Moustaches de signalisation eyeblink conditionnement classique chez les souris de tête-fixe

L’objectif global de ce protocole est d’utiliser les progrès génétiques chez la souris et notre compréhension du système des moustaches pour étudier la base neurobiologique du conditionnement du clignement des yeux, un paradigme traduisible pour l’étude de l’apprentissage et de la mémoire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions mécanistes dans l’apprentissage et la mémoire en utilisant l’imagerie calcique et l’électrophysiologie chez des souris génétiquement manipulées tout en stimulant des moustaches spécifiques pendant le conditionnement. Le principal avantage de cette technique est la capacité de sécuriser la tête des souris tout en minimisant le stress, en permettant aux souris de se déplacer à leur propre rythme sur un tapis roulant cylindrique.

Les implications de cette technique s’étendent aux traitements potentiels des troubles de la mémoire, y compris ceux associés au vieillissement normal et à la maladie d’Alzheimer. La préparation du cylindre et le système de stimulation des moustaches sont chacun couverts dans le protocole textuel. Cette section couvre la préparation de la têtière.

La bande de tête est une bande imprimée en 3D à sept trous modélisée à partir de la bande de nylon de la série Amphenol 221 qui n’est plus fabriquée dans le commerce. À partir de la pièce imprimée en 3D, tapotez le premier trou de la bande pour une vis à métaux de 0 à 80 par un pouce et laissez un trou vide après le premier trou. Ensuite, à l’aide d’un étau, placez cinq goupilles plaquées or dans les cinq trous restants.

Poussez les goupilles à travers les trous plus étroits du plastique. Ensuite, à l’aide d’un décapant thermique, décapage d’un demi-centimètre de revêtement en polyimide. Ensuite, soudez l’extrémité dénudée à l’une des broches où la broche a une ouverture.

Coupez le fil soudé entre six et sept millimètres et dénudez environ deux millimètres du fil. Maintenant, répétez ce processus pour attacher quatre fils au total aux cinq broches. Les deux premiers fils enregistreront les réponses EMG des paupières tandis que les deux suivants fourniront une stimulation électrique à la région périorbitaire.

À la cinquième broche, soudez un fil d’acier inoxydable non isolé de cinq centimètres pour servir de terre électrique. Après avoir effectué toutes les connexions, vérifiez chacune d’entre elles avec un multimètre pour vous assurer de leur continuité électrique. Commencez par un animal complètement anesthésié, confirmé par un pincement des orteils.

Injectez une dose de chlorhydrate de buprénorphine comme analgésique. Appliquez ensuite une petite quantité de pommade ophtalmique sur les cornées et rasez le haut de la tête de l’animal. Ensuite, fixez la tête de l’animal à un cadre stéréotaxique et désinfectez le cuir chevelu avec trois gommages alternés de povidone iodée et d’alcool.

Avec une lame de scalpel numéro 10 ou 15, faites une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu, exposant le crâne de l’avant des yeux jusqu’au-delà de l’os interpariétal. Rétractez les lambeaux de la peau à l’aide de six microclips, en exposant autant que possible le crâne, y compris les côtés et le dos. Ensuite, utilisez le scalpel pour gratter le périoste du crâne.

Nettoyez ensuite trois fois le haut du crâne avec du peroxyde d’hydrogène à 3 %. Une fois le crâne sec, percez deux trous avec une fraise à cône inversé de taille 34, en faisant attention de ne pas endommager le cerveau. Placez un trou devant bregma, et placez l’autre trou devant lambda, à gauche de la ligne médiane lors du conditionnement de l’œil droit, ou vice versa.

Ces trous doivent être percés avec soin pour s’adapter aux vis, et un grand effort doit être fait pour ne pas endommager le cerveau. Dans les trous, placez les vis pour les connexions électriques. Chaque tour complet abaissera la vis de 0,28 millimètre, donc deux tours complets suffisent.

Ensuite, créez plusieurs petits divits sur le crâne afin d’augmenter la surface du ciment. À partir de la tête terminée, enroulez le fil de terre en forme de huit autour des deux vis. Laissez un peu de mou dans le fil de terre afin que la têtière puisse être positionnée correctement.

Maintenant, appliquez du ciment de scellement à froid. Enduire généreusement le crâne et les vis et laisser sécher le ciment. Une fois le ciment séché, positionnez la têtière à la verticale, les épingles se dressant au-dessus du crâne.

Fixez la têtière à l’aide d’un support fixé à un bras du cadre. Le support doit avoir cinq douilles plaquées or pour accepter les goupilles de la têtière. Positionnez les deux fils EMG sur le muscle orbiculaire oculi au-dessus de l’orbite.

Ensuite, positionnez les deux fils de stimulation. Mettez les pointes dénudées sous la peau de deux à quatre millimètres directement caudales à l’œil. Ne laissez pas leurs extrémités se toucher.

Si les fils sont si longs qu’ils pourraient rayer l’œil de l’animal, coupez-les ou pliez-les. Certains fils nus doivent rester exposés. Maintenant, cimentez la base des fils sur le crâne avec un peu plus de ciment de scellement et laissez-le sécher.

Utilisez environ la moitié du volume précédemment utilisé. Pour continuer, retirez les microclips et repositionnez la peau. Laissez la peau se stabiliser naturellement pour éviter les tensions sur la peau qui déformeraient la paupière, inhiberaient le clignement des yeux et ruineraient ainsi l’expérience.

Une fois la peau installée, retirez le porte-casque et scellez la zone exposée avec du ciment dentaire. Évitez de faire couler du ciment sur les yeux ou les épingles de la têtière. Ensuite, utilisez un coton-tige imbibé d’un solvant de ciment dentaire pour lisser et manipuler le ciment partiellement durci au besoin.

Une fois que le ciment a complètement séché, retirez l’animal du cadre stéréotaxique et laissez-le récupérer sur une surface chaude avant de le remettre dans sa cage d’origine. Commencez à habituer les souris après qu’elles aient eu au moins cinq jours de temps de récupération. Pour sécuriser la souris, retenez-la brièvement par la queue pour la pincer derrière les épaules.

Soulevez ensuite la souris sous l’abdomen et le torse. Ensuite, fixez un connecteur à l’embout de tête et tournez la vis de blocage. Ensuite, placez doucement la souris sur le cylindre et maintenez-la immobile tout en utilisant deux vis pour fixer le connecteur aux barres au-dessus du cylindre.

Relâchez ensuite la souris. Au cours des deux premières sessions, laissez la souris s’habituer au cylindre pendant la même durée qu’une séance de conditionnement. Pendant l’habituation, notez le taux de clignements spontanés.

De plus, pré-exposez les souris au stimulateur de vibration des moustaches sans appliquer de stimulation électrique. Avec le système piézoélectrique près du côté conditionné, glissez les dents du peigne sur les moustaches individuelles. Sélectionnez les mêmes moustaches pour chaque session.

Procédez ensuite à l’entraînement de conditionnement classique tel que présenté dans le texte. Des souris mâles C57 Black 6J âgées de huit à dix semaines ont été entraînées avec un conditionnement à l’état de traces de clignement des yeux dans le tapis roulant cylindrique fixé à la tête. Des enregistrements EMG de chaque essai ont été réalisés.

Les EMG ont été rectifiés et intégrés avec une constante de temps de 10 millisecondes, puis la moyenne a été calculée sur tous les essais. L’évolution des réponses conditionnées sur 10 séances d’entraînement montre que progressivement la réponse a augmenté en amplitude et que la latence de la réponse est devenue plus courte. Cette évolution n’est pas observée dans les réponses des souris pseudoconditionnées, où les stimuli sont présentés dans un ordre aléatoire.

L’évolution des réponses conditionnées bien synchronisées, et donc bien apprises, peut également être observée dans les histogrammes du temps jusqu’au pic de la réponse après l’apparition de la CS. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer la coiffe, d’implanter chirurgicalement la pièce de tête sur une souris et de placer la souris sur le tapis roulant cylindrique, pour le conditionnement du clignement des yeux fixe. Vos souris devraient présenter une bonne courbe d’apprentissage au fil des jours à mesure qu’elles acquièrent le conditionnement.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de rester vigilant et d’observer toute détresse des animaux. Des mesures appropriées doivent être prises afin de minimiser le stress des animaux.