Name: In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour générer des cellules dendritiques plasmacytoïdes à partir de progéniteurs lymphoïdes communs en utilisant le système de co-culture AC-6 avec Flt3 ligand. Cette technique permet d'étudier le développement des pDCs et leurs implications dans les maladies auto-immunes.

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Nous sommes reconnaissants à MM. Markus Manz et Irving Weissman pour fournir des réactifs. Nous reconnaissons également le service fourni par la cytométrie en flux et l&#39;analyse cellulaire tri de base Fonds de la première et deuxième laboratoire de base à la National Taiwan University College de l&#39;hôpital de médecine et NTU, respectivement. Ce travail a été soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) et les Instituts nationaux de recherche en santé, Taiwan (INDH-EX102-10256SI et INDH-EX103-10256SI).

/ 6 souris de type sauvage C57BL ont été achetées au Laboratoire national Animal Center (NLAC), Taiwan. Toutes les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes spécifiques. Protocoles et des procédures d&#39;utilisation des animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux dans les institutions Comité National Taiwan University College of Medicine (Numéro de permis: 20120075). En outre, les chercheurs ont fait tous les efforts pour réduire le potentiel de la douleur, de la souffrance ou de la détresse chez les animaux tout en effectuant des expériences. Toutes les procédures décrites ont été effectuées à la température ambiante, tout en portant des gants. 1. Préparation de l&#39;AC-6 cellules nourricières Remarque: L&#39;AC-6.21 (AC-6 en court) ligne de cellules stromales 18 (fourni par I. Weissman, l&#39;Université de Stanford) doit être maintenue dans un milieu RPMI complété avec du sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur 15% (FBS). Pour servir de cellules nourricières, AC-6 cellules sont γ-irradié avec 3000 rad (30 Gy) un jour avant la co-culture pour empêcher leur prolifération. Remarque èmeAC-6 cellules ont tendance à perdre leur capacité de différenciation de soutien si surpeuplé gauche lors de l&#39;entretien, ou si leur numéro de passage est de plus de 20. <ol><li> Laver AC-6 cellules une fois avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et retirer DPBS par aspiration. Traiter AC-6 cellules avec 0,8 ml de solution de trypsine (0,05% de trypsine et 0,5 mM d&#39;EDTA dans du DPBS) pour 3-5 minutes à 37 ° C, 5% de CO 2, puis arrêter la réaction par dilution avec 10 volumes de milieu de culture à faire suspension cellulaire unique. </li><li> Semences AC-6 dans des cellules 5.9x10 4 cellules / puits dans des plaques à 12 puits et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 H / N. Note: La densité de l&#39;AC-6 cellules est très important car une densité inférieure favorisera génération CDC. Ensemencement à une densité de 5.9x10 4 cellules / puits permettront AC-6 pour atteindre la confluence le lendemain, ce qui est optimal pour la dérivation des PDC du CLP. </li><li> Irradier AC-6 cellules à 3000 rad (30 Gy) en utilisant γ-irradiation. Note: La dose utilisée pour irradier AC-6 est optimisé pour empêcher les cellules de proliférer et de les garder viable assez longtemps pour fournir les cytokines et contact cellule-cellule nécessaire à la différenciation des PED de CLPs encore. </li><li> Aspirer le milieu et le remplacer avec 1 ml de RPMI complet (RPMI avec 10% de FBS inactivé à la chaleur, 50 pg / ml de gentamycine et 50 uM de β-mercaptoéthanol). </li></ol> 2. Isolat de cellules BM de souris <ol><li> Sacrifiez souris par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale. Placez les souris sur une plaque de dissection et stériliser avec 70% d&#39;éthanol. Faire une incision au milieu de l&#39;abdomen et enlevez la peau de la partie distale de la souris, y compris la peau qui recouvre les extrémités inférieures. </li><li> Disséquer les souris dans une hotte semi-stérile. Pour libérer le fémur et le tibia, le fémur le clip ci-dessus et ci-dessous tibias l&#39;articulation du genou. Détachez les muscles des os à l&#39;aide de ciseaux et placer les os dans une boîte de Pétri de 6 cm contenant 5 ml RPMI complet. </li><li> Déplacer vers une hotte de culture stérile. Remplir une seringue de 3 ml relié à une aiguille 27G avec RPMI complet. Coupez les deux extrémités des os à l&#39;aide de ciseaux, et insérer l&#39;aiguille de 27G pour rincer la moelle des os en injectant doucement RPMI complet une fois à chaque extrémité. </li><li> Préparer une suspension cellulaire unique par pipetage doux les cellules de haut en bas 3-5 fois dans la boîte de culture en utilisant la seringue sans aiguille. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 500 xg et décanter le surnageant. </li><li> Lyse des globules rouges avec une ml de tampon ACK (150 mM de NH 4 Cl, 10 mM de KHCO3, EDTA 0,1 mM) l&#39;incubation pendant 1 min et arrêt de la réaction par dilution avec 10 volumes de milieu RPMI complet. Laisser les cellules reposer pendant 5 min pour sédimenter bas amas de cellules mortes et les débris de tissu par gravité. Note: Ne pas se tenir plus de 5 minutes que cela se traduira par la perte de cellules due à régler de cellules viables. </li><li> Lentement décantation surnageant contenant les cellules à un nouveau tube de débris laissantderrière dans le tube d&#39;origine. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 500 g pour sédimenter les cellules, puis retirer et jeter le surnageant. </li><li> Reprendre cellules totales BM (typiquement 4-6 x 10 7 BM cellules sont obtenues à partir d&#39;une souris) dans 100 pi de tampon FACS (1x PBS + 2% de FBS + EDTA 1 mM). </li></ol> 3. Analyse FACS et le tri des PLC <ol><li> Ajouter anti-CD16 / 32 (clone hybridome 2.4G2 supernant, 50 ul / réaction ou 2.1 ug / réaction) dans des cellules dans un tampon FACS (étape 2.9) pendant 1-2 min afin de bloquer les récepteurs Fc. Remarque: anti-CD16 / 32 est également appelé bloc Fc, qui est ajouté pour empêcher une liaison non spécifique d&#39;anticorps à des cellules exprimant des récepteurs Fc, y compris les granulocytes, les monocytes et les lymphocytes B. </li><li> Cellules simultanément tacher avec les anticorps fluorescents suivants marqués par un colorant (pour 4x10 7 cellules) pendant 15 min sur la glace, en évitant la lumière ambiante. Anticorps: marqueurs de la lignée PE-conjugués (0,2 ug chacun) y compris anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53 à 6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-Ter119 (TER-119) et anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 ug anti-c-Kit PerCP-Cy5.5- (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug anti-de M-CSFR-APC (AFS98), et 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> Laver les cellules avec 3 ml de tampon FACS, et centrifuger pendant 5 min à 500 x g. </li><li> Remettre les cellules dans 300 pi de tampon FACS et les cellules de filtre à travers un tamis cellulaire de 40 pm. </li><li> Laver le tube avec un tampon supplémentaire de 100 pi FACS pour récupérer toutes les cellules restantes et filtrer dans un FACS stériles tri tube en utilisant le même tamis cellulaire. </li><li> Effectuer une analyse de cytométrie de flux immédiatement après la coloration en utilisant des filtres et des tensions appropriées pour la détection du signal. Utilisez 488 nm laser pour détecter les anticorps FITC, PerCP-Cy5.5 marqués, 561 nm laser pour détecter la PE- et des anticorps PE-Cy7-labelded et 633 nm lasER pour détecter l&#39;anticorps marqué APC. </li><li> Trier PLC en fonction des marqueurs suivants lin c-kit - Sca-1 int int M-CSFR IL-7Rα - + (comme dans l&#39;étape 3.2 tachée) en utilisant un trieur de cellules. Recueillir les cellules triées dans un tube de 15 ml contenant 8 ml de RPMI complet comme un coussin. </li><li> Notez le nombre absolu de cellules triées comme indiqué par le trieur de cellules à la fin de la course. Typiquement, 5x10 4 PLC peuvent être obtenus à partir de la BM de souris une. </li></ol> 4. coculture CLP et AC-6 <ol><li> Centrifuger les cellules triées de l&#39;étape 3.7 pendant 10 min à 500 g, éliminer le surnageant et remettre le culot cellulaire avec assez de RPMI complet pour obtenir une densité cellulaire d&#39;environ 5x10 4 cellules / ml. Seed 500 cellules / puits dans la plaque de 12 puits contenant des cellules nourricières préparés à l&#39;étape 1.4. </li><li> Ajouter 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig généré en interne en utilisant un système d&#39;expression fournie par M. Manz, UniversiHôpital ty Zürich, Suisse) et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 avec un contrôle visuel périodique de développement continu sous un microscope. Remarque: disponible dans le commerce FL humaine recombinante ou la souris FL peuvent être utilisés comme un substitut pour hu-Flt3L-Ig pour soutenir le développement continu. </li><li> Recueillir les cellules dans le surnageant à 12 jours et laver les puits une fois avec 0,5 ml de milieu RPMI compléter combinant les surnageants résultants. Ajouter 0,5 ml de milieu frais et débris les cellules adhérentes avec un racleur de cellules. </li><li> Moissonneuse le milieu contenant les cellules à partir des deux parties et centrifuger pendant 5 min à 500 x g. </li><li> Cellules surnageant et remettre Décanter dans un tampon FACS de 50 pi. Ajouter 50 ul anti-CD16 / 32 surnageant d&#39;hybridome et incuber pendant 1-2 min pour bloquer les récepteurs Fc. </li><li> Énumérer et colorer toutes les cellules avec les anticorps suivants (0,05 ug chacun) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b FITC-et anti-B220-PE. </li><li> Lavez et centrifuger les cellules que décrired à l&#39;étape 3.3. </li><li> Reprendre les cellules dans 100 pi de tampon FACS, porte sur CD11c + et d&#39;analyser pour CDCS (CD11c + CD11b + B220 -) et pDC (CD11c + CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

<ol><li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li>
<li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li>
<li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li>
<li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li>
<li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li>
<li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+recent+progress+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li>
<li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li>
<li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li>
<li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines%3A+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li>
<li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li>
<li>Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous décrivons un système in vitro en culture pour la génération robuste des pays en développement, et en particulier les pDC, à partir d&#39;un petit nombre de CLP. Le caractère unique de ce système de culture est due à l&#39;utilisation de l&#39;AC-6, les cellules d&#39;une lignée cellulaire stromale, en tant que dispositifs d&#39;alimentation. Cette approche a été montré pour fournir non seulement les cytokines, telles que IL-7, SCF, M-CSF et FL 20, mais aussi le contact cellule-cell...

Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d&#39;antigène professionnelles qui jouent un rôle important dans le contrôle des réponses immunitaires 1. Alors que les PED sont hétérogènes, ils peuvent être classés en deux populations, les CD classique (CDCS) et DCS plasmacytoïdes (pDC) 2,3. En plus des organes lymphoïdes, CDCS et pDC sont également présents dans les tissus y compris les poumons, l&#39;intestin et de la peau 2. La morphologie du CDCS et pDCs diffère, avec CDCS présentant projections de dendrites-like et la forme des PDC comme étant des cellules plus de plasma. En outre, le marqueur DC de la souris commune, CD11c, est plus fortement exprimé sur CDCS que sur les pDC. En outre, CDC peut encore être divisé en CD11b + CD24 - CDCS et CD11b - CD24 + CDCS, qui expriment toutes deux des niveaux plus élevés de CMH de classe II et molécules costimulatrices que font pDCs 2. PDCs matures, d&#39;autre part il a été démontré, pour exprimer sélectivement Siglec-H et BST2 4. Functionally, CDCS sont meilleures cellules présentatrices d&#39;antigène que sont pDCs; Toutefois, pDCs peuvent produire une grande quantité d&#39;interféron de type I lors de l&#39;infection par le virus ou la stimulation inflammatoire 5. Les deux CDCS et pDC sont de courte durée, et par conséquent, doivent être constamment reconstituées à partir de progéniteurs dans la moelle osseuse (BM) 6,7. Le transfert adoptif de progéniteurs myéloïdes communs (CMPS) et les progéniteurs lymphoïdes communs (cLPS) dans des souris mortellement irradié démontre que CDCS et pDCs peuvent être générés à partir de deux lignées 8-10. Cependant, il existe un sous-ensemble de pDC qui expriment RAG1 / 2 et possédant des segments réarrangés DJ au locus IgH 11,12. Ces cellules partagent aussi des similitudes moléculaires avec des lymphocytes B, y compris l&#39;expression du marqueur de B220, récepteurs de l&#39;acide détection nucléiques (TLR7 / TLR9), et les facteurs de transcription (SPIB et BCL11A) 13, dispose de tous croit être les signatures de la lignée lymphoïde. Par conséquent, CLPs peut être un bon choix pour la production in vitro de la lignée de pDC parce similitude. Bien que la fréquence des deux CDCS et pDC chez les humains et les souris est très faible 6, les DC, en particulier CDCS, peut être produite in vitro à partir de progéniteurs BM ou en présence de cytokines, telles que GM-CSF ou le ligand Flt3 11,14 (FL ) en utilisant des systèmes sans cellules nourricières 11,15,16. Malheureusement, il est impossible de produire un grand nombre de pDC in vitro utilisant FL 11,15,16. Auparavant, nous avons démontré que les pDC peuvent être générées de manière efficace in vitro de PLC au moyen du système d&#39;alimentation AC-17 6. L&#39;avantage d&#39;utiliser la lignée cellulaire stromale AC-6 dans le système de culture est que cela permet un contact cellule-cellule et sécrétion de cytokines qui favorisent la production d&#39;un grand nombre de pDC à partir de PLC. Bien que la production de ce système est très robuste, la réplication attentif des procédures décrites ci-dessous est nécessaire in Afin d&#39;assurer la production efficace des PDC.

<table><tbody><tr><td>Anti-souris Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris NK1.1 (PE), clone PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris&nbsp ; CD11b (PE), cloneM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris CD19 (PE), clone eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris B220 (PE), clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>marqueur de lignage/FACS</td></tr><tr><td>Anti-souris CD3 (PE), clone 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris CD8a (PE), clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris MHC-II (PE), clone NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris Ter119 (PE), clone TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>Anti-souris Thy1.1 (PE), clone HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>marqueur de lignage</td></tr><tr><td>anti-souris M-CSFR (APC), clone AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>C-Kit anti-souris (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-souris Sca-1 (FITC), clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-souris IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-souris CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-souris CD11b (FITC), clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td></td></tr><tr><td>FACS FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Trieur de cellules</td></tr><tr><td>Tube de tri FACS&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Sofrware d’analyse de flux</td></tr></tbody></table>

in vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur ac-6

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont de type I puissant interféron (IFN-I) des cellules productrices qui sont activés en réponse à une infection ou au cours des réactions inflammatoires. Malheureusement, l&#39;étude de la fonction PDC est entravé par leur faible fréquence dans les organes lymphoïdes et les méthodes existantes pour vitro génération DC favorise principalement la production des CDC sur les pDC. Ici, nous présentons une approche unique pour générer efficacement des pDC de progéniteurs lymphoïdes communs (cLPS) in vitro. Plus précisément, le protocole décrit les détails comment purifier CLPs de la moelle osseuse et de générer des pDC par co-culture avec AC-6 cellules nourricières gamma-irradiées en présence de ligand Flt3. Une caractéristique unique de ce système de culture est que les PLC migrent au-dessous des cellules AC-6 et deviennent des cellules de la zone formant pavées, une étape cruciale pour l&#39;expansion pDC. PED morphologiquement distinctes, à savoir PDC et les CDC, ont été générés après environ deux semaines avec une composition de 70-90% pDC dans des conditions optimales. En règle générale, le nombre de pDC générés par ce procédé est d&#39;environ 100 fois du nombre de têtes de série PLC. Par conséquent, cela est un nouveau système avec lequel pour générer vigoureusement le grand nombre de pDC nécessaires pour faciliter d&#39;autres études sur le développement et la fonction de ces cellules.

Un total de 7 4-6x10 cellules BM sont généralement isolé de fémurs et tibias d&#39;un 6-8 sem-vieux, de type sauvage C57BL / 6 souris. Pour trier CLP, cellules totales BM sont colorées avec des anticorps PE-conjugué contre des marqueurs de la lignée (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, GR-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, et CMH-II), Anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-de M-CSFR et APC-anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analysées et triées avec un trieur de cellules. La stratégie de tri pour CLP est représenté sur la <stron...

Dans cette étude, nous présentons un système de culture in vitro capable de générer efficacement des pDC en co-cultivant des progéniteurs lymphoïdes communs avec des cellules nourricières AC-6 en présence du ligand Flt3.

In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode efficace pour générer des cellules dendritiques plasmacytoïdes ou PDC pour l'étude de leur développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que : Comment le développement des PDC est-il régulé ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'utiliser un petit nombre de cellules progénitrices pour générer efficacement de grandes quantités de PDC.Les implications de cette technique concernent le traitement des maladies auto-immunes associées au PDC, telles que le lupus systémique, l'athétose et le psoriasis. Pour démontrer la procédure aujourd'hui, Xang, un excellent étudiant du laboratoire, va semer la veille du prélèvement des cellules de moelle osseuse, 5,9 × 10⁴ cellules de la lignée cellulaire stromale AC6 par puits dans des puits individuels de plaques de 12 puits, puis incuber les plaques à 37 °C et 5 % CO₂ pendant la nuit. Le lendemain matin, irradier les cellules AC6 avec un rayonnement gamma à 3000 rad et remplacer le milieu de culture par un millilitre de milieu complet.Placez ensuite le nombre approprié de souris adultes de type sauvage C57 black six dans un plateau de dissection et stérilisez les animaux avec de l'éthanol à 70 %. Puis, déplacez le plateau sous une hotte semi-stérile et pratiquez des incisions au niveau de l'abdomen médian de chaque animal, enlevant la peau des parties distales, y compris des membres inférieurs, afin d'exposer le fémur et le tibia. Coupez le fémur au-dessus et le tibia en dessous des articulations du genou, puis utilisez des ciseaux pour détacher les muscles des os au fur et à mesure de leur collecte. Placez les os dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant cinq millilitres de RPMI complet et transférez la boîte de Pétri sous une hotte de culture stérile.Remplissez maintenant une seringue de trois millilitres équipée d'une aiguille de calibre 27 avec du RPMI complet et utilisez des ciseaux pour couper les deux extrémités de chaque os. Insérez l'aiguille dans chaque os et rincez la moelle par une injection douce de RPMI complet, une fois par chaque extrémité. Ensuite, sans l'aiguille, aspirez et redistribuez doucement les cellules trois à cinq fois dans la boîte de culture afin d'obtenir une suspension monocellulaire.Après avoir centrifugé les cellules, lysez les globules rouges avec un millilitre de tampon CK, puis arrêtez la réaction avec 10 volumes de RPMI complet. Après une minute, laissez les agrégats de cellules mortes et les débris sédimenter pendant cinq minutes, puis versez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube. Ensuite, après avoir à nouveau centrifugé les cellules, nous suspendons les cellules totales de la moelle osseuse dans 100 microlitres de tampon fax afin d'analyser les progéniteurs lymphoïdes communs ou CLPs par cytométrie en flux.Ensuite, bloquer les cellules en présence d’un anticorps anti-CD16 à 32 pendant une à deux minutes, suivie d’une coloration simultanée des cellules avec le mélange d’anticorps approprié. Après 15 minutes sur glace, laver les cellules dans trois millilitres de tampon fax et remettre en suspension le culot dans 300 microlitres de tampon fax frais. Puis filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de 40 micromètres et trier immédiatement les cellules sur un cytomètre en flux en utilisant les filtres et les tensions appropriés.Prélevez les cellules d'intérêt dans un tube de 15 millilitres contenant huit millilitres de RPMI complet. Pour générer une population PDCM fortement enrichie, il est essentiel de trier la population appropriée de CLP parmi les cellules de moelle osseuse récoltées, en vue de leur culture in vitro à l'aide d'un système d'alimentation Z six. À la fin du tri, centrifugez les cellules et remettez en suspension le culot de cellules CLP avec suffisamment de RPMI complet pour obtenir une densité cellulaire d'environ cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par millilitre.Ensuite, ensemencez 500 cellules par puits dans la plaque de 12 puits contenant les cellules nourricières AC six et complétez les co-cultures avec 100 nanogrammes par millilitre de ligand FL trois, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec un suivi visuel périodique du développement des cellules dendritiques ou cellules DC au microscope. Au jour 12, récoltez les cellules présentes dans le surnageant de co-culture et lavez chaque puits une fois avec un demi-millilitre de milieu RPMI complet, regroupant le surnageant et les lavages obtenus. Ajoutez ensuite un demi-millilitre de milieu frais dans chaque puits et utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules adhérentes.Combiner les cellules détachées avec les cellules en suspension et centrifuger la suspension cellulaire obtenue. Resuspendre le culot dans 50 µL de tampon fax. Puis compter les cellules et les marquer pour l'expression de CD11c, CD11b et B220 après blocage FC.Comme vient de l'être démontré, les cellules en co-culture peuvent ensuite être analysées pour la présence de cellules dendritiques conventionnelles CD11c+, CD11b+, B220−, et plasmacytoïdes CD11c+, CD11b−, B220+, pour un total de quatre à six fois dix puissance sept. Les cellules de moelle osseuse sont généralement isolées à partir des fémurs et des tibias d'une souris sauvage de type C57BL/6 âgée de six à huit semaines, cinq fois dix puissance quatre CLP étant couramment obtenus à partir d'une seule souris C57BL/6. Après tri par cytométrie en flux, comme vient d'être démontré, entre les jours trois et quatre de co-culture avec des cellules nourricières AC6, des cellules formant des zones en pavé commencent à apparaître, les cellules dendritiques plasmacytoïdes de forme ronde apparaissant en suspension au-dessus des cellules formant des zones en pavé.Vers le huitième jour, le nombre de DC plasmacytoïdes atteint un pic aux alentours des jours 12 à 14, moment auquel les cellules commencent à subir un processus d'apoptose après leur développement complet, et leur nombre commence progressivement à diminuer. Les colonies de DC conventionnels apparaissent plus tard, entre le sixième et le huitième jour, et sont adhérentes, avec une morphologie allongée en fuseau. Une analyse en cytométrie en flux montre que les cocultures sont constituées à 91 % de DC plasmacytoïdes CD11c positifs, CD11b négatifs, B220 positifs et à 6 % de DC conventionnels CD11c positifs, CD11b positifs, B220 négatifs, révélant ainsi une expansion de 100 fois du nombre de DC plasmacytoïdes par rapport à la population initiale de CLP par cette méthode.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer que la cellule a c six est en bon état et que la densité de C est correcte avant d'ajouter le clp après un développement. Cette technique a permis aux chercheurs en biologie des DC de surmonter la limitation liée à l'utilisation d'un petit nombre de projecteurs pour étudier le développement des DC à partir de différents projecteurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des PC in vitro à partir de CLP en utilisant un système C six BEAT.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

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In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6 (Vidéo) | JoVE Journal

In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

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