Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

L’objectif global de cette procédure est de se développer dans des cellules T tueuses naturelles ou INKT dérivées de la rate de souris. Ceci est accompli en isolant d’abord les cellules mononucléées spléniques, puis en enrichissant la population de lymphocytes CD cinq positifs par séparation cellulaire magnétique. La fraction cellulaire splénique de l’INKT est ensuite isolée par tri cellulaire activé par fluorescence.

Dans la dernière étape, les cellules INKT triées sont placées pour l’expansion in vitro. En fin de compte, le profil cytokinique des cellules INKT expansées peut être évalué par Eliza. En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car la purification et l’expansion des cellules INKT nécessitent la combinaison de différentes techniques.

Cette procédure sera effectuée par un étudiant diplômé de mon laboratoire. Après avoir récolté la rate, transférez le tissu dans un filtre en nylon de 70 microns, puis utilisez un piston de seringue de deux millilitres pour écraser doucement la rate à travers la passoire dans un tube conique de 50 millilitres et lavez le filtre avec cinq millilitres de PBS. Ajoutez ensuite trois millilitres de charbon dans un tube de 15 millilitres et superposez le gradient de densité avec les cinq millilitres de suspension cellulaire.

Séparez les cellules par centrifugation et transférez l’interface dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, lavez les cellules dans 10 millilitres de PBS froid et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de tampon de fax pour enrichir pour le CD cinq lymphocytes spléniques positifs. Ajustez la dilution des cellules à une fois 10 à la septième cellules par 90 microlitres avec plus de tampon de fax et ajoutez 10 microlitres d’anti-CD cinq microbilles aux cellules.

Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules avec quatre millilitres de tampon de fax et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de fax frais. Isolez les cinq cellules positives du CD par séparation magnétique conformément aux recommandations du fabricant. Ensuite, diluez les lymphocytes CD cinq positifs enrichis à une fois 10 pour les six cellules par tampon inax de 20 microlitres contenant des tétramères anti CD 16, CD 32 et alpha gals air CD 1D conjugués au PE à température ambiante dans l’obscurité après 30 minutes, incubez les cellules avec les anticorps d’intérêt à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes supplémentaires.

Ensuite, lavez les cellules dans un tampon de fax frais et colorez-les avec 10 microlitres d’une solution de travail de 20 micromolaires de DPI par une fois 10 dans les six cellules pendant cinq minutes. À température ambiante, ils acquièrent maintenant environ une fois 10 à la quatrième CD enrichie, cinq événements lymphocytaires positifs sur le cytomètre en flux, déclenchant électroniquement la diffusion vers l’avant avec des cellules faibles pour exclure les doublets de cellules et les agrégats électroniques. Éliminez le CD positif DAPI, huit cellules CD positives 19 positives dans la diffusion directe avec une faible population et utilisez des tracés de dispersion latérale et de zone de dispersion directe.

Pour sélectionner électroniquement les lymphocytes, tracez les tétramères alpha gal SER CD 1D par CD trois epsilon et ga électroniquement le tétramère alpha gal ser CD 1D positif CD trois epsilon cellules INKT positives comme indiqué. Ensuite, l’acquisition d’un maximum de deux fois 10 au cinquième CD cinq lymphocytes enrichis positifs détermine le pourcentage de cellules INKT alpha gal SER CD 1D tétramère positif et de trois cellules INKT epsilon positives présentes dans la fraction cellulaire enrichie. À l’aide de cette porte de tri bas, l’alpha alser CD 1D tétramère positif CD trois cellules INKT epsilon positives dans un tube de fax contenant un millilitre de sérum de veau fœtal à la fin du tri.

Rincez les cellules NKT isolées sur le côté du tube de télécopie avec 10 millilitres de support RPMI 1640. Ensuite, faites tourner les cellules, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de RPMI 1640 et utilisez une aliquote de 40 microlitres des cellules pour évaluer la pureté des cellules triées. Utiliser la même stratégie de gating.

En ce qui concerne la configuration des paramètres de tri pour étendre les cellules INKT, faites tourner les cellules vers le bas et remettez en suspension les cellules isolées à cinq fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans un milieu RPMI 1640 complet complété par IL deux IL 12 et anti CD 28. Ensuite, ensemencez les cellules à une fois 10 à la cinquième cellules INKT par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits recouverte de trois CD et revêtue de trois epsilons et incubez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire. Après deux jours, transférez les cellules dans une plaque à fond plat à 96 puits fraîche et non revêtue pour la culture dans des conditions de repos dans un RPMI 1640 complet.

Milieu pour une autre incubation de deux jours. Le quatrième jour après le tri, pipeter doucement le surnageant dans chaque puits pour déloger les cellules et les regrouper dans un tube conique de 15 millilitres. Après la centrifugation, suspendre le palais à cinq fois 10 à cinq cellules par millilitre.

Dans le milieu RPMI 16 complet complété par IL sept et graine une fois 10 à la cinquième cellules par puits. Dans une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits, retournez les cellules dans l’incubateur après quatre jours, tirez-les dans un tube conique frais de 15 millilitres pour la centrifugation. Suspendez à nouveau la pastille dans un milieu RPMI 1640 complet contenant de l’anti CD 28 soluble et ensemencez les cellules sur une plaque à fond plat de 96 puits recouverte d’anti CD trois epsilon à une fois 10 des cinquièmes cellules par puits et retournez les cellules dans l’incubateur pendant encore trois jours, quatre jours, 11 à 18.

Répétez le traitement IL sept anti CD 28 et anti CD trois epsilon comme nous venons de le démontrer au jour 19. Transférez les cellules dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Faites-les tourner et remettez la pastille en suspension à cinq fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans un RPMI 1640.Medium.

Ensuite, ensemencez les cellules à une fois 10 à la cinquième cellules par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits et laissez les cellules reposer pendant deux jours dans l’incubateur de culture cellulaire. La stimulation de cellules INKT triées avec de l’anti CD trois epsilon lié à la plaque en présence de IL deux IL 12 et d’anti CD 28 soluble entraîne une multiplication par trois du nombre d’INKT après deux jours de culture. L’expansion ultérieure des cellules INKT en présence d’IL sept entraîne une multiplication par trois à quatre du nombre de cellules INKT présentes au quatrième jour en culture.

Notamment, la répétition de ces conditions de culture peut produire une moyenne de sept fois 10 à la septième cellule INKT après deux cycles d’expansion sans aucune perte visible de cellules entre les changements de milieu de culture à des jours différents, ce qui entraîne une expansion d’au moins 70 fois en 18 jours. D’autres cellules INKT expansées activées avec de la souris recombinante liée à la plaque. CD 1D chargé d’alpha alser produit IL deux, IL quatre, IFN gamma, TNF alpha et IL six 48 heures après la stimulation, démontrant que les cellules INKT conservent leur capacité à produire des cytokines TH un et TH deux après expansion.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la coloration correcte des cellules INKT avec du cdre chargé d’alpha-céramide est essentielle pour identifier les cellules INKT lors de la cytométrie en flux. Sûr.