Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs
29 décembre 2015
Nous avons développé un système de biodétection sans marquage basé sur la technologie de résonateur optique connue sous le nom de résonateur évanescent optique à verrouillage de fréquence (FLOWER) qui est capable de détecter des molécules uniques en solution. Ici, les procédures qui sous-tendent ce travail sont décrites et présentées.
L’objectif global de cette procédure est de détecter des molécules uniques et des nanoparticules ultra-petites sans utiliser d’étiquettes en utilisant une technique basée sur la technologie des résonateurs optiques et le verrouillage de fréquence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines biochimiques tels que le repliement des protéines et la cinétique de liaison. Le principal avantage de cette technique est que la molécule cible n’a pas besoin d’être marquée pour la détecter.
La mise en place de cette technique consiste à coupler une puce micro OID à une fibre optique. Tout d’abord, procurez-vous une puce micro OID. Il s’agit d’une puce de silicium d’environ 6,5 millimètres sur 5,5 millimètres avec un micro-OID fabriqué dessus.
Comme sur cette image, le micro OID a un diamètre majeur de 80 à 100 micromètres et un diamètre mineur de deux micromètres. Pour l’instant, mettez la puce de côté et préparez la fibre afin de coupler la puce. Travaillez avec de la fibre monomode sur une bobine et déroulez environ un mètre de fibre.
Procurez-vous des pinces à dénuder et à peu près au milieu de la fibre de déroulement. Utilisez-les pour dénuder un segment de 2,5 centimètres du revêtement polymère de la fibre. Cette région dénudée est la région de couplage de la fibre.
Après avoir décapé la fibre, utilisez une lingette non pelucheuse et de l’alcool isopropanol pour nettoyer la région décapée. Ensuite, utilisez un support de fibre avec des pinces magnétiques pour maintenir la partie nettoyée en place. Pour l’étape suivante, disposez des moteurs pas à pas pour tirer la fibre dans des directions opposées.
Positionnez le support de fibre pour permettre de fixer les moteurs pas à pas à la fibre de chaque côté de la région dénudée. De plus, fixez un laser à une extrémité de la fibre pour servir de source de lumière. Démarrez les moteurs pas à pas en se déplaçant dans des directions opposées pour étirer la fibre et utilisez une torche à hydrogène pour faire fondre la partie dénudée de la fibre.
Surveillez en permanence la lumière diffusée latéralement par la fibre. Le clignotement indique que la transmission de la lumière à travers la fibre fluctue et qu’un amincissement supplémentaire est nécessaire. Lorsque le clignotement cesse, arrêtez de chauffer et de tirer la fibre, qui aura été mince à environ 500 nanomètres.
Une fois la fibre diluée, détachez la source lumineuse et retirez la fibre et son support de pince magnétique des moteurs tenaces. Ensuite, déplacez la fibre vers un banc isolé pneumatiquement équipé de la platine de positionnement. Placez la fibre dans son support de pince magnétique sur un bloc de support devant la puce de l’échantillon.
La platine de positionnement est une platine de nano-positionnement à trois axes au-dessus d’un micromètre à trois axes. En plus de l’étape de nano-positionnement, il existe des colonnes d’imagerie de vue supérieure et latérale pour aider à l’alignement. Continuez à travailler avec la fibre en vous assurant que sa partie dénudée se trouve près de l’étape de positionnement.
Préparez-vous à introduire l’extrémité libre des fibres dans le système de mesure. Après avoir clivé l’extrémité libre, insérez-la dans un adaptateur à fibre nue. Utilisez l’adaptateur pour connecter la fibre à l’entrée d’un récepteur photo auto-équilibré connecté à un oscilloscope.
Concentrez-vous maintenant sur l’autre extrémité de la fibre. Tout d’abord, fixez cette extrémité à un coupleur optique. Ensuite, couplez la fibre à la sortie d’un polariseur en ligne, qui a une entrée d’un séparateur de faisceau 50 50 et d’un laser à diode accordable ATT.
Voici un schéma des connexions établies jusqu’à ce point. Notez que la deuxième sortie du séparateur de faisceau passe à travers un polariseur en ligne et est utilisée comme référence pour le récepteur photo équilibré automatiquement. L’étape suivante consiste à préparer le montage de la puce micro OID à l’aide d’un porte-échantillon en acier inoxydable.
Utilisez du ruban adhésif double face pour fixer la puce au porte-échantillon. Placez ensuite la micropuce sur le porte-échantillon. Montez maintenant le porte-échantillon avec la puce sur le dessus de la platine de positionnement nano.
Ici, le support et la puce sont en place sur la platine de positionnement avec les trois micromètres Xs. Position grossière, la puce de l’échantillon par rapport à la fibre. Voici la puce et la fibre une fois le positionnement du parcours terminé.
Ensuite, ajustez davantage le positionneur et utilisez les colonnes d’imagerie pour aligner la puce parallèlement à la fibre optique Avec un micro OID avec une longueur d’onde laser de la fibre, cette image est d’une fibre et d’un microt. Après l’étape de positionnement fin, l’autocollant circulaire près du centre du champ de vision est une aide au positionnement. Passez maintenant à la recherche de la longueur d’onde de résonance du micro.
Générez un signal de tension de forme d’onde triangulaire pour réguler la longueur d’onde du laser à environ 635 nanomètres plus ou moins 2,5 nanomètres. Scannez maintenant les longueurs d’onde pour rechercher une résonance. Observez la transmission à travers la fibre sur l’oscilloscope.
Notez qu’à la longueur d’onde de résonance, la transmission diminue. À ce stade, essayez d’ajuster la polarisation de la lumière laser. Ajustez les contrôleurs de polarisation en ligne pour optimiser la polarisation de la lumière laser dans la fibre optique.
Visualisez la sortie du récepteur photo avec l’oscilloscope et ajustez la polarisation jusqu’à ce que la baisse de transmission mesurée apparaisse la plus étroite. Après avoir optimisé la polarisation, construisez une chambre d’échantillonnage. Sur la scène de l’échantillon.
La chambre se compose d’un couvercle en verre époxy à un morceau de microscope. Glisser. La glissière agit comme une entretoise permettant à la lamelle de surplomber la puce et la fibre. Disposez une pompe à seringue d’un millilitre et un tube pour introduire les échantillons d’expérience dans la chambre à raison d’un millilitre par minute.
Ensuite, obtenez un échantillon équilibré à température ambiante d’un millilitre à charger dans la pompe. Dans ce cas, il s’agit d’une solution avec cinq billes de silice nanométriques. Une fois chargé, observez la chambre d’échantillonnage et injectez l’échantillon S’arrêtant lorsque la chambre est remplie, l’injection d’échantillon a cessé dans cette chambre, qui est remplie d’une solution contenant cinq billes de silice nanométriques.
Après avoir attendu 30 secondes pour minimiser l’effet des vibrations, recherchez la longueur d’onde de résonance du micro. Encore une fois, observez le creux et la transmission à travers la fibre à la résonance à l’aide de l’oscilloscope. Il s’agit d’un schéma de la configuration expérimentale à ce stade, y compris la dérivée intégrale proportionnelle ou contrôleur PID.
L’intégrateur et le dither. Faites fonctionner le contrôleur en mode de verrouillage automatique avec verrouillage en haut du pic. Réglez la fréquence de tramage sur deux kilohertz et réglez l’amplitude d’oscillation de la longueur d’onde sur 19 femtomètres.
Après avoir trouvé empiriquement les paramètres PID, verrouillez automatiquement la longueur d’onde du laser sur la longueur d’onde de résonance du micro-oid. Collectez des données en enregistrant la sortie du contrôleur de rétroaction. Voici des traces représentatives du décalage de résonance en femtomètres en fonction du temps en secondes produit avec un protocole utilisant trois particules de liaison différentes par ordre de taille.
Les particules sont des exosomes ou des nano vésicules. Cinq nanomètres de billes de silice et l’interleukine humaine deux molécules. Notez les différentes échelles des AE verticaux et horizontaux dans chaque ensemble de données.
L’observation de différentes échelles dans les données pour différentes tailles de particules est une indication que la technique a été correctement exécutée. Lorsqu’une particule se lie à l’OID, la longueur d’onde de résonance de l’OID augmente, ce qui entraîne une augmentation de la trace. Lorsqu’une particule se délie, la longueur d’onde de résonance diminue, ce qui entraîne un pas vers le bas.
La hauteur de chaque pas de longueur d’onde est déterminée par la taille de la particule et sa position sur le micro-oïde. Les échelles de temps sont déterminées par la dynamique de l’OID des particules Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de tout garder aussi propre et aussi exempt de poussière que possible.
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Aperçu
Cet article présente un système de biosensing sans marquage utilisant la technologie FLOWER (résonateur évanescent whispering optique à verrouillage de fréquence) pour la détection de molécules uniques en solution. La méthode décrite permet la détection de nanoparticules extrêmement petites sans nécessiter de marquage, répondant ainsi à des questions importantes en recherche biochimique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Nanotechnologie
- Capteurs optiques
Contexte
- La détection de molécules uniques est essentielle pour comprendre les processus biochimiques.
- Les méthodes traditionnelles nécessitent souvent un marquage, qui peut modifier le comportement des molécules.
- La technologie des résonateurs optiques offre une approche innovante pour la biosurveillance.
- Le verrouillage de fréquence améliore la sensibilité et la spécificité de la détection.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de détection de molécules uniques sans marquage.
- Améliorer la compréhension des cinétiques de repliement et de liaison des protéines.
- Fournir une technique fiable pour l'analyse biochimique.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une puce micro OID couplée à une fibre optique.
- Verrouillage de fréquence pour améliorer les capacités de détection.
- Détection sans marquage de molécules cibles.
- Dispositif expérimental impliquant la fabrication de micro OID en silicium.
Résultats principaux
- Détection réussie de molécules uniques en solution.
- Mise en évidence des avantages du biosensage sans marquage.
- Connaissances approfondies sur le comportement de nanoparticules ultrafines.
- Applications potentielles dans divers domaines biochimiques.
Conclusions
- Le système FLOWER représente une avancée significative dans la technologie des biocapteurs.
- La détection sans marquage ouvre de nouvelles voies de recherche en biochimie.
- Cette méthode peut faciliter des études supplémentaires sur les interactions moléculaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La détection sans marquage de molécules uniques à l'aide de résonateurs optiques microtoroïdaux permet de surmonter un goulot d'étranglement critique dans la phase précoce de découverte, en rendant possible la mesure directe et non perturbative des interactions moléculaires. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive des études de validation de cibles et des analyses mécanistiques, soutenant ainsi les décisions stratégiques pondérées en matière de portefeuille. La sensibilité de la technique FLOWER et son fonctionnement sans marquage en font une plateforme réutilisable pour des points critiques de R&D à forte valeur ajoutée.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation directe de la liaison moléculaire et du repliement sans artéfacts induits par les marqueurs.
- Facilite la détection en temps réel et quantitative des événements au niveau individuel pour une approche mécanistique de réduction des risques.
- Améliore la confiance prédictive dans l'engagement de la cible et l'analyse des voies biologiques.
Développement de criblages et de tests
- Facilite la préparation de systèmes d'essai validés et sans marquage pour le criblage de composés en aval.
- Fournit des lectures quantitatives et reproductibles, adaptées à une normalisation entre les équipes de découverte.
- Permet une évaluation rapide des interactions moléculaires en vue de leur aptitude au criblage et de leur évolutivité.
Recherche translationnelle et préclinique
- Assure une continuité entre la découverte et la validation préclinique en permettant la détection de biomolécules pertinentes pour la maladie.
- S'inscrit dans les stratégies translationnelles de biomarqueurs en permettant une détection sensible et sans marquage dans des matrices complexes.
- Réduit le risque biologique lors du passage à l'étape préclinique grâce à des mesures robustes et exemptes d'artéfacts.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode FLOWER s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et l'identification de composés candidats, en soutenant la vérification des hypothèses et la validation mécanistique avant le passage en phase préclinique.
- Biologie de la découverte : Fait progresser la recherche fondée sur des hypothèses en permettant la mesure directe des événements moléculaires.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'emploi pour une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Génère des données de décalage de résonance à fort rapport signal/bruit pour l'analyse comparative des interactions de liaison.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs et assure la continuité entre les phases de découverte et préclinique.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme de détection sans marquage, évolutible et adaptable à diverses cibles moléculaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de détection et améliore la reproductibilité entre les équipes de recherche et développement.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller/arrêt et améliore l'efficacité du capital en réduisant les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des actifs de découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la configuration de résonateurs optiques et l'alignement de précision.
- Exige un accès à des instruments spécialisés, notamment des puces microtoroïdales et des contrôleurs de verrouillage de fréquence.
- Implique une propreté rigoureuse et un contrôle strict des poussières afin de préserver la sensibilité.
- Peut nécessiter des adaptations selon les cibles moléculaires ou les matrices d'échantillon.
- Le débit opérationnel et la scalabilité dépendent du niveau de compétence technique et des infrastructures disponibles.
