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Les cellules qui peuvent se différencier en divers types de cellules, appelées cellules souches, sont aujourd'hui au centre d’un des domaines plus passionnants de la science. Cellules souches biologistes sont efforcent de comprendre les mécanismes fondamentaux qui régissent la fonction de ces cellules. Ces chercheurs sont également intéressés par l’exploitation du potentiel remarquable de cellules souches pour traiter des maladies humaines.
JoVE présente ici une introduction à l’univers captivant de biologie des cellules souches. Nous commençons avec une chronologie des études historique, de la première preuve expérimentale pour les cellules souches hématopoïétiques dans les années 1960, aux plus récentes percées comme induite par des cellules souches pluripotentes. Ensuite, principales questions sur la biologie des cellules souches sont introduites, par exemple : comment ces cellules conservent leur aptitude unique à l’auto-renouvellement ? Elle est suivie d’une discussion de certaines méthodes de premier plan permettant de répondre à ces questions. Enfin, plusieurs expériences sont présentés pour illustrer l’utilisation de cellules souches en médecine régénérative.
Comme leur nom l’indique, les cellules souches sont les précurseurs d'où de nombreux différents types de cellules « souches ». Ils sont caractérisés par leur puissance, ou leur capacité à se différencier en cellules de tous les trois couches de germe, ainsi que leur renouvellement ou capacité à produire plus de cellules souches. Dans l’espoir de faire progresser les domaines de la biologie du développement et de la médecine régénérative, les cellules souches chercheurs tentent de comprendre comment ces cellules uniques accomplir un tel exploit majeur.
Cette vidéo couvre des découvertes majeures dans le domaine de la biologie des cellules souches, les questions clées posées par les scientifiques dans ce domaine, des méthodes utilisées par les chercheurs de cellules souches et des applications de recherche sur les cellules souches.
Maintenant que nous avons introduit le concept de cellules souches, nous allons plonger dans la riche histoire de la recherche sur les cellules souches.
Dans les années 1960, les docteurs Ernest McCulloch et James Till découvrirent certains de la première preuve définitive de l’existence de cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse de mammifères adultes. Ces cellules ont la capacité de se renouveler et sont multipotentes, ce qui signifie qu’ils peuvent se différencier en multiple, mais s’y limiter, les types de cellules, à savoir les cellules du sang et le système immunitaire.
En 1988, Irving Weissman et collègues ont mis au point une méthode pour la purification de cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris.
En 1981, le professeur Gail Martin a inventé le terme « cellules souches embryonnaires. » Contrairement aux cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches embryonnaires sont pluripotentes, ayant la capacité de se différencier en tous types de cellules du corps. Elle et scientifiques Martin Evans et Matthew Kaufman, simultanément, mais séparément, développé des méthodes pour extraire la masse cellulaire interne des blastocystes de souris et de leur culture in vitro comme des cellules souches.
En 1998, plus de dix ans après l’isolement de cellules souches embryonnaires de souris, le Dr James Thomson a établi avec succès les premières lignes de cellules souches embryonnaires humaines.
En 2006, une percée majeure a eu lieu avec l’apparition de cellules souches pluripotentes induites comme conçu par le Dr Shinya Yamanaka. S’appuyant sur les travaux de John Gurdon, Yamanaka a développé une méthode pour reprogrammer différencié de cellules vers un État pluripotentes à l’aide de rétrovirus pour induire l’expression d’un petit ensemble de facteurs de transcription maintenant connu comme les « facteurs de Yamanaka ». Les cellules qui en résultent ont été nommés « les cellules souches pluripotentes induites », ou « CISP. » Ces expériences étaient considérés comme si fondamentalement importants que Yamanaka et Gurdon reçurent le prix Nobel en 2012.
À l’heure actuelle, nous avons maintenant des modèles iPSC de plusieurs maladies humaines et les plates-formes de régénération dans de nombreux tissus.
Aujourd'hui, la recherche sur les cellules souches est motivée par plusieurs grandes questions.
L’un des plus importants de ces questions est : Comment maintenir les cellules souches pluripotence et renouvellement ? Il y a deux caractéristiques connexes des cellules souches qui confèrent à ces propriétés. Tout d’abord est l’expression de gènes spécifiques indispensables pour stemness et auto-renouvellement. La seconde est la réactivité des cellules souches pour des facteurs réglementaires qui influent sur l’expression de ces gènes.
La question logique suivante est : Comment est la différenciation des cellules souches réalisé ? Comme une cellule souche se développe en une cellule mature, activation des voies de différenciation spécifique induit des changements dans l’expression génique, désactivation des gènes des cellules souches et tournant sur tissu-spécifiques gènes, qui se traduit par l’augmentation de spécialisation de la fonction cellulaire et de morphologie.
Enfin, nous allons aborder la question principale conduisant la financement de la recherche de cellules souches : les cellules souches peut être utilisés pour traiter la maladie ? Médecine régénérative s’attaque à cette question de deux façons : 1) par régénératives des organes en laboratoire et 2) en livrant des cellules souches par l’intermédiaire de transplantation pour traiter la dégénérescence des tissus.
Maintenant que nous avons présenté certaines des questions clées concernant la biologie des cellules souches, Let ' s go sur certaines des méthodes éminents utilisés pour y faire face.
Microréseau technologie peut être utilisée pour découvrir les gènes qui confèrent puissance et renouvellement dans les cellules souches. Dans cette technique, ARN total est isolé dans une population de cellules, qui agit comme un instantané de l’expression génétique actuelle. Dans une série d’étapes, ce mRNA est converti en une sonde couplée et hybride avec une puce contenant des transcriptions de tout le génome humain. Cette puce de numérisation fournit une lecture des profils d’expression génique relatif. Comme vous pouvez le voir, une cellule souche exprime un ensemble de gènes spécifiques qui diffère d’une cellule différenciée.
Un autre test pour les gènes de la pluripotence implique le système de détection Oct4-GFP. Oct4 est requise pour l’auto-renouvellement et est rapidement diminuées durant la différenciation. Par conséquent, son expression agit comme un indicateur fiable de la « stemness. » Dans cette expérience, les cellules expriment la protéine fluorescente verte sous le contrôle du promoteur Oct4. Ces cellules peuvent ensuite être expérimentalement manipulés, et changements dans l’expression de la GFP sont analysés pour identifier de nouveaux gènes ou facteurs solubles qui modulent l’auto-renouvellement.
Afin d’étudier les cellules souches en vitro, nous devons d’abord comprendre comment leur culture. Cellules souches nécessitent un microenvironnement particulier à maintenir stemness. Ceci peut être réalisé par co-culture de cellules souches avec des cellules nourricières, tels que les fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEFs. MEFs sécrètent un mélange complexe de pluripotence nécessaire et facteurs d’auto-renouvellement.
Parfois, il est souhaitable d’avoir des cultures sans alimentation des cellules souches. La méthode principale de maintenir les lignées cellulaires exempte d’engraissement est de compléter des milieux de culture cellulaire avec stocks réactifs de croissance et des facteurs inhibiteurs.
Différenciation des cellules souches en vitro s’effectue à l’aide de plusieurs méthodes. Expression différentielle des gènes est ultimement responsable de la spécialisation des cellules. Dans les deux étapes méthode que vous voyez ici, cellules souches embryonnaires de souris cultivées sont apprêtés pour un destin neuronal avant d’être davantage différenciées avec milieu inducteur des motoneurones. Ces facteurs activent des voies spécifiques de l’expression génique, ayant pour résultat morphologique et protéomiques changements caractéristiques des neurones moteurs.
Un inconvénient majeur traditionnel in vitro de différenciation est que les plaques plates limitent la croissance 3D des cellules. La pendaison méthode drop et méthodes de la microcapsule contourner ces problèmes. Dans la pendaison baisse technique, petites gouttes de suspensions de cellules souches sont plaqués sur le couvercle d’une boîte de Pétri et cultivés à l’envers pour former des agrégats de cellules souches, appelées corps embryoïdes.
Dans les méthodes de microencapsulation, les cellules souches sont mélangés avec une membrane semi-perméable biocompatible appelé l’alginate et convertis en perles sur plaques de culture cellulaire. Les deux méthodes permettent davantage de différenciation en cellules spécialisées, telles que des neurones dopaminergiques et les cardiomyocytes.
Savoir comment orienter la différenciation est une étape importante vers l’utilisation de cellules souches en médecine régénérative. Thérapie de transplantation de cellules souches a pour but de traiter et de guérir les maladies dégénératives de réparer les tissus endommagés avec des cellules souches. Dans cette expérience, les cellules somatiques des patients sont reprogrammés en cellules iPS via lentivral infection des facteurs Yamanaka. De leur état de pluripotentes, les cellules sont différenciées en cellules spécifiques types et retournés à l’hôte pour réparer les tissus endommagés.
Maintenant que vous savez que certaines des méthodes utilisées pour enquêter sur les cellules souches, nous allons jeter un regard sur comment ces méthodes sont appliquées dans les expériences spécifiques.
Dans cette expérience à l’aide d’un modèle murin de la sclérose en plaques, des cellules souches neurales sont injectés par voie intraveineuse à des souris touchées. Coupes de cerveau de souris traitées sont collectés et imagés sous un microscope pour évaluer la réussite de la transplantation. Cellules dérivées de cellules précurseurs neuronaux du donneur sont suivies à l’aide du gène rapporteur LacZ. Comme vous pouvez le voir, un certain nombre de cellules souches du donneur ont différenciés et intégrés dans le système nerveux central de souris malades.
Non chaque maladie peut être traitée par injections systémiques. Les lésions du cartilage, par exemple, exigent un échafaudage spécialisé pour reconstruire autour. Dans cette expérience, un mélange de cellules souches mésenchymateuses et des facteurs de coagulation sont élevées ensemble pour former un caillot. Le caillot est ensuite placé dans le cartilage du genou endommagé d’un lapin et permis d’intégrer. En suivant cette procédure, remodelage du cartilage du genou à un joint lisse et fonctionnel peut être observée.
Parfois, cellules souches chercheurs et ingénieurs de tissu s’associent pour reconstruire des organes ensemble. Dans cette expérience, primate poumons sont lavés pour decellularize l’orgue, laissant seulement des composants structurels non alvéolaire. Ce poumon « fantôme » est ensuite transféré dans un bioréacteur, où elle est ensemencée avec des cellules souches épithéliales et vasculaires. Pour plus amples simuler la pression et le comportement que les expériences d’un poumon naturel, le bioréacteur circule médias, maintient les niveaux de pression et gaz et gonfle les poumons.
Vous avez regardé juste aperçu de biologie de JoVE cellules souches. Pour rappel, dans cette vidéo nous avons discuté des cellules souches et leur histoire, maintenance, méthodes de différenciation et de la livraison et demandes de cellules souches. Merci de regarder !
Comme leur nom l’indique, les cellules souches sont les précurseurs à partir desquels de nombreux types de cellules différents « s’enchaînent ». Ils se caractérisent par leur puissance, ou leur capacité à se différencier en cellules à partir des trois couches germinales, ainsi que par leur renouvellement, ou leur capacité à générer plus de cellules souches. Dans l’espoir de faire progresser les domaines de la biologie du développement et de la médecine régénérative, les chercheurs en cellules souches s’efforcent de comprendre comment ces cellules uniques accomplissent un exploit aussi majeur.
Cette vidéo couvre les découvertes majeures dans le domaine de la biologie des cellules souches, les questions clés posées par les scientifiques dans ce domaine, les principales méthodes utilisées par les chercheurs sur les cellules souches, et les applications de la recherche sur les cellules souches.
Maintenant que nous avons présenté le concept de cellules souches, plongeons dans la riche histoire de la recherche sur les cellules souches.
Dans les années 1960, les Drs Ernest McCulloch et James Till ont découvert certaines des premières preuves définitives de l’existence de cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse de mammifères adultes. Ces cellules ont la capacité de s’auto-renouveler et sont multipotentes, ce qui signifie qu’elles peuvent se différencier en plusieurs types de cellules, mais limités, à savoir les cellules du sang et les systèmes immunitaire.
En 1988, Irving Weissman et ses collègues ont mis au point une méthode de purification des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris.
En 1981, le professeur Gail Martin a inventé le terme « cellule souche embryonnaire ». Contrairement aux cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches embryonnaires sont pluripotentes, ayant la capacité de se différencier en tous les types de cellules du corps. Elle et les scientifiques Martin Evans et Matthew Kaufman, simultanément, mais séparément, ont développé des méthodes pour extraire la masse cellulaire interne des blastocystes de souris et les cultiver in vitro en tant que cellules souches.
En 1998, plus de dix ans après l’isolement de cellules souches embryonnaires de souris, le Dr James Thomson a réussi à établir les premières lignées de cellules souches embryonnaires humaines.
En 2006, une percée majeure s’est produite avec l’avènement des cellules souches pluripotentes induites, telles que conçues par le Dr Shinya Yamanaka. S’appuyant sur les travaux de John Gurdon, Yamanaka a mis au point une méthode pour reprogrammer des cellules différenciées à un état pluripotent en utilisant des rétrovirus pour induire l’expression d’un petit ensemble de facteurs de transcription maintenant connus sous le nom de « facteurs Yamanaka ». Les cellules résultantes ont été nommées « cellules souches pluripotentes induites », ou « iPSC ». Ces expériences ont été considérées comme si fondamentales que Yamanaka et Gurdon ont reçu le prix Nobel en 2012.
À l’heure actuelle, nous disposons de modèles iPSC de plusieurs maladies humaines et de plateformes de régénération dans plusieurs tissus.
Aujourd’hui, la recherche sur les cellules souches est motivée par plusieurs questions fondamentales.
L’une des plus importantes de ces questions est la suivante : comment les cellules souches maintiennent-elles la pluripotence et la renouvelabilité ? Il existe deux caractéristiques connexes des cellules souches qui confèrent ces propriétés. Tout d’abord, il y a l’expression de gènes spécifiques essentiels à la souche et à l’auto-renouvellement. Le second est la réactivité des cellules souches aux facteurs régulateurs qui affectent l’expression de ces gènes.
La question logique suivante est la suivante : comment la différenciation des cellules souches est-elle dirigée ? Au fur et à mesure qu’une cellule souche se développe en une cellule mature, l’activation de voies de différenciation spécifiques induit des changements dans l’expression des gènes, désactivant les gènes des cellules souches et activant des gènes spécifiques aux tissus, ce qui entraîne une spécialisation croissante de la fonction et de la morphologie cellulaires.
Enfin, abordons la principale question qui sous-tend le financement de la recherche sur les cellules souches : les cellules souches peuvent-elles être utilisées pour traiter les maladies ? La médecine régénérative s’attaque à cette question de deux manières : 1) en faisant repousser des organes en laboratoire, et 2) en délivrant des cellules souches par transplantation pour traiter la dégénérescence des tissus.
Maintenant que nous avons présenté certaines des questions clés concernant la biologie des cellules souches, passons en revue certaines des principales méthodes utilisées pour les aborder.
La technologie des microréseaux peut être utilisée pour découvrir quels gènes confèrent puissance et renouvelleabilité aux cellules souches. Dans cette technique, l’ARN total est isolé d’une population de cellules, ce qui agit comme un instantané de l’expression actuelle des gènes. En une série d’étapes, cet ARNm est converti en une sonde marquée par fluorescence et hybridé en une puce contenant les transcrits de l’ensemble du génome humain. L’analyse de cette puce permet de lire les profils d’expression génique relatifs. Comme vous pouvez le voir, une cellule souche exprime un ensemble spécifique de gènes qui diffère d’une cellule différenciée.
Un autre test pour les gènes de pluripotence implique le système de détection Oct4-GFP. Oct4 est requis pour l’auto-renouvellement et est rapidement régulé à la baisse lors de la différenciation. Par conséquent, son expression agit comme un indicateur fiable de la « souche ». Dans cette expérience, les cellules expriment une protéine fluorescente verte sous le contrôle du promoteur Oct4. Ces cellules peuvent ensuite être manipulées expérimentalement, et les changements dans l’expression de la GFP sont analysés pour identifier de nouveaux gènes ou facteurs solubles qui modulent l’auto-renouvellement.
Afin d’étudier les cellules souches in vitro, nous devons d’abord comprendre comment les cultiver. Les cellules souches ont besoin d’un microenvironnement particulier pour maintenir leur souche. Cela peut être réalisé en co-cultivant des cellules souches avec des cellules nourricières, telles que des fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEF. Les MEF sécrètent un mélange complexe de facteurs nécessaires de pluripotence et d’auto-renouvellement.
Parfois, il est souhaitable d’avoir des cultures de cellules souches exemptes de nourrisseurs. La principale méthode pour maintenir des lignées cellulaires exemptes de nourrisseurs consiste à compléter les milieux de culture cellulaire avec des réactifs de croissance et des facteurs inhibiteurs.
La différenciation des cellules souches in vitro se fait à l’aide de plusieurs méthodes. L’expression différentielle des gènes est finalement responsable de la spécialisation des cellules. Dans la méthode en deux étapes que vous voyez ici, des cellules souches embryonnaires de souris cultivées sont préparées à un destin neuronal avant d’être différenciées davantage avec un milieu d’induction de motoneurones. Ces facteurs activent des voies spécifiques d’expression génique, entraînant des changements morphologiques et protéomiques caractéristiques des motoneurones.
L’un des principaux inconvénients de la différenciation in vitro traditionnelle est que les plaques plates limitent la croissance 3D des cellules. La méthode de la goutte suspendue et les méthodes des microcapsules contournent ces problèmes. Dans la technique de la goutte suspendue, de petites gouttes de suspensions de cellules souches sont plaquées sur le couvercle d’une boîte de Pétri et cultivées à l’envers pour former des agrégats de cellules souches appelées corps embryoïdes.
Dans les méthodes de microencapsulation, les cellules souches sont mélangées à une membrane semi-perméable biocompatible appelée alginate et déposées sous forme de billes dans des plaques de culture cellulaire. Les deux méthodes permettent une différenciation plus poussée en cellules spécialisées, telles que les neurones dopaminergiques et les cardiomyocytes.
Savoir comment diriger la différenciation est une étape majeure vers l’utilisation des cellules souches en médecine régénérative. La thérapie de greffe de cellules souches vise à traiter et à guérir les maladies dégénératives en réparant les tissus endommagés avec des cellules souches. Dans cette expérience, les cellules somatiques de patients sont reprogrammées en cellules iPS via une infection lentitrale des facteurs Yamanaka. À partir de leur état pluripotent, les cellules sont différenciées en types cellulaires spécifiques et retournées à l’hôte pour réparer les tissus endommagés.
Maintenant que vous connaissez certaines des méthodes utilisées pour étudier les cellules souches, voyons comment ces méthodes sont appliquées dans des expériences spécifiques.
Dans cette expérience utilisant un modèle murin de sclérose en plaques, des cellules souches neurales sont injectées par voie intraveineuse à des souris affectées. Des tranches de cerveau de souris traitées sont prélevées et imagées au microscope afin d’évaluer le succès de la transplantation. Les cellules dérivées de cellules précurseurs neuronales de donneurs sont suivies à l’aide du gène rapporteur LacZ. Comme vous pouvez le constater, un certain nombre de cellules souches de donneurs se sont différenciées et intégrées dans le système nerveux central de souris malades.
Toutes les affections ne peuvent pas être traitées par des injections systémiques. Les lésions du cartilage, par exemple, nécessitent un échafaudage spécialisé pour reconstruire. Dans cette expérience, un mélange de cellules souches mésenchymateuses et de facteurs de coagulation est cultivé ensemble pour former un caillot. Le caillot est ensuite placé dans le cartilage du genou endommagé d’un lapin et laissé s’intégrer. Suite à cette procédure, un remodelage du cartilage du genou en une articulation lisse et fonctionnelle peut être observé.
Parfois, les chercheurs sur les cellules souches et les ingénieurs tissulaires font équipe pour reconstruire des organes entiers. Dans cette expérience, les poumons des primates sont lavés pour décellulariser l’organe, ne laissant derrière eux que les composants structurels non cellulaires. Ce poumon « fantôme » est ensuite transféré dans un bioréacteur, où il est ensemencé de cellules souches vasculaires et épithéliales. Pour imiter davantage la pression et le comportement d’un poumon naturel, le bioréacteur fait circuler les fluides, maintient la pression et les niveaux de gaz et gonfle les poumons.
Vous venez de regarder l’aperçu de la biologie des cellules souches de JoVE. Pour récapituler, dans cette vidéo, nous avons discuté des cellules souches et de leur histoire, de l’entretien, de la différenciation et des méthodes d’administration, ainsi que des applications des cellules souches. Merci d’avoir regardé !
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