Moustaches de signalisation eyeblink conditionnement classique chez les souris de tête-fixe

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser les avancées génétiques chez la souris et nos connaissances du système des vibrisses pour étudier les bases neurobiologiques du conditionnement de clignement des yeux, un paradigme transposable à l'étude de l'apprentissage et de la mémoire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions mécanistiques en matière d'apprentissage et de mémoire en combinant l'imagerie calcique et l'électrophysiologie chez des souris génétiquement modifiées, tout en stimulant des vibrisses spécifiques durant le conditionnement. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de fixer la tête des souris tout en minimisant leur stress, en leur permettant de se déplacer à leur propre rythme sur un tapis roulant cylindrique.

Les implications de cette technique s'étendent à des traitements potentiels des troubles de la mémoire, notamment ceux associés au vieillissement normal et à la maladie d'Alzheimer. La préparation du cylindre et du système de stimulation des vibrisses sont chacune décrites dans le protocole textuel. Cette section couvre la préparation de l'élément crânien.

La bande de fixation est une bande imprimée en 3D comportant sept trous, modélisée d'après la bande en nylon de la série Amphenol 221 qui n'est plus fabriquée commercialement. À partir de la pièce imprimée en 3D, taraudez le premier trou de la bande pour une vis machine de 0-80 par un pouce et laissez un trou vide après le premier trou. Ensuite, à l'aide d'un étau, insérez cinq broches dorées dans les cinq trous restants.

Insérez les épingles dans les trous les plus étroits du plastique. Ensuite, à l’aide d’un dénudeur thermique, retirez un demi-centimètre de revêtement en polyimide. Puis, soudez l’extrémité dénudée à l’une des épingles, là où l’épingle présente une ouverture.

Coupez le fil soudé à une longueur comprise entre six et sept millimètres et dénudez-en environ deux millimètres. Répétez maintenant ce processus afin d’attacher au total quatre fils aux cinq broches. Les deux premiers fils enregistreront les réponses EMG des paupières, tandis que les deux suivants délivreront une stimulation électrique à la région périorbitaire.

Sur la cinquième broche, souder un fil en acier inoxydable nu de cinq centimètres servant de masse électrique. Après avoir effectué toutes les connexions, vérifier chacune d’entre elles à l’aide d’un multimètre afin de s’assurer de leur continuité électrique. Commencer avec un animal complètement anesthésié, dont l’état est confirmé par une pincée au niveau de l’orteil.

Injecter une dose de chlorure de buprénorphine comme analgésique. Ensuite, appliquer une petite quantité de pommade ophtalmique sur les cornées et raser le sommet de la tête de l'animal. Puis, fixer la tête de l'animal sur un cadre stéréotaxique et désinfecter le cuir chevelu à l’aide de trois applications alternées de povidone-iodée et d’alcool.

Avec une lame de scalpel n°10 ou 15, pratiquez une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu, en exposant le crâne depuis l'avant des yeux jusqu'au-delà de l'os interpariétal. Écartez les lambeaux de peau à l'aide de six microclips, en exposant autant que possible la surface du crâne, y compris les côtés et la partie postérieure. Ensuite, utilisez le scalpel pour gratter le périoste recouvrant le crâne.

Ensuite, nettoyer le dessus du crâne avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % trois fois. Une fois le crâne sec, percer deux trous à l'aide d'une fraise conique inversée de taille 34, en prenant soin de ne pas endommager le cerveau. Placer un trou devant le bregma et l'autre trou devant le lambda, à gauche de la ligne médiane lorsqu'on conditionne l'œil droit, ou inversement.

Il faut percer soigneusement ces trous afin d’y insérer les vis, en prenant grand soin de ne pas endommager le cerveau. Insérez dans les trous des vis destinées aux connexions électriques. Chaque tour complet abaisse la vis de 0,28 millimètre ; ainsi, deux tours complets suffisent.

Ensuite, créez plusieurs petites dépressions sur le crâne afin d'augmenter la surface de contact pour le ciment. À partir de la pièce crânienne terminée, enroulez le fil de masse en configuration en huit autour des deux vis. Laissez une certaine marge de manœuvre dans le fil de masse afin que la pièce crânienne puisse être positionnée correctement.

Appliquez maintenant du ciment de scellement froid. Recouvrez généreusement le crâne et les vis, puis laissez le ciment sécher. Une fois le ciment sec, positionnez la pièce crânienne verticalement, avec les broches orientées vers le haut au-dessus du crâne.

Fixer le dispositif sur la tête à l’aide d’un support attaché à un bras du cadre. Le support doit comporter cinq douilles plaquées or destinées à accueillir les broches du dispositif. Placer les deux fils EMG sur le muscle orbiculaire de l’œil, au-dessus de l’orbite.

Ensuite, positionnez les deux fils stimulateurs. Placez les extrémités dénudées sous la peau, à deux à quatre millimètres en arrière de l'œil. Veillez à ce que leurs extrémités ne se touchent pas.

Si les fils sont si longs qu'ils pourraient rayer l'œil de l'animal, raccourcissez-les ou repliez-les vers l'arrière. Une petite partie du fil nu doit rester exposée. Collez maintenant la base des fils sur le crâne avec un peu plus de ciment de scellement et laissez sécher.

Utilisez environ la moitié du volume précédemment utilisé. Pour poursuivre, retirez les microclips et repositionnez la peau. Laissez la peau s'ajuster naturellement afin d'éviter toute tension qui déformerait la paupière, empêchant le clignement et compromettant ainsi l'expérience.

Une fois que la peau est en place, retirez le support de l’implant et scellez la zone exposée avec du ciment dentaire. Évitez de faire tomber du ciment sur les yeux ou sur les broches de l’implant. Utilisez ensuite un coton-tige humidifié avec du solvant de ciment dentaire pour lisser et façonner le ciment partiellement polymérisé selon les besoins.

Une fois que le ciment est complètement sec, retirer l'animal de la barre stéréotaxique et lui permettre de se remettre sur une surface chaude avant de le ramener à sa cage d'origine. Commencer l'habituation des souris après qu'elles aient eu au moins cinq jours de temps de récupération. Pour immobiliser la souris, la maintenir brièvement par la queue afin de la pincer juste derrière les épaules.

Ensuite, soulevez la souris par-dessous l'abdomen et le tronc. Puis, fixez un connecteur sur la pièce montée sur la tête et serrez la vis de verrouillage. Placez ensuite délicatement la souris sur le cylindre et maintenez-la immobile tout en utilisant deux vis pour fixer le connecteur aux barres situées au-dessus du cylindre.

Ensuite, relâchez la souris. Lors des deux premières séances, laissez la souris s'habituer au cylindre pendant la même durée qu'une séance de conditionnement. Pendant l'habituation, enregistrez la fréquence spontanée des clignements.

En outre, exposez préalablement les souris au stimulateur de vibration des vibrisses sans appliquer de stimulation électrique. Avec le système piézo proche du côté conditionné, faites glisser les dents du peigne sur les vibrisses individuelles. Sélectionnez les mêmes vibrisses pour chaque séance.

Procédez ensuite à l'entraînement par conditionnement classique tel que décrit dans le texte. Des souris mâles C57 Black 6J âgées de huit à dix semaines ont été entraînées au conditionnement oculaire avec intervalle dans un tapis roulant cylindrique fixé à la tête. Des enregistrements EMG de chaque essai ont été effectués.

Les EMG ont été redressés et intégrés avec une constante de temps de 10 millisecondes, puis moyennés sur l'ensemble des essais. L'évolution des réponses conditionnées au cours de 10 séances d'entraînement montre que progressivement, l'amplitude de la réponse a augmenté et que la latence de la réponse a diminué. Cette évolution n'est pas observée dans les réponses des souris pseudoconditionnées, où les stimuli sont présentés en ordre aléatoire.

On peut également observer l'évolution de réponses conditionnées bien synchronisées, et donc bien apprises, dans les histogrammes du temps nécessaire pour atteindre le pic de réponse après le début du stimulus conditionné. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer la pièce crânienne, implanter chirurgicalement cette pièce sur un souris, et placer le souris sur un tapis roulant cylindrique, pour un conditionnement oculo-palpébral chez des animaux immobilisés en tête. Vos souris devraient présenter une bonne courbe d'apprentissage au fil des jours, au fur et à mesure qu'elles acquièrent le conditionnement.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de rester vigilant et d'observer attentivement tout signe de détresse chez les animaux. Des mesures appropriées doivent être prises afin de minimiser le stress des animaux.