In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode efficace pour générer des cellules dendritiques plasmacytoïdes ou PDC pour l'étude de leur développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que : Comment le développement des PDC est-il régulé ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'utiliser un petit nombre de cellules progénitrices pour générer efficacement de grandes quantités de PDC.

Les implications de cette technique concernent le traitement des maladies auto-immunes associées au PDC, telles que le lupus systémique, l'athétose et le psoriasis. Pour démontrer la procédure aujourd'hui, Xang, un excellent étudiant du laboratoire, va semer la veille du prélèvement des cellules de moelle osseuse, 5,9 × 10⁴ cellules de la lignée cellulaire stromale AC6 par puits dans des puits individuels de plaques de 12 puits, puis incuber les plaques à 37 °C et 5 % CO₂ pendant la nuit. Le lendemain matin, irradier les cellules AC6 avec un rayonnement gamma à 3000 rad et remplacer le milieu de culture par un millilitre de milieu complet.

Placez ensuite le nombre approprié de souris adultes de type sauvage C57 black six dans un plateau de dissection et stérilisez les animaux avec de l'éthanol à 70 %. Puis, déplacez le plateau sous une hotte semi-stérile et pratiquez des incisions au niveau de l'abdomen médian de chaque animal, enlevant la peau des parties distales, y compris des membres inférieurs, afin d'exposer le fémur et le tibia. Coupez le fémur au-dessus et le tibia en dessous des articulations du genou, puis utilisez des ciseaux pour détacher les muscles des os au fur et à mesure de leur collecte. Placez les os dans une boîte de Pétri de six centimètres contenant cinq millilitres de RPMI complet et transférez la boîte de Pétri sous une hotte de culture stérile.

Remplissez maintenant une seringue de trois millilitres équipée d'une aiguille de calibre 27 avec du RPMI complet et utilisez des ciseaux pour couper les deux extrémités de chaque os. Insérez l'aiguille dans chaque os et rincez la moelle par une injection douce de RPMI complet, une fois par chaque extrémité. Ensuite, sans l'aiguille, aspirez et redistribuez doucement les cellules trois à cinq fois dans la boîte de culture afin d'obtenir une suspension monocellulaire.

Après avoir centrifugé les cellules, lysez les globules rouges avec un millilitre de tampon CK, puis arrêtez la réaction avec 10 volumes de RPMI complet. Après une minute, laissez les agrégats de cellules mortes et les débris sédimenter pendant cinq minutes, puis versez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube. Ensuite, après avoir à nouveau centrifugé les cellules, nous suspendons les cellules totales de la moelle osseuse dans 100 microlitres de tampon fax afin d'analyser les progéniteurs lymphoïdes communs ou CLPs par cytométrie en flux.

Ensuite, bloquer les cellules en présence d’un anticorps anti-CD16 à 32 pendant une à deux minutes, suivie d’une coloration simultanée des cellules avec le mélange d’anticorps approprié. Après 15 minutes sur glace, laver les cellules dans trois millilitres de tampon fax et remettre en suspension le culot dans 300 microlitres de tampon fax frais. Puis filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de 40 micromètres et trier immédiatement les cellules sur un cytomètre en flux en utilisant les filtres et les tensions appropriés.

Prélevez les cellules d'intérêt dans un tube de 15 millilitres contenant huit millilitres de RPMI complet. Pour générer une population PDCM fortement enrichie, il est essentiel de trier la population appropriée de CLP parmi les cellules de moelle osseuse récoltées, en vue de leur culture in vitro à l'aide d'un système d'alimentation Z six. À la fin du tri, centrifugez les cellules et remettez en suspension le culot de cellules CLP avec suffisamment de RPMI complet pour obtenir une densité cellulaire d'environ cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par millilitre.

Ensuite, ensemencez 500 cellules par puits dans la plaque de 12 puits contenant les cellules nourricières AC six et complétez les co-cultures avec 100 nanogrammes par millilitre de ligand FL trois, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec un suivi visuel périodique du développement des cellules dendritiques ou cellules DC au microscope. Au jour 12, récoltez les cellules présentes dans le surnageant de co-culture et lavez chaque puits une fois avec un demi-millilitre de milieu RPMI complet, regroupant le surnageant et les lavages obtenus. Ajoutez ensuite un demi-millilitre de milieu frais dans chaque puits et utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules adhérentes.

Combiner les cellules détachées avec les cellules en suspension et centrifuger la suspension cellulaire obtenue. Resuspendre le culot dans 50 µL de tampon fax. Puis compter les cellules et les marquer pour l'expression de CD11c, CD11b et B220 après blocage FC.

Comme vient de l'être démontré, les cellules en co-culture peuvent ensuite être analysées pour la présence de cellules dendritiques conventionnelles CD11c+, CD11b+, B220−, et plasmacytoïdes CD11c+, CD11b−, B220+, pour un total de quatre à six fois dix puissance sept. Les cellules de moelle osseuse sont généralement isolées à partir des fémurs et des tibias d'une souris sauvage de type C57BL/6 âgée de six à huit semaines, cinq fois dix puissance quatre CLP étant couramment obtenus à partir d'une seule souris C57BL/6. Après tri par cytométrie en flux, comme vient d'être démontré, entre les jours trois et quatre de co-culture avec des cellules nourricières AC6, des cellules formant des zones en pavé commencent à apparaître, les cellules dendritiques plasmacytoïdes de forme ronde apparaissant en suspension au-dessus des cellules formant des zones en pavé.

Vers le huitième jour, le nombre de DC plasmacytoïdes atteint un pic aux alentours des jours 12 à 14, moment auquel les cellules commencent à subir un processus d'apoptose après leur développement complet, et leur nombre commence progressivement à diminuer. Les colonies de DC conventionnels apparaissent plus tard, entre le sixième et le huitième jour, et sont adhérentes, avec une morphologie allongée en fuseau. Une analyse en cytométrie en flux montre que les cocultures sont constituées à 91 % de DC plasmacytoïdes CD11c positifs, CD11b négatifs, B220 positifs et à 6 % de DC conventionnels CD11c positifs, CD11b positifs, B220 négatifs, révélant ainsi une expansion de 100 fois du nombre de DC plasmacytoïdes par rapport à la population initiale de CLP par cette méthode.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer que la cellule a c six est en bon état et que la densité de C est correcte avant d'ajouter le clp après un développement. Cette technique a permis aux chercheurs en biologie des DC de surmonter la limitation liée à l'utilisation d'un petit nombre de projecteurs pour étudier le développement des DC à partir de différents projecteurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des PC in vitro à partir de CLP en utilisant un système C six BEAT.