Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules T périphériques humains à l'aide de virus Sendai dans des conditions libres Feeder-

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites ou IPC à partir de cellules T périphériques humaines dans des conditions exemptes de nourrisseurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, notamment comment les cellules IPS peuvent être appliquées à une utilisation clinique. Le principal avantage de cette technique est que les cellules IPS peuvent être guéries sans l’inclusion d’un éventuel refactorion des dommages, ce qui réduit le risque de pathogénicité.

L’implication de cette technique étend les thérapies à base de cellules IPS cliniquement pertinentes à l’échelle mondiale en raison de l’échantillonnage cellulaire invasif combiné à la réduction du risque d’exposition des cellules IPS en développement à des agents pathogènes indéfinis. Ainsi, cette méthode peut fournir un aperçu de la thérapie clinique du service IPS. Il peut également être appliqué à d’autres domaines tels que les conditions de modélisation des maladies.

Commencez à préparer les lymphocytes T humains activés en diluant 10 millilitres de sang total hépariné avec 10 millilitres de pipette DPBS. 15 millilitres de solution fol dans un tube conique de 50 millilitres. Pipetez lentement le sang dilué qui coule le long de la paroi intérieure du tube pour le superposer sur la solution.

Attention à ne pas perturber l’interface. Centrifugez le tube à 400 fois G pendant 30 minutes à température ambiante. Après centrifugation, observez trois couches, dont une couche inférieure claire : une fine couche blanche contenant des cellules mononucléées et une couche supérieure de plasma laiteux.

Transférez la couche de cellule mononucléaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres sans transférer de solution de trou d’ajustement. Ensuite, ajoutez du DPBS pour porter le volume total à 10 millilitres. Centrifugez le tube à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante.

Jetez le surnageant, lavez les cellules avec 10 millilitres de DPBS, centrifugez le tube à 200 fois G pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu KBM 5 0 2 aux cellules et comptez à l’aide d’un hémocytomètre pour préparer la boîte de culture cellulaire, enduire les puits d’une plaque à six puits avec 10 microgrammes par millilitre de solution d’anticorps anti-CD 3 humain dans du PBS. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 30 minutes.

Après l’incubation, retirer la solution d’anticorps de la plaque huit et laver une fois avec des graines de PBS les cellules mononucléées à une densité de 2,5 fois 10 à la cinquième cellules par centimètre carré dans un volume total de deux millilitres de milieu KBM 5 0 2 dans les plaques à six puits enrobées incuber les cellules pendant trois à sept jours sans changer de milieu, à ce moment-là, les lymphocytes T devraient atteindre la concubinescence après les trois à sept jours. Transférez les cellules T activées avec un milieu dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 200 fois G pendant cinq minutes. Retirez le SNAT et ajoutez un millilitre de KBM 5 0 2 medium frais.

Comptez les cellules et la plaque 1,5 fois 10 puissance six cellules dans deux millilitres de milieu KBM 5 0 2 dans chaque puits d’une plaque à six puits enrobée d’anti CD, puis décongelez les solutions de virus OC trois SOX deux, KLF quatre et C-M-Y-C-H, et L sendi sur glace à chaque virus Sendai modifié individuellement à chaque puits et une multiplicité d’infection de 10. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Ensuite, collectez les cellules infectées à l’aide d’une pipette et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifugez les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ajoutez deux millilitres de milieu KBM 5 0 2 frais. Replacez les cellules dans les puits d’une plaque à six puits et incubez pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire.

Pour rétracter les cellules, décongelez d’abord la solution de matrice de membrane basale à quatre degrés Celsius pendant la nuit, dissolvez 0,2 millilitre de la solution pensée dans 10 millilitres de DMM F 12 plaque moyenne, cinq millilitres de la solution de matrice de membrane basale dans des boîtes de 100 millimètres. Laissez les plaques à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour permettre à la matrice d’enrober le plat avant d’ensemencer les cellules. Pendant ce temps, prélevez les lymphocytes T infectés par le virus SAI dans un tube conique de 15 litres et centrifugez-les à 200 fois G pendant cinq minutes.

Ensuite, suspendez le palais dans un millilitre de milieu frais KBM 5 0 2 et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre après la période d’incubation de 30 minutes. Retirer la solution matricielle de la membrane basale des deux plaques, puis remettre en suspension une fois 10 à la cinquième cellule et séparément une fois 10 à six cellules dans 10 millilitres de milieu frais M-T-E-S-R, un milieu de culture exempt de cellules nourricières pour ipsc. Pipetez chaque suspension de cellule sur une plaque séparée de 100 millimètres.

Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Changer de support tous les deux jours après 20 à 30 jours. Des colonies qui ressemblent à des colonies de cellules souches embryonnaires devraient apparaître.

Préparez six plaques murales pour l’expansion IPSC en incubant un millilitre de solution de matrice de membrane basale dans chaque puits pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, visualisez les plaques de culture contenant des colonies IPSC au microscope stéréoscopique et isolez les colonies individuelles en les grattant avec une pipette de 20 microlitres. Transférez chaque colonie dans un puits et une plaque murale de 96 contenant 20 microlitres de milieu M-T-E-S-R.

Après avoir transféré les colonies, ajoutez 200 microlitres de milieu M-T-E-S-R dans chaque puits et pipetez de haut en bas pour perturber la colonie. Après avoir retiré la solution de matrice de membrane basale des six plaques de puits, transférez les cellules d’une colonie individuelle à chaque puits, puis ajoutez deux millilitres de milieu M-T-E-S-R, incubez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire et changez de milieu tous les deux jours en utilisant une culture sans feeder et un milieu sans sérum. La coloration immunofluorescente a révélé l’expression de marqueurs cellulaires pluripotents typiques, notamment nano T trois quatre SSEA quatre, TRA un 60 et TRA 180 1.

Dans ces lignes IPSE dérivées. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer toutes les étapes, en tenant compte de toutes les considérations importantes de stérilité et de biosécurité.