Name: Quantification des souches du côlon mutations de cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Apprenez à quantifier les mutations somatiques du gène G6PD dans les cellules souches coliques de souris traitées avec des agents génotoxiques. Cette méthode histologique permet d'évaluer la fréquence mutationnelle et les effets génotoxiques.

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Les auteurs ont pas accusés de réception.

Les procédures expérimentales et traitement éthique des animaux a été approuvé par l&#39;Université de Pittsburgh IACUC (protocole # 1104674). 1. Préparation de la G6PD coloration Mélange NOTE: Assurez-vous que la concentration finale de chacun des réactifs est la suivante; 5 mM de glucose-6-phosphate (G6P); 2 mM de NADP, 5 mM de MgCl2, 1 mM de 0,35-méthoxy-5-méthylphénazinium sulfate de méthyle (MMPMS) et 0,8 mM NBT. 1,8,9 Pour chaque réactif, la concentration initiale a été obtenue pour un 40 ml de volume final. Des solutions ont été fraîchement préparés et utilisés chaque jour. <ol><li> Ajouter 2 ml de 200 mM pH 7,4 tampon phosphate (PB) à 35 ml de milieu PTOM un tube de 50 ml et agiter vigoureusement. Confirmez avec du papier pH que la solution est d&#39;environ pH 7,4. Si jetez pas la solution. </li><li> Ajouter 61 mg G6P dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg PNDA dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, et 41 mg de MgCl2 dissous dans 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmons que le pH est de 7,4 ~ esprith papier pH. Sinon ~ 7.4, jeter la solution. </li><li> Ajouter 5 mg de MMPMS dissous dans 0,25 ml de PB 200 mM (pH 7,4). Agiter vigoureusement le mélange réactionnel résultant pour générer un homogénat rouge foncé clair. Si la solution est trouble, le mélange doit être jetée. Le tube contenant le mélange de réaction est enveloppé dans une feuille de minimiser l&#39;exposition à la lumière. Stocker le mélange réactionnel à la température ambiante tandis que le composant final, NBT, est préparé. </li><li> Préparer séparément une solution NBT 5 mM en ajoutant 0,4 ml de formamide de diméthyle (DMF) anhydre et 0,4 ml d&#39;éthanol anhydre à 164 mg de NBT dans un tube de 2 ml avec un couvercle joint torique. Fermez le couvercle lâche (non étanche) et porter la solution à ébullition vigoureuse dans un bain d&#39;huile jusqu&#39;à ce que le NBT est en solution. 8 </li><li> Laisser le NBT solubilisé refroidir à température ambiante puis ajouter toute la solution au mélange de réaction PTOM et agiter vigoureusement pour obtenir une solution claire. Observez le changement de couleur de la solution de rouge-orange initial à un rouge foncé ou purpLe couleur au fil du temps. C&#39;est normal. </li><li> Placez le mélange final G6PD de coloration dans un 37 ° C pièce chaude pendant 1 heure avant utilisation. </li></ol> 2. Traitement des animaux et de collecte de tissus <ol><li> Traiter six semaines d&#39;âge souris C57BL / 6 mâles avec un agent endommageant l&#39;ADN, par exemple, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) dans un volume de 200 ul de PBS par injection ip. Traiter les souris témoins avec 200 ul de PBS par injection ip. </li><li> À 90 jours, euthanasier les souris par le CO 2 asphyxie suivie par dislocation cervicale tel qu&#39;approuvé par le protocole IACUC. </li><li> Chirurgicalement ouvrir la cavité abdominale juste au-dessus de l&#39;anus de la base du sternum. Déplacer l&#39;intestin grêle hors de la cavité du corps, mais elle ne exciser. Exciser l&#39;intestin grêle juste en dessous du cæcum au rectum. 10 </li><li> Découper soigneusement le long d&#39;un côté du côlon en utilisant une paire de ciseaux micro-dissection et enlever les matières fécales du côlon ouvert propre par lavage avec du PBS stérile. Swiss roll le accised côlon avec la face luminale tournée vers l&#39;extérieur, et le placer dans un moule de tissu. 10 </li><li> Immerger complètement le côlon dans un PTOM, moyen et lieu moule dans un Dewar contenant de l&#39;azote liquide 2. Tenez le moule de sorte que la base en plastique est juste en contact avec le liquide N 2 jusqu&#39;à ce que le moyen PTOM gelé. </li><li> Rangez le bloc de tissu congelé à -80 ° C jusqu&#39;à la coupe des coupes congelées. Ne pas utiliser de fixateur, ce qui donnerait lieu à l&#39;inactivation de l&#39;enzyme de la G6PD. </li></ol> 3. Préparation des sections congelées <ol><li> Couper des sections de tissus congelés à une épaisseur de 7 pm en utilisant un cryostat à -25 ° C. Couper 4 7 um sections consécutives et placer deux d&#39;entre eux sur la même lame (Figure 1). Préparez 2 toboggans, quatre ou 7 um sections consécutives pour représenter un niveau du côlon (Figure 1). </li><li> Répéter pour le prochain niveau avec une distance minimale de&gt; 50 um à partir de la dernière section de la prEvious niveau. Cette distance est assuré que les cryptes évalués pour chaque niveau ne reproduisent pas les uns les autres. </li><li> Foire essuyer la lame de cryostat avec 100% d&#39;éthanol pour enlever le résidu des PTOM qui accumule pendant la coupe. Avant de sectionnement est reprise, la lame sec est essuyée avec une feuille sèche antistatique pour dissiper la charge statique accumulée. Stocker les lames avec les coupes congelées à -80 o C. </li></ol> 4. La coloration des tissus congelés Section <ol><li> Effectuer la réaction enzyme histochimie dans un 37 ° C chambre chaude avec une humidité élevée. REMARQUE: Tenter la réaction enzymatique dans un four d&#39;incubation ou sur une plus chaud de diapositives a conduit à une mauvaise et incohérente coloration en G6PD. </li><li> Construire des puits pour la coloration des tissus en utilisant deux 1,5 cm x 0,15 cm rondelles d&#39;acier (diamètre intérieur x hauteur) qui sont collées ensemble avec de la graisse de silicone (Figure 1). Couper le parafilm pour correspondre à la base du puits avec le centre découper et le lieu de biend sur la coupe de tissu sur la diapositive. Remarque: le parafilm sur le fond de la rondelle crée un joint entre le coulisseau et la rondelle qui maintient le mélange visqueux G6PD de coloration sur la coupe de tissu. Cette construction donne une bien avec un 0,4 - 0,5 ml de volume de sorte que chaque section de tissu dans l&#39;étude reçoit le même volume du mélange de réaction de coloration de la G6PD. </li><li> Incuber les lames de tissus congelés à 37 o C dans une pièce chaude pendant 10 min. A 37 ° C, ajouter le mélange de réaction G6PD de coloration à chaque section de tissu puits (2 sections par lame) pour 45-50 min. Retirer les lames de pièce chaude, et soulevez délicatement les puits en acier inoxydable au large des diapositives. </li><li> Ensemble lames sur leur grand côté pour permettre au milieu réactionnel au drain. Placer les lames dans 100 mM PB (pH 7,4) pendant 30 à 60 minutes pour éliminer le mélange de réaction G6PD de coloration du tissu sans perturber la coloration des tissus. Plonger les lames dans de l&#39;eau distillée pendant 5-10 min pour éliminer les sels PB </li><li> Sceller le tissu par adjonctioning fluoro-gel à partir d&#39;un compte-gouttes sur le tissu et d&#39;attente ~ 30 min pour le sécher. Éviter les bulles qui peuvent confondre l&#39;identification des cryptes mutés. Remarque: si des bulles se forment, la procédure peut être répétée après enlèvement de la fluoro-gel par trempage dans de l&#39;eau distillée. Ne pas utiliser des lamelles comme ils ont tendance à bulles d&#39;air piège. </li></ol> 5. Détermination de la G6PD Mutant cryptes et Mutation Fréquence <ol><li> Analyser diapositives pour G6PD cryptes mutantes sous un microscope optique. REMARQUE: Les critères utilisés pour identifier une crypte entièrement mutant étaient: (i) la totalité de la crypte était dépourvue de couleur bleue; (ii) la structure externe de la crypte était intact, (iii) le mutant a été observé crypte de 7 um sections adjacentes et, (iv) deux observateurs ont pour identifier le même crypte comme un mutant. Mutants observés sur 7 um sections adjacentes sont comptés comme un seul mutant. </li><li> Chaque image crypte mutant G6PD à un grossissement de 40x et de cataloguer les images à l&#39;aide d&#39;un appareil photo 5,0 mégapixels avecun logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Quantifier le nombre total de cryptes examinés dans une souris en sélectionnant une section représentant pour chaque souris à partir du niveau de la surface plus petite et de l&#39;image au moment de grossissement de 10x (figure 1C). REMARQUE: Un niveau représente quatre 7 um sections consécutives (figure 1D), qui en raison de leur proximité montrent souvent mutés cryptes sur plus d&#39;une section. Les niveaux sont séparés par&gt; 50 um à visualiser cryptes de différentes régions du côlon. </li><li> Ouvrez chaque fichier image et comptez visuellement le nombre de cryptes sur un niveau en analysant les fichiers (représentées par des cases dans la figure 1C). Fichiers Images varient dans le nombre de cryptes observées d&#39;aussi peu que 20 à&gt; 300 cryptes dans un seul fichier. </li><li> Multipliez le nombre total des cryptes du niveau sélectionné (figure 1C) pour chaque souris par le nombre de niveaux de dépistage du G6PD cryptes mutantes pour chaque colon. Par exemple, un nombre total de1250 cryptes par niveau choisi multiplié par 8 niveaux projetés pour cryptes mutantes est égal à un nombre total de 10.000 cryptes. Évaluer un minimum de 10.000 cryptes pour chaque colon pour l&#39;analyse statistique. </li><li> Combinez le nombre de mutants observés dans tous les animaux par le nombre total de cryptes projetés pour calculer le MF pour chaque traitement. Le niveau MF de cellules souches de fond dans les souris non traitées est &lt;0.1x10 -4 (tableau 1), qui est proche de celle précédemment rapportée dans C57BL / 6. 11 </li></ol>

<ol><li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li>
<li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li>
<li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+%28g6pd%29+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry%3A+a+consumer%E2%80%99s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li>
<li>Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li>
<li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li>
<li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+%28DSS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li>
<li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li>
<li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li>
<li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon%3A+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Souvent l&#39;effet génotoxique d&#39;un composé est déterminée par sa capacité à modifier l&#39;ADN. Cela se fait normalement en isolant le tissu et la mesure du niveau global d&#39;adduits d&#39;ADN. Pour AOM, cela impliquerait quantifier O 6 -méthylguanine adduits dans le côlon. En utilisant cette information d&#39;approche sur les dommages dans des types cellulaires spécifiques, comme dans la niche de cellules souches, est perdu. En outre, un produit d&#39;addition d&#39;ADN est pas de même d&#39;une muta...

Le cancer du côlon est pensé pour impliquer une exposition à des agents environnementaux et composants alimentaires qui peuvent endommager l&#39;ADN et de produire des mutations activatrices somatiques dans oncogènes (par exemple, la ß-caténine) ou d&#39;inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple, APC). On suppose que ces mutations se produisent dans les cellules critiques souches du côlon. En raison de l&#39;architecture de la crypte unique de l&#39;épithélium du côlon, il est possible de mesurer des mutations de cellules souches dans le côlon après avoir exposé les animaux à des produits chimiques associés à la cancérogenèse colique. Plusieurs enzymes liées au chromosome X peuvent servir d&#39;indicateurs pour des mutations qui se produisent dans les cellules souches, comme les mutations seront présentes dans toutes les cellules au sein d&#39;une crypte. Auparavant, une procédure a été publiée démontrer que les produits chimiques qui induisent des tumeurs du côlon chez les souris générées également des mutations de cellules souches somatiques dans le côlon par l&#39;intermédiaire d&#39;une analyse de mutations de la glucose-6-phosphate déshydrogénase liée à l&#39;X (G6PD) gène 1-3.La méthode quantifie l&#39;incidence des mutations somatiques aléatoires dans les cellules souches du côlon sans aucune pression de sélection. La procédure implique la production de sections congelées non fixées du côlon de souris traitées et de contrôle et l&#39;identification des cryptes dépourvues de cellules qui produisent l&#39;activité de la G6PD fonctionnel. Ces cryptes mutées, qui apparaissent blancs, indiquent que la mutation a eu lieu dans une cellule souche qui a donné lieu à une progéniture hébergeant également gène G6PD mutant. Dans le dosage enzymatique, G6PD mutant déficient cryptes peuvent pas oxyder le glucose-6-phosphate, qui est nécessaire pour la réduction du nitro bleu de tétrazolium (NBT). Lorsque l&#39;enzyme est fonctionnelle en G6PD, le NBT dans le mélange de coloration est réduite à formazan insoluble et précipités, l&#39;accumulation à l&#39;emplacement de l&#39;enzyme et des cellules &quot;bleues&quot; de coloration. Les cellules qui sont des mutants de la G6PD restent blanchâtre à la différence de cryptes colorés bleus de type sauvage. Cette méthode permet de mesurer les mutations qui ont un phénotype «nulle». Parce que enenzymes, comme la G6PD, peut diffuser hors des cellules sur une section de tissu non fixé si les articles sont placés dans une solution aqueuse, il est nécessaire de stabiliser l&#39;enzyme dans les sections de tissu à analyser. 4 La stabilisation de l&#39;enzyme dans le le tissu ne doit pas interférer avec la diffusion de petites molécules nécessaires à la réaction enzymatique en G6PD de réactifs. Nous avons fait un certain nombre de changements importants dans la procédure initiale. Le milieu pour la coloration enzymatique critique a été modifié à partir de l&#39;alcool polyvinylique à Optimal Cutting Température composé (OCT), ce qui facilite le contrôle du pH et la solubilisation des composants utilisés dans l&#39;essai. La coloration est effectuée en utilisant 0,4 - 0,5 ml puits en rondelles en acier de sorte que chaque section de tissu a reçu le même volume de mélange de réaction de la G6PD. Une procédure a été développée pour estimer le nombre de cryptes dans une section imagée qui fournit un grand échantillonnage du tissu du côlon, sans avoirde compter manuellement&gt; 10 5 cryptes pour chaque colon. L&#39;analyse des coupes de tissus adjacents 7 um permet la visualisation d&#39;une crypte mutant sur plus d&#39;un coulisseau, ce qui permet de réduire des artefacts de coloration potentiels. Ces changements rendent la procédure plus efficace et reproductible. En utilisant ce protocole révisé, nous avons quantifié la fréquence de mutation dans les cellules souches du côlon après exposition des souris C57BL / 6 à azoxyméthane, un cancérogène du côlon bien connu chez les rongeurs. 5-7

<table><tbody><tr><td>réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroblue, tétrazolium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, glucose-6-phosphate</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>1-méthoxy-5-méthylphénazinium</td>, sulfate de méthyle<td></td><td></td><td></td></tr>, tampon <tr><td>de phosphate de diméthylformamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Composé à température de coupe optimale (OCT)&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope optique équipé d’une caméra</td><td></td><td></td><td></td>de 5 mégapixels</tr><tr><td>cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>salle chaude</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification des souches du côlon mutations de cellules

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches est un outil puissant pour quantifier dans une population de cellules critique si, et dans quelle mesure, un produit chimique peut induire des mutations qui conduisent potentiellement à un cancer. L&#39;utilisation d&#39;un dosage enzymatique pour quantifier des mutations de cellules souches dans le gène de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase liée au chromosome X a été indiqué précédemment. 1 Ce procédé nécessite la préparation de coupes congelées et incubation du tissu sectionné avec un mélange de réaction qui donne un couleur bleue si les cellules produisent fonctionnelle glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) enzyme. Si non, les cellules apparaissent blanchâtres. Nous avons modifié le mélange réactionnel en utilisant Optimal Cutting Temperature composé (OCT) moyen à la place de l&#39;alcool de polyvinyle. Ceci facilite la mesure de pH, augmente la solubilisation des composants de coloration de la G6PD et limite la diffusion de l&#39;enzyme G6PD. Pour démontrer que la mutation a eu lieu dans une cellule souche, l&#39;ensemble doit crypte manque G6PD enzymatiqueactivité. Seulement si une cellule souche abrite une mutation G6PD phénotypique sera tout de la descendance dans la crypte manquer activité enzymatique en G6PD. Pour identifier les cryptes avec une mutation de cellules souches, quatre coupes congelées adjacentes consécutives (un niveau) ont été coupées à 7 um d&#39;épaisseur. Cette approche de faire des coupes adjacentes conformation qui fournit une crypte a été entièrement muté depuis la même crypte muté sera observée dans les sections adjacentes. Diapositives avec des échantillons de tissus qui étaient plus de 50 um part étaient prêts à évaluer d&#39;un total de&gt; 10 4 cryptes par souris. La fréquence de mutation est le nombre de mutés (blanc) cryptes Observée ÷ par le nombre de type sauvage (bleu) cryptes dans un groupe de traitement.

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches du côlon chez les animaux offre un moyen unique de corréler des mutations à l&#39;induction du cancer. Normalement, il est supposé que l&#39;étape critique dans la carcinogenèse implique l&#39;activation des mutations dans des oncogenes et / ou inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs. Nous avons injecté souris C57BL / 6 avec 200 pl de PBS ou de 10 mg / kg AOM dans 200 ul de PBS. AOM est un cancérogène du côlon connue. 5-7 à 90 jou...

Nous rapportons des améliorations significatives pour la mesure reproductible des mutations somatiques des cellules souches du côlon après exposition de souris à des agents potentiellement dommageables de l’ADN.

Quantification des souches du côlon mutations de cellules

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les mutations somatiques phénotypiques dans le gène de la glucose six phosphate déhydrogénase ou G6PD dans les cellules souches coliques. Après traitement des animaux avec des agents génotoxiques présumés, on commence par traiter les animaux avec l'agent, attendre un délai approprié permettant aux descendants d'une cellule souche portant une mutation du gène G6PD de coloniser entièrement une crypte, sacrifier l'animal, retirer le côlon, le rouler en « Swiss roll » et congeler le tissu dans l'azote liquide. La deuxième étape consiste à préparer des coupes congelées de sept micromètres d'épaisseur sur des lames à partir du côlon à l'aide d'un cryostat.Le tissu est réchauffé à 37 degrés Celsius, puis des puits par coloration de tissu sont réalisés autour des sections de tissu. La dernière étape consiste à incuber les sections de tissu avec le mélange de coloration de la G6PD, puis à analyser les sections au microscope optique : les cellules présentant une activité de la G6PD se colorent en bleu, tandis que celles portant des mutations phénotypiques apparaissent de couleur blanchâtre. Enfin, la quantification des crips mutés permet de déterminer la fréquence des mutations.Cette technique mesure les mutations somatiques du gène de la glucose six phosphate déshydrogénase dans les cellules souches, qui constituent la population cellulaire critique dans la cancérogenèse colorectale. En identifiant les mutations somatiques des cellules souches, il est possible de corréler la fréquence des mutations aux cas de cancer du côlon chez les animaux traités. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les mutations des cellules souches dans le côlon, elle peut également être appliquée à d'autres organismes modèles ou systèmes organiques.Si un compartiment des cellules souches peut être identifié, en général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés lors de la préparation de la solution de MBT. La solubilisation. La solution de MBT exige une attention particulière aux instructions détaillées. Pour commencer la préparation de la solution de coloration histologique, ajouter deux millilitres de tampon phosphate à pH 7,4 à 35 millilitres de milieu optimal pour la coupe cryogénique, ou milieu OCT, dans un tube de 50 millilitres et agiter vigoureusement pour homogénéiser, en utilisant du papier pH.Constatez que la solution est approximativement à pH 7,4. Ensuite, ajoutez du glucose six phosphate et une solution de DP et de chlorure de magnésium dissoute dans un tampon phosphate comme indiqué dans le protocole du texte et vérifiez à nouveau que le pH de la solution reste approximativement à 7,4. AJOUTEZ la solution M-M-P-M-S et mélangez vigoureusement.Cela devrait produire un homogénat clair de couleur rouge foncé ; envelopper la solution dans du papier d’aluminium pour minimiser l’exposition à la lumière. Si la solution devient trouble, elle doit être jetée pendant que le bain d’huile chauffe. Préparer séparément une solution de tétrazolium bleu nitreux ou MBT à cinq millimolaire en mélangeant 0,4 millilitre de diméthylformamide, 0,4 millilitre d’éthanol anhydre et du MBT dans un tube de deux millilitres avec un couvercle à joint torique, boucher le tube légèrement et le porter à ébullition vigoureuse dans le bain d’huile jusqu’à dissolution complète du MBT.Ensuite, laissez refroidir la solution de MBT à température ambiante, puis ajoutez-la au mélange réactionnel OCT. La solution peut changer de couleur, passant du rouge orangé initial à un rouge foncé ou violet au fil du temps. Après avoir traité les animaux et préparé les coupes congelées comme indiqué dans le protocole écrit, construisez des puits pour la coloration des tissus en utilisant deux rondelles métalliques collées ensemble avec de la graisse de silicone adaptée à la base de la rondelle, et retirez le centre où la solution sera déposée.Préchauffez les lames avec les sections de tissu congelé dans une pièce humide à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, placez les puits sur la lame de façon à entourer les sections de tissu, en ajoutant environ un demi-millilitre du mélange de coloration G6PD préparé précédemment dans chaque puits contenant une section de tissu, puis incubez de 45 à 50 minutes. Retirez les lames de la pièce chaude et retirez soigneusement les puits en acier inoxydable des lames.Placer les lames sur le bord long et éliminer le mélange réactionnel, suivi d'un lavage de 30 à 60 minutes dans un tampon phosphate 100 millimolaire. Pour éliminer les dernières traces de la solution de coloration G six PD, rincer les lames à l'eau déionisée pendant cinq à dix minutes afin d'éliminer le tampon phosphate résiduel. Enfin, sceller le tissu en ajoutant goutte à goutte du fluoro gel sur la lame et laisser sécher pendant 30 minutes avant d'acquérir les images destinées à une analyse ultérieure.Placer la lame sur un microscope optique et régler sur un grossissement de quatre DX. Ensuite, prendre des images de la coupe tissulaire colorée à l'aide d'une caméra de 5,0 mégapixels afin d'estimer le nombre total de cryptes examinés. Pour chaque souris, sélectionner une coupe au niveau de la plus petite surface et l'imaginer à un grossissement de 10 x.Compter le nombre de cryptes mutantes. Selon les critères suivants, la crypte entière est dépourvue de couleur bleue. La structure externe de la crypte est intacte.Le mutant est observé sur des sections adjacentes de sept micromètres, et deux observateurs identifient la même crypte comme étant mutante. Comptez visuellement le nombre de cryptes dans cette section et multipliez-le par le nombre de niveaux analysés pour chaque colon. Des exemples de cryptes mutantes observées chez des souris traitées avec l'agent endommageant l'ADN, l'azoxyméthane, sont visibles ici. À gauche, vous voyez une vue verticale ou de haut en bas d'une crypte mutante.Tandis que la vue de droite est une vue horizontale ou latérale, pour qu’un crypte soit déclaré mutant, toutes les cellules à l’intérieur du crypte doivent être présentes. Les cryptes blancs avec une petite quantité de blanc sont dus à la production de mucus par les cellules en goblet. La fréquence de mutation est calculée comme étant le nombre de mutants observés divisé par le nombre total de cryptes analysés sans mutant.Des crisps ont été observés dans les côlons de souris témoins, représentant une fréquence de mutation inférieure à une fois 10 à la puissance moins cinq, tandis que les souris traitées à l'azoxyméthane présentaient une fréquence de mutation des cellules souches de 4,44 fois 10 à la puissance moins quatre suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme l'analyse génétique du type de mutations de la glucose-6-phosphate déshydrogénase, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière dont l'agent chimique induit une erreur d'appariement lors de la mutation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les mutations des cellules souches somatiques chez des souris traitées avec des composés potentiellement mutagènes et cancérogènes.

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Research

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Expression réduite / absent du PMS2 et / ou ERCC1 dans des cryptes entière est un événement fréquent dans les 10 cm de chaque côté d'adénocarcinomes du côlon, probablement la base d'une anomalie du champ avec la mutabilité élevée et la progression vers le cancer. La carence en Ku86 ou CCOI est beaucoup moins fréquent dans ces anomalies du champ.

PMS2 insuffisantes, ERCC1, Ku86, CCOI des défauts sur le terrain pendant la progression du cancer du colon

Nous avons décrit une procédure pour la désagrégation du cancer colorectal (CCR) pour produire des cellules viables unique, qui sont ensuite saisies sur biopuces d'anticorps reconnaissant les antigènes de surface sur mesure (CRC DotScan micropuce). Les sous-populations de cellules lié à la puce peut être profilée par multiplexage de fluorescence à l'aide d'anticorps monoclonaux marqués avec des colorants fluorescents.

Colorectal Cancer Cell Surface Protein profilage utilisant une biopuces d&#39;anticorps et de multiplexage par fluorescence

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.

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