Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs
December 29th, 2015
Nous avons développé un système de biodétection sans marquage basé sur la technologie de résonateur optique connue sous le nom de résonateur évanescent optique à verrouillage de fréquence (FLOWER) qui est capable de détecter des molécules uniques en solution. Ici, les procédures qui sous-tendent ce travail sont décrites et présentées.
L’objectif global de cette procédure est de détecter des molécules uniques et des nanoparticules ultra-petites sans utiliser d’étiquettes en utilisant une technique basée sur la technologie des résonateurs optiques et le verrouillage de fréquence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines biochimiques tels que le repliement des protéines et la cinétique de liaison. Le principal avantage de cette technique est que la molécule cible n’a pas besoin d’être marquée pour la détecter.
La mise en place de cette technique consiste à coupler une puce micro OID à une fibre optique. Tout d’abord, procurez-vous une puce micro OID. Il s’agit d’une puce de silicium d’environ 6,5 millimètres sur 5,5 millimètres avec un micro-OID fabriqué dessus.
Comme sur cette image, le micro OID a un diamètre majeur de 80 à 100 micromètres et un diamètre mineur de deux micromètres. Pour l’instant, mettez la puce de côté et préparez la fibre afin de coupler la puce. Travaillez avec de la fibre monomode sur une bobine et déroulez environ un mètre de fibre.
Procurez-vous des pinces à dénuder et à peu près au milieu de la fibre de déroulement. Utilisez-les pour dénuder un segment de 2,5 centimètres du revêtement polymère de la fibre. Cette région dénudée est la région de couplage de la fibre.
Après avoir décapé la fibre, utilisez une lingette non pelucheuse et de l’alcool isopropanol pour nettoyer la région décapée. Ensuite, utilisez un support de fibre avec des pinces magnétiques pour maintenir la partie nettoyée en place. Pour l’étape suivante, disposez des moteurs pas à pas pour tirer la fibre dans des directions opposées.
Positionnez le support de fibre pour permettre de fixer les moteurs pas à pas à la fibre de chaque côté de la région dénudée. De plus, fixez un laser à une extrémité de la fibre pour servir de source de lumière. Démarrez les moteurs pas à pas en se déplaçant dans des directions opposées pour étirer la fibre et utilisez une torche à hydrogène pour faire fondre la partie dénudée de la fibre.
Surveillez en permanence la lumière diffusée latéralement par la fibre. Le clignotement indique que la transmission de la lumière à travers la fibre fluctue et qu’un amincissement supplémentaire est nécessaire. Lorsque le clignotement cesse, arrêtez de chauffer et de tirer la fibre, qui aura été mince à environ 500 nanomètres.
Une fois la fibre diluée, détachez la source lumineuse et retirez la fibre et son support de pince magnétique des moteurs tenaces. Ensuite, déplacez la fibre vers un banc isolé pneumatiquement équipé de la platine de positionnement. Placez la fibre dans son support de pince magnétique sur un bloc de support devant la puce de l’échantillon.
La platine de positionnement est une platine de nano-positionnement à trois axes au-dessus d’un micromètre à trois axes. En plus de l’étape de nano-positionnement, il existe des colonnes d’imagerie de vue supérieure et latérale pour aider à l’alignement. Continuez à travailler avec la fibre en vous assurant que sa partie dénudée se trouve près de l’étape de positionnement.
Préparez-vous à introduire l’extrémité libre des fibres dans le système de mesure. Après avoir clivé l’extrémité libre, insérez-la dans un adaptateur à fibre nue. Utilisez l’adaptateur pour connecter la fibre à l’entrée d’un récepteur photo auto-équilibré connecté à un oscilloscope.
Concentrez-vous maintenant sur l’autre extrémité de la fibre. Tout d’abord, fixez cette extrémité à un coupleur optique. Ensuite, couplez la fibre à la sortie d’un polariseur en ligne, qui a une entrée d’un séparateur de faisceau 50 50 et d’un laser à diode accordable ATT.
Voici un schéma des connexions établies jusqu’à ce point. Notez que la deuxième sortie du séparateur de faisceau passe à travers un polariseur en ligne et est utilisée comme référence pour le récepteur photo équilibré automatiquement. L’étape suivante consiste à préparer le montage de la puce micro OID à l’aide d’un porte-échantillon en acier inoxydable.
Utilisez du ruban adhésif double face pour fixer la puce au porte-échantillon. Placez ensuite la micropuce sur le porte-échantillon. Montez maintenant le porte-échantillon avec la puce sur le dessus de la platine de positionnement nano.
Ici, le support et la puce sont en place sur la platine de positionnement avec les trois micromètres Xs. Position grossière, la puce de l’échantillon par rapport à la fibre. Voici la puce et la fibre une fois le positionnement du parcours terminé.
Ensuite, ajustez davantage le positionneur et utilisez les colonnes d’imagerie pour aligner la puce parallèlement à la fibre optique Avec un micro OID avec une longueur d’onde laser de la fibre, cette image est d’une fibre et d’un microt. Après l’étape de positionnement fin, l’autocollant circulaire près du centre du champ de vision est une aide au positionnement. Passez maintenant à la recherche de la longueur d’onde de résonance du micro.
Générez un signal de tension de forme d’onde triangulaire pour réguler la longueur d’onde du laser à environ 635 nanomètres plus ou moins 2,5 nanomètres. Scannez maintenant les longueurs d’onde pour rechercher une résonance. Observez la transmission à travers la fibre sur l’oscilloscope.
Notez qu’à la longueur d’onde de résonance, la transmission diminue. À ce stade, essayez d’ajuster la polarisation de la lumière laser. Ajustez les contrôleurs de polarisation en ligne pour optimiser la polarisation de la lumière laser dans la fibre optique.
Visualisez la sortie du récepteur photo avec l’oscilloscope et ajustez la polarisation jusqu’à ce que la baisse de transmission mesurée apparaisse la plus étroite. Après avoir optimisé la polarisation, construisez une chambre d’échantillonnage. Sur la scène de l’échantillon.
La chambre se compose d’un couvercle en verre époxy à un morceau de microscope. Glisser. La glissière agit comme une entretoise permettant à la lamelle de surplomber la puce et la fibre. Disposez une pompe à seringue d’un millilitre et un tube pour introduire les échantillons d’expérience dans la chambre à raison d’un millilitre par minute.
Ensuite, obtenez un échantillon équilibré à température ambiante d’un millilitre à charger dans la pompe. Dans ce cas, il s’agit d’une solution avec cinq billes de silice nanométriques. Une fois chargé, observez la chambre d’échantillonnage et injectez l’échantillon S’arrêtant lorsque la chambre est remplie, l’injection d’échantillon a cessé dans cette chambre, qui est remplie d’une solution contenant cinq billes de silice nanométriques.
Après avoir attendu 30 secondes pour minimiser l’effet des vibrations, recherchez la longueur d’onde de résonance du micro. Encore une fois, observez le creux et la transmission à travers la fibre à la résonance à l’aide de l’oscilloscope. Il s’agit d’un schéma de la configuration expérimentale à ce stade, y compris la dérivée intégrale proportionnelle ou contrôleur PID.
L’intégrateur et le dither. Faites fonctionner le contrôleur en mode de verrouillage automatique avec verrouillage en haut du pic. Réglez la fréquence de tramage sur deux kilohertz et réglez l’amplitude d’oscillation de la longueur d’onde sur 19 femtomètres.
Après avoir trouvé empiriquement les paramètres PID, verrouillez automatiquement la longueur d’onde du laser sur la longueur d’onde de résonance du micro-oid. Collectez des données en enregistrant la sortie du contrôleur de rétroaction. Voici des traces représentatives du décalage de résonance en femtomètres en fonction du temps en secondes produit avec un protocole utilisant trois particules de liaison différentes par ordre de taille.
Les particules sont des exosomes ou des nano vésicules. Cinq nanomètres de billes de silice et l’interleukine humaine deux molécules. Notez les différentes échelles des AE verticaux et horizontaux dans chaque ensemble de données.
L’observation de différentes échelles dans les données pour différentes tailles de particules est une indication que la technique a été correctement exécutée. Lorsqu’une particule se lie à l’OID, la longueur d’onde de résonance de l’OID augmente, ce qui entraîne une augmentation de la trace. Lorsqu’une particule se délie, la longueur d’onde de résonance diminue, ce qui entraîne un pas vers le bas.
La hauteur de chaque pas de longueur d’onde est déterminée par la taille de la particule et sa position sur le micro-oïde. Les échelles de temps sont déterminées par la dynamique de l’OID des particules Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de tout garder aussi propre et aussi exempt de poussière que possible.
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Aperçu
Cet article présente un système de biocaptage sans étiquette utilisant la technologie du Résonateur Évanescent Optique à Verrouillage de Fréquence (FLOWER) pour la détection de molécules uniques en solution. La méthode décrite permet la détection de nanoparticules ultra-petites sans nécessiter d'étiquetage, répondant à des questions importantes dans la recherche biochimique.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Biochimie
- Nanotechnologie
- Captage optique
Contexte
- La détection de molécules uniques est cruciale pour comprendre les processus biochimiques.
- Les méthodes traditionnelles nécessitent souvent un étiquetage, ce qui peut altérer le comportement des molécules.
- La technologie des résonateurs optiques offre une nouvelle approche du biocaptage.
- Le verrouillage de fréquence améliore la sensibilité et la spécificité de la détection.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour détecter des molécules uniques sans étiquettes.
- Améliorer la compréhension du repliement des protéines et de la cinétique de liaison.
- Fournir une technique fiable pour l'analyse biochimique.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une puce OID micro couplée à une fibre optique.
- Verrouillage de fréquence pour améliorer les capacités de détection.
- Détection sans étiquette des molécules cibles.
- Configuration expérimentale impliquant la fabrication de l'OID micro en silicium.
Résultats principaux
- Détection réussie de molécules uniques en solution.
- Démonstration des avantages du biocaptage sans étiquette.
- Aperçus sur le comportement des nanoparticules ultra-petites.
- Applications potentielles dans divers domaines biochimiques.
Conclusions
- Le système FLOWER représente une avancée significative dans la technologie de biocaptage.
- La détection sans étiquette ouvre de nouvelles voies pour la recherche en biochimie.
- Cette méthode peut faciliter d'autres études sur les interactions moléculaires.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators addresses a critical bottleneck in early discovery by enabling direct, non-perturbative measurement of molecular interactions. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic studies, supporting risk-adjusted portfolio decisions. The FLOWER technique's sensitivity and label-free operation position it as a reusable platform for high-value R&D inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of molecular binding and folding without label-induced artifacts.
- Supports mechanistic de-risking by providing real-time, quantitative detection of single molecule events.
- Improves predictive confidence in target engagement and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, label-free assay systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, reproducible readouts suitable for standardization across discovery teams.
- Enables rapid assessment of molecular interactions for screening readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting detection of disease-relevant biomolecules.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling sensitive, label-free detection in complex matrices.
- Reduces biological risk in preclinical advancement through robust, artifact-free measurement.
Pipeline & Workflow Integration
The FLOWER method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis testing and mechanistic validation before preclinical transition.
- Discovery Biology: Advances hypothesis-driven research by enabling direct measurement of molecular events.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates high signal-to-noise resonance shift data for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and continuity across discovery and preclinical phases.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, label-free detection platform adaptable to diverse molecular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection workflows and enhances reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical resonator setup and precision alignment.
- Demands access to specialized instrumentation, including microtoroid chips and frequency locking controllers.
- Necessitates rigorous cleanliness and dust control to maintain sensitivity.
- May require adaptation for different molecular targets or sample matrices.
- Operational throughput and scalability depend on technical proficiency and infrastructure.
