Cartographie spatio-temporelle de la motilité

Les objectifs généraux de la création d'une carte spatiotemporelle complète d'intestins ex vivo sont d'étudier la réponse au contenu luminal en observant les mouvements détaillés de la paroi intestinale sur toute la longueur d'un segment. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'enregistrer et de comparer l'activité dans différentes régions d'un même segment tissulaire, dans l'espace et dans le temps, permettant ainsi d'identifier des profils de motilité complexes, au-delà de simples contractions ou relâchements. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la motilité intestinale normale, elle peut également être utilisée pour identifier les effets de divers médicaments et agents intraluminaux, tels que les nutriments ou les profils de motilité.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les cartes spatiotemporelles peuvent initialement être difficiles à interpréter. Mais avec le temps, on peut discerner des motifs complexes d’un seul coup d’œil. Pour commencer, retirer le côlon ou l’intestin d’un cobaye euthanasié.

Fixez-le dans une solution de Krebs tiède. Sur la plaque de dissection, éliminez tout le contenu intraluminal en perfusant doucement du tampon de Krebs à travers la lumière. Utilisez une seringue équipée d'un cathéter à extrémité émoussée et évitez de distendre excessivement le segment de colon pendant la perfusion.

Ensuite, fixer deux morceaux de tube en polyéthylène mesurant deux à trois millimètres de longueur à deux cathéters en verre recuits dont le diamètre est de trois millimètres. Dans un plateau de dissection chauffé, insérer un cathéter dans l'extrémité buccale de la préparation tissulaire et faire un nœud de suture derrière le petit morceau de tube, entourant le cathéter à l’aide d’un nœud chirurgical. Tenter doucement de retirer le cathéter afin de s’assurer que le nœud est bien serré.

Le petit morceau de tube en polyéthylène empêche le glissement du fil de suture. Répétez cette procédure en utilisant l'autre cathéter à l'extrémité aborale du tissu. Ensuite, retirez le mésentère de la préparation tissulaire.

Une fois les deux cathéters fixés, transférez la préparation depuis le plateau de dissection vers l'un des bains organiques GIMM et positionnez le tissu de manière à ce que l'extrémité orale soit orientée à l'opposé de l'utilisateur. Ensuite, fixez les cathéters en tube de verre au bain organique à l'aide d'argile de modelage en attachant l'extrémité du tube de verre sur le côté du bain, ou en utilisant des pinces en plastique pour relier les cathéters aux pôles situés au-dessus du bain, utilisés pour fixer les caméras. Fixez maintenant un morceau de tube de cinq centimètres à l'extrémité libre de chaque cathéter.

Pour le cathéter oral, reliez le court morceau de tube à un morceau de tube plus long muni d'un raccord à visser. Ensuite, fixez la seringue de cinq millilitres au raccord à visser. Cet ensemble servira à injecter du tampon dans la préparation tissulaire.

Pour le cathéter aboral, utilisez le tube pour diriger le flux sortant de la lumière vers un récipient de collecte. Ensuite, à l’aide de la seringue fixée, rincez lentement le tissu avec du tampon de Krebs chauffé afin de garantir un bon écoulement, comme en témoigne la sortie de liquide par le cathéter aboral. Puis, calibrez le système d’enregistrement vidéo pendant que le tissu s’équilibre pendant 30 minutes.

Calibrez la hauteur de placement de la caméra, les paramètres vidéo de luminosité et de contraste, ainsi que la distance horizontale à l'aide du logiciel GIMM. Cliquez sur l'onglet expérience pour la caméra à calibrer. Ensuite, dans le menu Fichier, cliquez sur Calibrer.

Une fois que la vidéo apparaît dans la fenêtre de la station de calibration, positionnez la caméra à une hauteur telle que l'image inclue les extrémités des cathéters insérés dans la lumière colique. Ensuite, étalonnez la distance horizontale visible sur l'image à l'écran à l'aide de l'autocollant de règle translucide fixé à chaque bain. Dans la même fenêtre de la station de calibration, positionnez les lignes directrices verticales rouges de manière à ce qu'elles soient espacées de 10 millimètres.

Ensuite, saisissez cette distance dans la fenêtre du curseur de distance et cliquez sur le bouton Cal. Ajustez ensuite les curseurs de gain, de luminosité et d'obturateur dans la fenêtre du poste de calibration afin que le segment de tissu apparaisse comme une silhouette sombre sur un fond clair. Réglez ensuite les molettes de mise au point et d'ouverture situées sur l'appareil photo lui-même pour améliorer davantage l'image.

Pour terminer l'étalonnage de l'image, cliquez sur Enregistrer, puis sur Oui dans l'écran contextuel. Enfin, cliquez sur Quitter. Après la période d'équilibration de trente minutes, commencez l'expérience.

Commencez par nommer l'essai expérimental. Ensuite, obstruez la lumière du tube sortant du cathéter aboral à l’aide du pinçon en plastique. Puis injectez environ 7 millilitres de tampon de Krebs dans la lumière colique proximale.

L'objectif est de provoquer une distension suffisante pour initier des contractions propulsives. Une fois le segment distendu par le liquide luminal, commencez l'enregistrement vidéo. Dans le logiciel, double-cliquez sur l'essai nommé pour ouvrir la vue caméra expérimentale, puis cliquez sur l'interrupteur bascule pour l'activer et visualiser le champ de la caméra.

Collecter une durée prédéterminée de données vidéo. À la fin de ce premier essai de distension contrôlée, desserrer ou retirer le clamp afin de permettre au segment de tissu d'expulser le liquide de distension de la lumière. Laisser le tissu retrouver un état d'équilibre pendant 10 à 20 minutes, puis répéter la procédure en utilisant le traitement.

Une seule préparation tissulaire peut subir jusqu'à cinq traitements de 10 minutes, avec les périodes de repos appropriées entre chaque test. Veillez à observer l'exfoliation de la muqueuse, qui signale une dégradation du tissu. Pour analyser l'enregistrement, double-cliquez sur le nom d'un essai spécifique afin d'ouvrir la fenêtre d'analyse permettant la construction d'une carte ST.

Dans la zone de lecture vidéo, réglez les curseurs de contraste et de luminosité pour obtenir une image adaptée à l'analyse. Créez une silhouette noire du tissu sur un fond clair. Ensuite, positionnez les repères rouges horizontaux et verticaux dans la fenêtre d'image vidéo afin d'isoler la région du tissu à analyser et supprimer les zones contenant des artefacts.

Ensuite, définissez la durée d'analyse. Cliquez sur le bouton vert A pour sélectionner le point de départ, puis sur le bouton jaune B pour le point d'arrêt, une fois que le curseur temporel est correctement positionné. Sélectionnez ensuite l'onglet Analyse du moteur pour ouvrir la fenêtre de la carte ST, puis cliquez sur le bouton chronomètre.

Commencez la génération de la carte ST en cliquant sur le curseur en forme de croix à l'intérieur de la silhouette noire du tissu. La génération de la carte peut prendre quelques minutes. Une fois la carte ST construite, sélectionnez la fonction de zoom pour agrandir l'image.

Ensuite, sélectionnez l'option de couleur pour afficher l'image en couleurs plutôt qu'en niveaux de gris. Puis, sélectionnez activer afin que le curseur puisse être utilisé pour sélectionner le pixel à analyser. Pour le tissu associé aux pixels sélectionnés, la variation du diamètre luminal au fil du temps est analysée et affichée sous forme d'un tracé du diamètre des grains à droite de la carte ST.

Après les analyses, sélectionnez Quitter. Exportez maintenant la carte ST à d'autres fins en sélectionnant Fichier, puis Exporter les données, puis Métafichier. Nommez le fichier et enregistrez-le au format emf en cliquant sur Enregistrer.

Les cartes générées par cette technique montrent les changements du diamètre luminal du tissu en fonction de la distance et du temps. La distance horizontale est représentée sur l'axe des X, et le temps sur l'axe des Y, le temps initial étant en haut et le temps final en bas. Dans le coin supérieur droit se trouve une légende indiquant les diamètres luminaux minimum et maximum, ainsi que les échelles des axes X et Y.

Ainsi, les différentes nuances de pixels dans l'image en niveaux de gris correspondent à différents diamètres luminaux. Les pixels plus foncés correspondent à des diamètres plus larges, et les pixels plus clairs correspondent à des diamètres plus petits. Les ondes contractiles du muscle circulaire apparaîtront comme des régions de pixelisation plus claire en raison de la réduction du diamètre luminal.

En revanche, l'élargissement luminal dû à la relaxation du muscle circulaire ou à une grande quantité de liquide est représenté par des pixels plus foncés. Outre les ondes de contraction progressive, le motif de motilité de mélange appelé segmentation peut également être visualisé. De petites contractions stationnaires surviennent simultanément dans différentes régions.

Au fil du temps, ces petites contractions se déplacent vers l'extrémité anale aborale. Les restes de mésentère sur le tissu peuvent provoquer des artéfacts, qui apparaissent sous forme de lignes verticales foncées. Le déplacement horizontal de ces lignes verticales artéfactuelles peut être utilisé pour déterminer le moment du mouvement musculaire longitudinal.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de segments intestinaux pour l'enregistrement vidéo et de la manière de générer la représentation subséquente de la motilité intestinale sous forme de cartes spatiotemporelles. En suivant cette procédure, différents nutriments peuvent être ajoutés à la solution luminale afin de déterminer comment des composants naturels induisent des motifs de motilité spécifiques pour faciliter la digestion et l'absorption. L'utilisation d'agonistes ou d'antagonistes pharmacologiques spécifiques des récepteurs d'agents humoraux neuronaux peut permettre de déterminer les mécanismes par lesquels la motilité est initiée et propagée.

Cette technique pourrait aider à produire des données utiles pour déterminer les composés intéressants pour le traitement des troubles de la motilité.