Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

L'objectif général de cette procédure est de suivre la progression du cycle cellulaire de cellules souches neuronales triées et de leurs progénies isolées de la zone sous-ventriculaire de souris transgéniques exprimant une fluorescence d'ubiquitination du cycle cellulaire, appelées souris FCI. Cela est réalisé en disséquant d'abord la zone sous-ventriculaire de cerveaux de souris adultes transgéniques. La deuxième étape consiste à dissocier le tissu neuronal en une suspension monocellulaire à l'aide d'un traitement à la papaïne.

Ensuite, les différentes populations cellulaires neurogènes de la zone subventriculaire sont marquées à l'aide d'anticorps afin d'identifier les cellules souches neuronales quiescentes, les cellules souches neuronales activées, les cellules amplifiantes transitoires, ainsi que les neuroblastes immatures et en migration. La dernière étape consiste à utiliser la cytométrie en flux pour trier directement les cellules dans un milieu de culture frais avant de les mettre en culture sur des plaques revêtues de poly-D-lysine. Enfin, une microscopie vidéo à laps de temps continue est utilisée pour étudier la progression du cycle cellulaire des cellules en culture, les différentes cellules transgéniques présentant une fluorescence à des moments distincts de leur cycle cellulaire.

La combinaison de la technique de tri cellulaire avec la technologie Fuji permet la visualisation et l'isolement des différentes populations cellulaires de la zone sous-ventriculaire, ce qui rend possible l'étude des propriétés et de la dynamique dans le cerveau en mouvement de l'adulte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le contexte du vieillissement et des pathologies cérébrales. La veille de l'expérience, ajouter environ 200 microlitres d'une solution de poly-D-lysine à 10 microgrammes par millilitre dans chaque puits d'une plaque stérile de 96 puits à parois noires afin de recouvrir le fond des puits ; couvrir la plaque et l'incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Retirer la solution de poly D-lysine et rincer les puits trois fois avec de l’eau distillée stérile, puis laisser sécher la plaque dans la hotte à flux laminaire pendant au moins deux heures. Si elle n’est pas utilisée immédiatement, conserver la plaque recouverte sèche à quatre degrés Celsius pendant un maximum de sept jours.

Ensuite, préparez la solution de dissociation à la papaine et stérilisez-la en faisant passer le mélange à travers un filtre de 0,2 micron. Réchauffez préalablement la solution à 37 degrés Celsius avant utilisation. Préparez également une solution d'inhibiteur de protéase en ajoutant 0,7 milligramme par millilitre de trypsine dans un inhibiteur de type deux au milieu TM F 12 stérile.

Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 micron et préchauffez-la à 37 degrés Celsius avant utilisation. Placez la zone ventriculaire subépendymaire fraîchement disséquée provenant du cerveau d’une souris adulte fucci rouge dans une boîte de Pétri contenant 0,6 % de glucose dans du PBS, puis hachez le tissu jusqu’à ce qu’il ne reste aucun gros morceau. Ensuite, transférez l’ensemble dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 200 × g pendant cinq minutes.

Une fois que le tissu a été mis en pellet, éliminer le surnageant et le resuspendre. Suspendre le tissu dans un millilitre de papain préchauffé, supplémenté avec 0,01 milligramme par millilitre de dna.One. Incuber le mélange pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Ensuite, centrifuger à nouveau à 200 × g pendant cinq minutes et éliminer le surnageant. Ajouter un millilitre de la solution OVO MOID préchauffée pour arrêter la digestion enzymatique. Ensuite, utiliser une pipette P1000 avec une pointe micropipette pour pipeter doucement 20 fois vers le haut et vers le bas afin de dissocier mécaniquement le tissu haché en une suspension de cellules uniques tout en pipetant.

Éviter d'introduire des bulles d'air dans le mélange, car elles provoqueraient un stress supplémentaire pour les cellules. Faire passer la suspension cellulaire à travers un filtre stérile de 20 microns dans un nouveau tube de 15 millilitres. Laver le filtre à cellules avec deux millilitres de PBS contenant 0,15 % de BSA afin d'éviter toute perte cellulaire.

Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 200 × g pendant 10 minutes. Éliminer le surnageant. Réaliser la coloration des cellules en suspendant d'abord les cellules de chaque souris dans 100 microlitres de PBS contenant 0,15 % de BSA.

Utilisez un dixième des cellules provenant d'un des souris pour préparer chacun des quatre témoins comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. Ajoutez les anticorps primaires indiqués ici à chacun des tubes utilisés pour le tri cellulaire et incubez les mélanges pendant 20 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius. Après l'incubation avec les anticorps primaires, lavez les cellules avec un millilitre de PBS contenant 0,15 % de BS, A, puis centrifugez les cellules à 200 × g pendant 10 minutes.

Résuspendre les cellules dans 200 microlitres de PBS contenant 0,15 % de BSA par cerveau et les transférer dans des tubes de tri appropriés. Placer les tubes de tri cellulaire sur de la glace et ajouter un colorant vital tel que le colorant Hoechst 33258 à une concentration de deux microgrammes par millilitre aux cellules juste avant le tri cellulaire, afin de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.

Ensuite, faire passer les cellules du tube témoin négatif dans les faits et sélectionner les cellules en utilisant les paramètres de diffusion latérale et de diffusion avant. Exclure les cellules mortes en ciblant uniquement les agrégats de la fraction négative et les doubles en sélectionnant l'impulsion avec la fraction négative. Exécuter les témoins monocouleurs et ajuster les tensions du tube photomultiplicateur si nécessaire.

Effectuer la compensation de couleur dans la fenêtre de compensation du logiciel. Exécuter les trois contrôles de fluorescence moins un et dessiner les portes de tri. Une fois toutes les portes définies, trier directement les cellules marquées dans 100 microlitres de milieu de culture.

Plaquer en milieu les cellules fraîchement triées à une densité de 1000 à 3000 cellules par puits sur des plaques de 96 puits revêtues de poly-lysine, en utilisant 300 microlitres de milieu de culture. Incuber les plaques de culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure.

Pour permettre l'adhérence cellulaire, préparez un microscope confocal à balayage laser pour l'acquisition d'images en préchauffant la chambre contrôlée en température, fixée au microscope, à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone. Placez la plaque de 96 puits à l'intérieur de la chambre préchauffée du microscope et amenez le premier puits au point. Ouvrez ensuite le logiciel d'acquisition et cliquez avec le bouton droit dans la fenêtre principale pour sélectionner les commandes d'acquisition et l'acquisition DEAC.

Afin d'ouvrir le coussin TI et sélectionner ensuite l'objectif Plan A PO VC 20 XDIC, cliquez sur les commandes d'acquisition, puis ouvrez les options de prise de vue différée. Réglez le centre de chaque puits comme position de la platine et sélectionnez l'option d'image grande taille sur sept par sept millimètres carrés. Observez une image en mosaïque autour du centre de chacun.

Réglez le chevauchement pour la grande image en mosaïque à 5 % et définissez la fréquence de sorte que des images soient prises toutes les 20 minutes pendant 24 heures. Dans les paramètres One Plus, sélectionnez le niveau de tension du tube multiplicateur de photons pour chaque fluorescence indiquée dans la barre de menu. Choisissez d'acquérir des images à l'aide d'un scanner à résonance haute vitesse dans un format de 512 par 512 pixels et utilisez le contraste interférentiel différentiel (DIC) pour visualiser les cellules.

Ensuite, sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers de données. Cliquez sur le bouton Exécuter maintenant dans la fenêtre d'acquisition ND pour commencer l'acquisition. Suivez l'ordinateur pendant au moins une boucle afin de vous assurer que tout fonctionne correctement.

Des souris rouges Fuji ont été utilisées pour suivre la phase G1 à l’aide de la fluorescence rouge en microscopie vidéo à intervalles. Les cellules isolées sont fluorescentes en rouge pendant la première phase de croissance et restent rouges pendant la synthèse, la deuxième phase de croissance et la mitose. Lex positif eeg FR positif et eeg.

Des cellules FR positives provenant de souris jeunes adultes et d'âge moyen ont été mises en culture et suivies par microscopie. La durée des phases S et G2/M n'a montré aucune différence entre les cellules EGFR positives et les cellules EG FFR positives, ni chez les souris jeunes ni chez celles d'âge moyen. Cependant, la durée de la prochaine phase de croissance, depuis la première division jusqu'à l'extinction du signal fluorescent rouge, s'est révélée plus longue dans les cellules âgées, en raison de l'augmentation de la durée de la phase G1.

Les neurosphères obtenues cinq jours après la mise en culture sont plus petites dans les cellules Lex positives EGFR positives provenant des souris âgées. L'ensemble du protocole ne doit pas dépasser trois heures pour la dissection et la préparation des échantillons, et trois autres heures pour le tri cellulaire lorsqu'on travaille avec 12 souris. Gardez à l'esprit que travailler avec trop de souris le même jour entraînera une durée accrue de tri cellulaire et pourrait provoquer une augmentation de la mort cellulaire ou de la différenciation cellulaire.