Name: Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Apprenez à isoler et à amplifier les cellules iNKT invariantes de la rate de souris. Cette méthode utilise la séparation magnétique et le tri cellulaire par cytométrie en flux pour obtenir un rendement élevé avec peu de ressources.

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D.E. et M.B.D. sont membres d’une plateforme de recherche multidisciplinaire (MRP) de l’Université de Gand et du consortium GROUP-ID (Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease).

Dans cette étude, des adultes (6-8 semaines) femelles C57BL / 6 ont été utilisées. Les souris ont été logées et élevés selon les directives du vivarium Université de Gand. Toutes les procédures animales ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et de l&#39;éthique institutionnelle. 1. Préparation des cellules mononucléaires (MNC) de Spleen souris <ol><li> Sacrifiez la souris par dislocation cervicale. </li><li> Placez la souris vers le bas sur le plateau de dissection et fixer la biche et les pattes avec des épingles. </li><li> Stériliser la surface de la peau avec 70% (vol / vol) d&#39;éthanol / H 2 O. </li><li> Couper la peau le long de la ligne médiane abdominale au thorax et d&#39;exposer la rate en utilisant des instruments chirurgicaux stériles. </li><li> Après la coupe des tissus adipeux autour, placer la rate dans une plaque 24 puits contenant 1 ml 1x tampon phosphate salin (PBS) à température ambiante. </li><li> On dissèque la rate à l&#39;aide d&#39;un scalpel stérile et transférer les morceaux dans un filtre en nylon de 70 pm placée dans un bain de 50 ml,e. </li><li> En utilisant une seringue de 2 ml plongeur, écraser délicatement les morceaux de la rate à travers le tamis de la cellule et laver avec 5 ml de PBS 1X. </li><li> Ajouter 3 ml de Ficoll-Paque dans un tube de 15 ml et recouvrir le milieu à gradient de densité avec le 5 ml de suspension cellulaire. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 20 min à température ambiante sans frein. </li><li> Transférer l&#39;interphase dans un nouveau tube de 15 ml, ajouter 10 ml froid 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de PBS 1X contenant 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 1 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon FACS). Transfert 10 ul de la suspension cellulaire à un petit tube, mélanger avec 10 ul de 0,4% </li></ol> 2. Enrichissement, la détection et la purification des cellules de souris iNKT <ol><li> L&#39;enrichissement de la rate de la souris CD5positive (CD5 +) lymphocytes. <ol><li> (Facultatif) Stain 10 5 cellules avec FITC conjugué anti-CD5 (4 pi de la dilution 1:30 / 10 6 cellules)pendant 30 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité, on lave avec 200 pi de tampon FACS et remettre en suspension dans 500 pi de tampon FACS. Préparer une solution de travail de 20 uM de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans 1 x PBS, ajouter 1 pl de celui-ci pour 10 5 cellules dans du tampon FACS et incuber à température ambiante pendant 5 min. Acquérir 10 4 cellules pré-enrichis sur le cytomètre de flux. <ol><li> Utilisation FCS-H et W-FCS, portail électronique sur les cellules lo FSC-W à exclure doublets de cellules et d&#39;agrégats (figure 1A). Puis électronique porte sur DAPI + (morts), les cellules au sein de la FSC-W lo population (figure 1B), et utilisent SSC-A et FCS-A pour sélectionner électroniquement la population de lymphocytes par la taille (figure 1C). </li><li> Utilisation de cellules à l&#39;intérieur de la porte de lymphocytes, tracer SSC-A par rapport CD5 et électroniquement porte CD5 + lymphocytes comme le montre la figure 1D. Acquisition du reste de l&#39;échantillon de pré-enrichissement sur le cytomètre de flux. </li&gt; </ol></li><li> Ajuster le nombre de cellules à 10 7 cellules par 90 ul dans du tampon FACS et 10 pl ajouter des microbilles anti-CD5. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 15 min, laver une fois avec 4 ml tampon FACS et remettre en suspension dans 500 pi de tampon FACS froid. Enrichissez pour CD5 + lymphocytes en utilisant séparation magnétique de cellules (MACS) colonnes selon les recommandations du fabricant. </li><li> Facultatif) Stain 10 5 cellules avec FITC conjugué anti-CD5 (4 pi de dilution 1h30 / 10 6 cellules) et DAPI comme en 2.1.1. Acquérir 10 4 lymphocytes enrichis sur le cytomètre de flux et de vérifier que les portes électroniques créés en 2.1.1. sélectionnez CD5 + lymphocytes dans la fraction cellulaire enrichie. Acquérir 10 5 cellules sur le cytomètre de flux et d&#39;analyser le pourcentage CD5 + lymphocytes présents dans la fraction enrichie comme représenté sur la figure 1E - H. </li></ol></li><li> La détection et l&#39;isolement des souris iNKT thisLLS par FACS. <ol><li> Remettre en suspension les lymphocytes CD5 + enrichis à une concentration d&#39;environ 10 6 cellules par 20 ul de tampon pour FACS contenant anti-CD16 / CD32 (4 pi d&#39;une dilution 1:50 / 10 6 cellules) et aGalCer PE-conjugué / tétramère CD1d (1 pg / 10 6 cellules). </li><li> Incuber pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Diluer anticorps de souris (mAb) anti-CD3e V500 (4 pi d&#39;une dilution 1:20 / 10 6 cellules), anti-CD19 E450 (4 ul de dilution 01:50 / 10 6 cellules) et anti-CD8a E450 (4 ul de dilution 1:50 / 10 6 cellules) dans un tampon FACS, ajouter à CD5 + lymphocytes et incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de tampon FACS par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 4 ml de tampon FACS à une concentration finale de 10 7 cellules / ml. </li><li> Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire de 30 um et de placer les cellules sur de la glace. </li><li> Calibrer le cytomètre en flux pour le tri selon les recommandations du fabricant 14,15 cellule. Remarque: L&#39;étalonnage d&#39;un cytomètre de flux pour le tri de cellules nécessite une formation et peut être effectuée par un opérateur expérimenté, ou un technicien qualifié. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;une solution de travail de 20 pM de DAPI par 10 6 cellules et incuber à température ambiante pendant 5 min. L&#39;acquisition d&#39;environ 10 4 enrichis CD5 + lymphocytes sur le cytomètre en flux. Électronique porte sur les cellules lo FSC-W à exclure doublets de cellules et d&#39;agrégats (figure 2A). Puis électronique porte sur DAPI + CD8 + CD19 + cellules (canal de décharge) dans le FSC-W lo population (figure 2B), et utiliser SSC-A et FCS-A pour sélectionner électroniquement lymphocytes (figure 2C) comme décrit dans 2.1.1.1 . <ol><li> Terrain aGalCer / CD1d tétramère par CD3e et électroniquement porte aGalCer / CD1dcellules tétramère + CD3e + iNKT comme indiqué sur la Figure 2D. Cellules présentes dans la fraction cellulaire enrichie acquérir plus de 2 x 10 5 CD5 + lymphocytes enrichis pour déterminer le pourcentage aGalCer / CD1d tétramères + CD3e + iNKT. </li></ol></li><li> Utilisation des portes électroniques créés en 2.2.7., Les cellules FACS sorte aGalCer / tétramère CD1d CD3e + + iNKT sur le cytomètre de flux à 70 psi en utilisant une buse de 70 um à une vitesse de &#39;1,5&#39; d&#39;écoulement. Recueillir des cellules iNKT triés dans un tube FACS contenant 1 ml de 100% de FCS. Ensuite rincer cellules iNKT trié du côté du tube FACS utilisant 10 ml IPMB 1640 et centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension triée cellules iNKT dans 1 ml de milieu RPMI 1640 et d&#39;acquérir 40 pi de celui-ci sur un cytomètre de flux pour évaluer la pureté des cellules iNKT triés. Sélectionnez FSC-W lo DAPI - lymphocytes comme décrit dans 2.2.7. (Figure 2E - G) et électroniquement porte aGalCer / CD1d cellules tétramère + CD3e + iNKT comme indiqué dans la figure 2H. </li></ol></li></ol> 3. Culture et l&#39;expansion des cellules de souris iNKT Jour 0 <ol><li> Enduire une plaque à 96 puits à fond plat avec les anticorps anti-CD3e (3 pg / ml) par puits pendant 1 heure à température ambiante. Laver deux fois avec 200 pi de PBS 1x et une fois avec 200 pi milieu RPMI 1640 complet (10% vol / vol de FCS, 100 U / ml de pénicilline-streptomycine, 5,5 uM β-mercaptoéthanol). </li><li> Comptez le nombre de cellules viables triées iNKT (étape 2.2.8) en utilisant 0,4% d&#39;un hémocytomètre comme dans 1.11., Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension à 5 x 10 5 cellules / ml dans du milieu complet RPMI 1640 contenant l&#39;IL-2 murine (10 ng / ml) recombinant, recombinant murine IL-12 (1 ng / ml) et soluble CD28 anti-souris (5 ug / ml). Plate ssignalés auparavant cellules iNKT à 10 5 cellules / puits dans des plaques revêtues anti-CD3e et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pendant 2 jours. </li></ol> Jour 2 <ol start="3"><li> Transférer les cellules à une plaque de 96 à fond plat non couché frais bien et la culture des cellules dans des conditions de repos en milieu RPMI 1640 complet à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 pendant 2 jours. </li></ol> Jour 4 <ol start="4"><li> Déloger les cellules de la plaque par pipetage doux et transférer les cellules dans un nouveau tube de 15 ml. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, remise en suspension à 5 x 10 5 cellules / ml dans du milieu RPMI 1640 complet contenant recombinant IL-7 murine (5 ng / ml), et la plaque 10 5 cellules / puits dans un forfaitaire fond plaque à 96 puits pendant 4 jours à 37 ° C dans un incubateur à CO 2. </li></ol> Jour 8 <ol start="5"><li> Recueillir les cellules dans un tube frais, centrifugeuse à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension à 5 x 10 5 cellules / ml dans du milieu RPMI 1640 complet contenant anti-CD28 soluble (5 ug / ml). </li><li> Enduire une plaque à 96 puits à fond plat avec les anticorps anti-CD3e (3 pg / ml) par puits et laver comme en 3.1. La plaque 10 5 cellules / puits dans des plaques anti-CD3e revêtues et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 jusqu&#39;à 11 jours. </li></ol> Jour 11-18 <ol start="7"><li> Répétez les étapes 3.4 à 3.6. </li></ol> Jour 19-20 <ol start="8"><li> Transférer les cellules à un tube de 15 ml frais, centrifugeuse à 300 g et remettre en suspension à 5 x 10 5 cellules / ml dans milieu RPMI 1640 complet. </li><li> Cellules de la plaque à 10 5 cellules / puits dans une plaque de 96 puits à fond plat et permettre aux cellules de se reposer pendant 2 jours à 37 ° C dans un incubateur à CO2 avant de l&#39;utiliser dans une expérience. </li></ol> 4. Production de cytokines par les souris des cellules iNKT l&#39;aide d&#39;un CD1d Plate-lié Assay <ol><li> Enduire une plaque à 96 puits à fond plat avec 100 pi de murin recombinant CD1d (10 pg / ml dans du PBS 1X) par puits et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Laver quatre fois avec 200 pi de PBS 1x, ajouter 200 pi de 2% de FCS en 1x PBS (solution de blocage) par puits et incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Retirer la solution de blocage, ajouter 200 pi de aGalCer (5 ng / ul) par puits et incuber la plaque à 37 ° C pendant 16 heures. [Pour la préparation de la solution aGalCer, ajouter 1,085 μ 1 x PBS à 55 pg d&#39;aGalCer dissous dans un véhicule contenant 96 mg / ml de saccharose, 10 mg / ml de désoxycholate de sodium et 5 mg / ml entre 20]. </li><li> Après incubation, jeter la solution aGalCer et laver le puits deux fois avec 200 pi de PBS 1x suivie par 200 pi complète moyennes RPMI 1640. </li><li> Recueillir les cellules iNKT élargi in vitro au jour 21, centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans complète RPMI 1640 à une concentration de 0,5 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ajouter 200 ul de la remise en suspension de cellules iNKT par puits et incuber pendant 72 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO 2. </li><li> Récupérer le surnageant et mesurer les cytokines d&#39;intérêt par immuno-essai enzymatique (ELISA) selon le protocole du fabricant. </li></ol>

<ol><li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells%3A+development%2C+specificity%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li>
<li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li>
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<li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease%3A+a+joint+dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity%3A+a+new+immunoregulatory+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li>
<li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li>
<li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li>
<li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li>
<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
<li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li>
<li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+%27real+time%27%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li>
<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.

Les étapes critiques dans le protocole actuel comprennent l&#39;isolement et l&#39;enrichissement ultérieur de CD5 + lymphocytes (Section 1 &amp; 2), tri FACS (section 3) et l&#39;étalement initial de cellules iNKT (section 4). Parmi les étapes effectuées dans la section 1, rappelez-vous à la couche attentivement la suspension cellulaire splénique sur le milieu de gradient de densité telle que une interphase cellulaire distincte est générée après la centrifugation. L&#39;enrichissement ultérieur pour CD5 <sup...

Murine T (iNKT) les cellules tueuses naturelles invariant constituent une population distincte de lymphocytes T innées choisis dans le thymus thymocytes corticaux par CD1d exprimant 1,2. cellules iNKT expriment un récepteur de lymphocyte T (TCR) comprenant une chaîne Vα14-Jα18 TCR invariant associé à chaque Vß8, Vβ7 ou Vβ2 TCR 3, qui est capable de reconnaître endogène ainsi que des antigènes lipidiques étrangers dans le cadre de CD1d. Par exemple, des cellules murines reconnaissent iNKT et sont activées par un antigène lipide endogène appelé isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, ainsi que les α-galactosylcéramide (aGalCer) 5,6, un glycolipide isolé à partir d&#39;éponges marines. TCR-dépendante de l&#39;activation des cellules iNKT favorise l&#39;amorçage de réponses immunitaires adaptatives, et, par conséquent, les cellules iNKT se sont révélés être fonctionnellement impliquée dans le développement ou l&#39;amélioration d&#39;une gamme de pathologies, y compris les maladies rhumatismales 7 et le cancer &lt;sup&gt; 8. Actuellement, les ligands de cellules iNKT synthétiques constituent de nouveaux prometteurs adjuvants de vaccins qui peuvent être capables de réguler un nombre de conditions immunopathologiques. Il a précédemment été démontré que les cellules iNKT peuvent être générés in vitro après isolement à partir de tissus de souris toutefois; bon nombre de ces études emploient l&#39;utilisation de cellules primaires présentatrices d&#39;antigène (CPA) et / ou des lignées cellulaires 9, Vα14 TCR transgénique (Tg) de 10 souris, les thymomes ou pour la génération d&#39;hybridomes dérivés de cellules iNKT-11,12. En outre, un grand nombre de souris, des volumes élevés de réactifs tels que les dimères de CD1d aGalCer-chargés, et de longs temps de culture font certains protocoles publiés moins éthiquement et économiquement attrayante 9,13. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode adaptée pour l&#39;isolement et dans l&#39;expansion in vitro de cellules iNKT de rate de souris. Plus précisément, le protocole décrit un procédépour enrichir les cellules iNKT de rate de souris qui réduit les souris, les réactifs et le temps requis pour FACS tri cellulaire, et propose une approche optimisé pour l&#39;expansion des cellules iNKT spléniques triées in vitro.

<table><tbody><tr><td>Matériau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>murin recombinant IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>murin recombinant IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>murin recombinant IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>purifié anti-souris CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>purifié anti-souris CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>E450-conjugué anti-souris CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugué anti-souris CD8&alpha ; (53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 (53-7.3) anti-souris conjugué à la FITC</td> <td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon anti-souris conjugué à V500 ; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>microbilles anti-souris CD5 (Ly-1)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris purifié CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan, 0,4 % (poids/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - gratuit]</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td> <td>sérique bovineSigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque 96 puits F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube falcon</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; m filtre</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 & micro ; m filter</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MiniMACS</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Colonnes</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à CO2 à chemise d’eau</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissection</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un procédé optimisé pour isoler et expansion invariant cellules t tueuses naturelles de spleen souris

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

La capacité à sécréter des cytokines rapidement lors d&#39;une stimulation est une caractéristique fonctionnelle de l&#39;invariant T tueuses naturelles (iNKT) lignée cellulaire. iNKT cellules sont donc caractérisées par une population de cellules T capables d&#39;activer innée et adaptative direction réponses immunitaires. Le développement des techniques améliorées pour la culture et l&#39;expansion des cellules iNKT murins facilite l&#39;étude de la biologie des cellules iNKT in vitro et dans des modèles in vivo. Nous décrivons ici un procédé optimisé pour l&#39;isolement et l&#39;expansion de cellules spléniques murines iNKT. Les rates de souris C57BL / 6 sont supprimés, disséqués et tendues et la suspension cellulaire obtenue est en couches sur les médias de gradient de densité. Après centrifugation, les cellules mononucléaires spléniques (EMN) sont recueillies et (CD5 +) des lymphocytes CD5-positifs sont enrichies en utilisant des billes magnétiques. iNKT cellules au sein de la fraction CD5 + sont ensuite colorées avec du ^5; GalCer tétramère CD1d-chargé et purifié par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Triées par FACS des cellules iNKT sont initialement puis cultivées in vitro en utilisant une combinaison de cytokines murines recombinantes et des récepteurs des cellules T de plaque lié (TCR) des stimuli avant d&#39;être détendu dans la présence de murine IL-7 recombinante. En utilisant cette technique, environ 10 8 cellules iNKT peuvent être générés à l&#39;intérieur de 18-20 jours de culture, après quoi ils peuvent être utilisés pour des tests fonctionnels in vitro, ou in vivo pour les expériences de transfert chez la souris.

Isolement des cellules mononucléaires spléniques en utilisant d&#39;un gradient de densité prend environ une heure et élimine l&#39;utilisation de réactifs nécessaires pour lyser les globules rouges (RBC). Un rendement élevé de cellules viables est obtenue en utilisant cette méthode et les débris générés pendant l&#39;organe de déformation est supprimée. Typiquement, la fréquence des cellules iNKT au sein du pool de lymphocytes de la rate est comprise entre 1 et 5% des lymphocytes T totaux Cependant, cela peut varier se...

Nous présentons ici un protocole adapté qui peut être utilisé pour générer un grand nombre de lymphocytes T tueurs naturels invariants murins à partir de la rate de souris. Le protocole décrit une approche par laquelle les cellules spléniques iNKT peuvent être enrichies, isolées et développées in vitro à l’aide d’un nombre limité d’animaux et de réactifs.

Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

L'objectif général de cette procédure est d'augmenter in vitro les cellules T natural killer invariantes, ou cellules INKT, prélevées à partir de la rate de souris. Cette étape est réalisée en isolant d'abord les cellules mononucléées spléniques, puis en enrichissant la population de lymphocytes positifs pour le CD5 par séparation magnétique des cellules. La fraction de cellules INKT spléniques est ensuite isolée davantage par tri cellulaire activé par fluorescence.Dans la dernière étape, les cellules INKT triées sont mises en culture pour une expansion in vitro. En fin de compte, le profil de cytokines des cellules INKT expansées peut être évalué par ELISA. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la purification et l'expansion des cellules INKT nécessitent la combinaison de différentes techniques à maîtriser.Cette procédure sera réalisée par un étudiant diplômant de mon laboratoire. Après avoir prélevé la rate, transférez le tissu dans un filtre en nylon de 70 microns, puis utilisez le piston d'une seringue de deux millilitres pour écraser doucement la rate à travers le tamis dans un tube conique de 50 millilitres et rincez le filtre avec cinq millilitres de PBS. Ajoutez ensuite trois millilitres du milieu de Ficoll dans un tube de 15 millilitres et recouvrez le gradient de densité avec les cinq millilitres de suspension cellulaire.Séparer les cellules par centrifugation et transférer l'interface dans un nouveau tube de 15 millilitres. Laver ensuite les cellules dans 10 millilitres de PBS froid et resuspendre le culot dans deux millilitres de tampon fax pour enrichir les lymphocytes spléniques CD cinq positifs. Ajuster la dilution des cellules à un fois 10 à la puissance sept cellules par 90 microlitres à l'aide de tampon fax supplémentaire et ajouter 10 microlitres de microbilles anti-CD cinq aux cellules.Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, laver les cellules avec quatre millilitres de tampon fax et resuspendre le culot dans 500 microlitres de tampon fax frais. Isoler les cellules CD5 positives par séparation magnétique des cellules selon les recommandations du fabricant. Ensuite, diluer les lymphocytes CD5 positifs enrichis à une concentration de un fois dix puissance six cellules par 20 microlitres de tampon inax contenant les anticorps anti-CD16, anti-CD32 et le tétramère PE conjugué alpha GalSier CD1D, à température ambiante et à l'abri de la lumière. Après 30 minutes, incuber les cellules avec les anticorps d'intérêt à quatre degrés Celsius et à l'abri de la lumière pendant 30 minutes supplémentaires.Ensuite, lavez les cellules dans un tampon fax frais et étiquetez-les avec 10 microlitres d'une solution travail de DPI à 20 micromolaire par un fois 10 à la puissance six cellules pendant cinq minutes. Acquérez maintenant à température ambiante environ un fois 10 à la puissance quatre événements de lymphocytes enrichis en CD5 positifs sur le cytomètre en flux, en appliquant un fenêtrage électronique sur la diffusion avant avec faible granularité pour exclure les doublests et agrégats cellulaires. Excluez électroniquement les cellules positives pour DAPI, CD8 et CD19 au sein de la population présentant une faible diffusion avant, et utilisez les diagrammes de surface de la diffusion latérale et de la diffusion avant.Pour sélectionner électroniquement les lymphocytes, tracer les tétramères alpha-gal SER CD1D par rapport à CD3 epsilon et sélectionner électroniquement les cellules INKT positives pour les tétramères alpha-gal SER CD1D et positives pour CD3 epsilon, comme indiqué. Ensuite, après avoir acquis au maximum deux fois 10 à la puissance 5 lymphocytes enrichis CD5 positifs, déterminer le pourcentage de cellules INKT positives pour les tétramères alpha-gal SER CD1D et positives pour CD3 epsilon présentes dans la fraction cellulaire enrichie. À l’aide de ce tri avec une faible pureté, trier les cellules INKT positives pour les tétramères alpha-gal SER CD1D et positives pour CD3 epsilon dans un tube FACS contenant un millilitre de sérum de veau fœtal à la fin du tri.Rincez les cellules T-NK isolées sur la paroi du tube FACS avec 10 millilitres de milieu RPMI 1640. Ensuite, centrifugez les cellules, resuspendez le culot dans un millilitre de RPMI 1640 et utilisez un aliquot de 40 microlitres des cellules pour évaluer la pureté des cellules triées. En utilisant la même stratégie de sélection.Pour régler les paramètres de tri afin d'élargir les cellules INKT, centrifuger les cellules et resuspendre les cellules isolées à une concentration de cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre dans du milieu RPMI 1640 complet supplémenté en IL-2, IL-12 et anti-CD28. Ensuite, ensemencer les cellules à raison d'une fois 10 à la puissance cinq cellules INKT par puits dans une plaque de 96 puits à fond plat revêtue d'anti-CD3 epsilon, puis les incuber à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture cellulaire. Après deux jours, transférer les cellules dans une nouvelle plaque de 96 puits à fond plat non revêtue pour les cultiver dans des conditions de repos dans du RPMI 1640 complet.Milieu pour une autre incubation de deux jours. Le quatrième jour suivant le tri, pipeter doucement le surnageant de chaque puits pour détacher les cellules et les regrouper dans un tube conique de 15 millilitres. Après centrifugation, resuspendre le culot à cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre.Dans le milieu RPMI 1640 complet supplémenté en IL-7, ensemencer 1 × 10⁵ cellules par puits. Dans une nouvelle plaque 96 puits à fond plat, remettre les cellules à l’incubateur pendant quatre jours, puis les transférer dans un tube conique de 15 mL neuf pour centrifugation. Resuspendre le culot dans du milieu RPMI 1640 complet contenant l’anticorps soluble anti-CD28, puis ensemencer les cellules dans une plaque 96 puits à fond plat revêtue d’anticorps anti-CD3ε, à raison de 1 × 10⁵ cellules par puits, et remettre les cellules à l’incubateur pendant trois jours supplémentaires, quatre jours aux jours 11 à 18.Répétez le traitement par IL-sept, anti-CD28 et anti-CD3 epsilon comme indiqué précédemment au jour 19. Transférez les cellules dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Faites-les centrifuger et resuspendez le culot à cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre dans du milieu RPMI 1640 complet.Ensuite, ensemencer les cellules à raison de 1 × 10⁵ cellules par puits dans une plaque 96 puits à fond plat et laisser reposer les cellules pendant deux jours dans l’incubateur de culture cellulaire. La stimulation de cellules INKT triées par une anti-CD3 epsilon fixée sur la plaque, en présence d’IL-2, d’IL-12 et d’une anti-CD28 soluble, entraîne une expansion d’environ trois fois le nombre de cellules INKT après deux jours de culture. Une expansion ultérieure des cellules INKT en présence d’IL-7 conduit à une augmentation de trois à quatre fois du nombre de cellules INKT présentes au jour quatre de la culture.Notamment, la répétition de ces conditions de culture peut produire en moyenne sept fois dix puissance sept cellules INKT après deux cycles d'expansion, sans perte visible de cellules entre les changements de milieu de culture effectués à différents jours, ce qui correspond à une expansion d'au moins 70 fois en 18 jours. Les cellules INKT davantage expansées, activées par la forme recombinante murine fixée sur plaque de CD1D chargée avec l'alpha-alser, produisent de l'IL-2, de l'IL-4, de l'IFN-γ, du TNF-α et de l'IL-6 à 48 heures après la stimulation, démontrant ainsi que les cellules INKT conservent leur capacité à produire des cytokines de type TH1 et TH2 après expansion.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que la coloration adéquate des cellules INKT avec le cdre chargé en alpha-céramide est essentielle pour identifier les cellules INKT lors de la cytométrie en flux.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo décrit l’enrichissement en lymphocytes T de la rate d’une souris par sélection négative à l’aide d’un séparateur magnétique. La technique consiste à cibler les autres cellules de l’échantillon pour la déplétion à l’aide d’anticorps ou de ligands dirigés contre des antigènes de surface cellulaire spécifiques.

Enrichissement des lymphocytes T : une technique pour isoler les lymphocytes T d’une population cellulaire mixte par séparation magnétique

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Enrichissement et expansion à base de nanoparticules de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène

Cette vidéo démontre l’induction de la maladie du greffon intestinal contre l’hôte, GvHD, chez une souris receveuse irradiée létalement à l’aide de cellules souches hématopoïétiques allogéniques allogéniques et de lymphocytes T alloréactifs spléniques induisant la GvHD. Ce protocole permet d’établir un modèle de GvHD intestinale aiguë sévère afin de comprendre le mécanisme de la maladie et de développer des options thérapeutiques innovantes.

Induction de la maladie du greffon contre l’hôte dans des modèles murins par greffe allogénique de moelle osseuse et de cellules spléniques

Cette vidéo illustre une méthode permettant d’isoler des lymphocytes T tueurs naturels invariants, également connus sous le nom de cellules iNKT. La procédure commence par l’injection d’un glycolipide synthétique dans une souris pour stimuler l’activation et la prolifération des cellules iNKT dans la rate. Par la suite, des suspensions unicellulaires sont préparées à partir de la rate et incubées avec des complexes de reconnaissance des cellules iNKT marqués avec des fluorophores, suivis d’une...

Isolement de lymphocytes T tueurs naturels invariants à partir d’un modèle murin

Les lymphocytes T CD4+ naïfs se polarisent en divers sous-ensembles en fonction de l’environnement au moment de l’activation.  La différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en divers sous-ensembles effecteurs peut être réalisée in vitro par l’ajout de stimuli des récepteurs des lymphocytes T et de signaux spécifiques de cytokines.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Des sous-ensembles distincts de cellules dendritiques existent en tant que populations rares dans les organes lymphoïdes, et sont donc difficiles à isoler en nombre suffisant et en pureté suffisante pour des expériences immunologiques. Nous décrivons ici une méthode à haute efficacité et à haut rendement pour l’isolement de tous les principaux sous-ensembles actuellement connus de cellules dendritiques spléniques de souris.

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

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Induction of Intestinal Graft - versus - host Disease and son évaluation endoscopique Mini souris vivantes

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Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

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TUEUR NATUREL (NK) ET PROCÉDÉ D’EXPANSION CELLULAIRE CAR-NK UTILISANT UNE LIGNÉE CELLULAIRE B MODIFIÉE PAR UNE LIGNÉE CELLULAIRE B LIÉE À LA MEMBRANE

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Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

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