achèvement du positionnement grossier.Ensuite, ajustez davantage la position du positionneur et utilisez les colonnes d'imagerie pour aligner la puce parallèlement à la fibre optique. À l’aide d’un OID microscopique avec une longueur d’onde laser correspondant à celle de la fibre, cette image montre une fibre et un micro. Après l’étape de positionnement fin, l’autocollant circulaire près du centre du champ de vision sert d’aide au positionnement. Passez maintenant à la recherche de la longueur d’onde de résonance du micro.Générez un signal de tension en forme d'onde triangulaire pour réguler la longueur d'onde du laser à environ 635 nanomètres plus ou moins 2,5 nanomètres. Balayez maintenant les longueurs d'onde pour rechercher une résonance. Observez la transmission à travers la fibre sur l'oscilloscope.Remarquez qu'à la longueur d'onde de résonance, la transmission diminue. À ce stade, ajustez la polarisation de la lumière laser. Réglez les contrôleurs de polarisation en ligne pour optimiser la polarisation de la lumière laser dans la fibre optique.Observer la sortie du récepteur photoélectrique à l’aide de l’oscilloscope et ajuster la polarisation jusqu’à ce que le creux de transmission mesuré apparaisse le plus étroit possible. Après avoir optimisé la polarisation, construire une chambre d’échantillonnage. Sur la platine d’échantillonnage.La chambre est constituée d'une lame de couverture en verre fixée par de l'époxy à une lame de microscope. La lame sert d'espacement, permettant à la lame de couverture de dépasser la puce et la fibre. Disposez une pompe à seringue d'un millilitre et son tube afin d'introduire les échantillons expérimentaux dans la chambre à raison d'un millilitre par minute.Ensuite, prélevez un échantillon de un millilitre équilibré à température ambiante afin de le charger dans la pompe. Dans ce cas, il s'agit d'une solution contenant des billes de silice de cinq nanomètres. Une fois chargé, observez la chambre d'échantillonnage et injectez l'échantillon en vous arrêtant lorsque la chambre est pleine. L'injection de l'échantillon s'est arrêtée dans cette chambre, qui est remplie d'une solution contenant des billes de silice de cinq nanomètres.Après avoir attendu 30 secondes afin de minimiser l'effet des vibrations, recherchez la longueur d'onde de résonance du micro. Observez à nouveau le pic de résonance et la transmission à travers la fibre à la résonance à l'aide de l'oscilloscope. Il s'agit d'un schéma du montage expérimental à ce stade, incluant le contrôleur proportionnel intégral dérivé, ou PID.L'intégrateur et le dither. Exécutez le contrôleur en mode verrouillage automatique avec verrouillage au sommet du pic. Réglez la fréquence du dither à deux kilohertz et fixez l'amplitude d'oscillation de longueur d'onde à 19 femtomètres.Après avoir déterminé empiriquement les paramètres du régulateur PID, verrouillez automatiquement la longueur d'onde du laser sur la longueur d'onde de résonance du micro-objet. Collectez les données en enregistrant la sortie du contrôleur de rétroaction. Voici des enregistrements représentatifs du décalage de résonance en femtomètres en fonction du temps en secondes, obtenus à l'aide d'un protocole utilisant trois particules de liaison différentes, classées par taille.Les particules sont des exosomes ou des nano-vésicules. Des billes de silice de cinq nanomètres et des molécules d'interleukine humaine deux. Remarquez les différentes échelles des axes verticaux et horizontaux dans chaque jeu de données.L'observation de différentes échelles dans les données pour des tailles de particules différentes indique que la technique a été correctement réalisée. Lorsqu'une particule se lie à l'OID, la longueur d'onde de résonance de l'OID augmente, provoquant une montée en marche dans le tracé. Lorsqu'une particule se dissocie, la longueur d'onde de résonance diminue, entraînant une descente en marche.La hauteur de chaque pas de longueur d'onde est déterminée par la taille de la particule et sa position sur l'organoïde microscopique. Les échelles de temps sont déterminées par la dynamique de l'organisme particulaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de garder tout aussi propre et exempt de poussière que possible.

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Bioingénierie

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