Quantification des souches du côlon mutations de cellules

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les mutations somatiques phénotypiques dans la glucose six phosphate déshydrogénase ou le gène G six dans les cellules souches du côlon. Après le traitement des animaux avec des agents génotoxiques présumés, cela est accompli en traitant d’abord les animaux avec l’agent en attendant un temps approprié pour permettre à la descendance d’une cellule souche porteuse d’une mutation G six de peupler complètement une crypte, en sacrifiant l’animal, en enlevant le côlon et en le formant en un rouleau suisse et en congelant le tissu dans de l’azote liquide. La deuxième étape consiste à préparer des coupes congelées de sept microns d’épaisseur sur des lames du côlon à l’aide d’un cryostat.

Le tissu est chauffé à 37 degrés Celsius, puis des puits par coloration tissulaire sont construits autour des sections de tissu. La dernière étape consiste à incuber les coupes de tissu avec le mélange de coloration G six, puis à analyser les coupes au microscope optique. Les cellules avec une activité G six colorent en bleu, tandis que celles avec des mutations phénotypiques apparaissent blanchâtres. En fin de compte, la quantification des crips mutés est utilisée pour déterminer la fréquence de mutation.

Cette technique mesure les mutations somatiques de la glucose six phosphate déshydrogénase dans les cellules souches, et il s’agit de la population cellulaire critique dans la carcinogenèse du côlon. En identifiant les mutations des cellules souches somatiques, il est possible de corréler la fréquence des mutations aux incidents de cancer du côlon chez les animaux traités. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les mutations des cellules souches dans le côlon, elle peut également être appliquée à d’autres organismes modèles ou systèmes d’organes.

Si une niche de cellules souches peut être identifiée, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront généralement du mal à préparer la solution MBT. Solubilisant. La solution MBT nécessite une attention particulière aux instructions détaillées. Commencer à préparer la solution de coloration histologique à deux millilitres de tampon phosphate de pH 7,4 à 35 millilitres de température de coupe optimale, ou un milieu OCT dans un tube de 50 millilitres et agiter vigoureusement pour combiner à l’aide de papier pH.

Confirmation que le pH de la solution est d’environ 7,4 - effectué. Ensuite, à l’aide de six phosphates de glucose et d’une solution de DP et de chlorure de magnésium dissoute dans un tampon de phosphate comme indiqué dans le protocole textuel, il a été confirmé que le pH de la solution reste d’environ 7,4. AJOUTER LA SOLUTION M-M-P-M-S et mélanger vigoureusement.

Cela devrait se traduire par un homogénat clair et rouge foncé enveloppant la solution dans du papier d’aluminium pour minimiser l’exposition à la lumière. Si la solution devient trouble, elle doit être jetée pendant qu’un bain d’huile chauffe. Séparément, préparez une solution de nitro-bleu de cinq millimolaires à téraz oléum ou MBT en mélangeant 0,4 millilitre de diméthylformamide, 0,4 millilitre d’éthanol anhydre et de MBT dans un tube de deux millilitres avec un couvercle à joint torique, fermez sans serrer le tube et portez-le à ébullition vigoureuse dans le bain d’huile jusqu’à ce que le MBT soit dissous.

Ensuite, laissez la solution MBT refroidir à température ambiante, puis ajoutez-la au mélange réactionnel OCT. La solution peut changer de couleur du rouge orangé initial à un rouge foncé ou violet au fil du temps. Après avoir traité les animaux et préparé les sections congelées comme indiqué dans le protocole de texte, construisez des puits pour la coloration des tissus à l’aide de deux rondelles en acier collées ensemble avec de la graisse de silicone, ajustez le parfum à la base de la rondelle et découpez le centre où la solution sera placée.

Avant la guerre, le tissu congelé glisse dans une pièce humide à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, placez les puits sur la lame pour entourer les sections de tissu à environ un demi-millilitre du mélange de coloration G six précédemment préparé dans chaque puits de section de tissu et incubez pendant 45 à 50 minutes. Retirez les lames de la pièce chaude et retirez délicatement les puits en acier inoxydable des diapositives.

Placez les lames sur le bord long et égouttez le mélange de mélange réactionnel, suivi d’un lavage de 30 à 60 minutes et d’un tampon de phosphate de 100 millimolaires. Pour éliminer les dernières traces de la solution de coloration G six, rincez les lames et l’eau déminéralisée pendant cinq à 10 minutes pour éliminer le tampon de phosphate résiduel. Enfin, scellez le tissu en ajoutant du gel fluoré goutte à goutte à la lame et séchez pendant 30 minutes pour acquérir des images pour une analyse ultérieure.

Placez la lame sur un microscope optique et ajustez-la à un grossissement de quatre DX. Prenez ensuite des photos de la coupe de tissu coloré avec un appareil photo de 5,0 mégapixels pour estimer le nombre total de cryptes examinées. Pour chaque souris, sélectionnez une section dans le niveau avec la plus petite surface et imagez-la avec un grossissement de 10 x.

Comptez le nombre de crips mutants. Selon les critères suivants, l’ensemble de la crypte est dépourvu de couleur bleue. La structure extérieure de la crypte est intacte.

Le mutant est observé sur des sections adjacentes de sept microns et deux observateurs identifient la même crypte comme mutante. Comptez visuellement le nombre de cryptes dans cette section et multipliez par le nombre de niveaux filtrés pour chaque deux-points. Des exemples de Crips mutants observés chez des souris traitées avec l’agent endommageant l’ADN, l’azoxyméthane peuvent être vus ici, à gauche, vous voyez une vue verticale ou de haut en bas d’une crypte mutante.

Alors que sur la droite se trouve une vue horizontale ou latérale, pour qu’une crypte soit déclarée mutante, toutes les cellules à l’intérieur de la crypte doivent rester. Les cryptes blanches avec une petite quantité de blanc sont dues à la production de mucus à partir de cellules caliciformes. La fréquence des mutations est calculée en divisant le nombre de mutants observés par le nombre total de cryptes non contrôlées.

Des Crips ont été observés dans le côlon de souris témoins, représentant une fréquence de mutation inférieure à une fois 10 à moins cinquième, tandis que des souris traitées à l’azoxyméthane ont montré une fréquence de mutation des cellules souches de 4,44 fois 10 à moins quatre. D’autres méthodes, comme l’analyse génétique du type de mutations glucose x phosphate déshydrogénase, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont l’agent chimique code à tort pour une mutation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les mutations des cellules souches somatiques chez les souris traitées avec des composés potentiellement mutagènes et cancérigènes.