Name: Mesure de la diffusion non-linéarités dune nanoparticule plasmonique Simple (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Découvrez comment améliorer la résolution en microscopie optique grâce à la diffusion non linéaire de nanostructures plasmoniques. Cette méthode utilise des nanoparticules d'or pour créer un contraste intense et non photoblanchissable.

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Ce travail est soutenu par le ministère des Sciences et de la Technologie sous les numéros NSC-101-2923-M-002-001-MY3 et NSC-102-2112-M-002-018-MY3. Cette recherche est également soutenue par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) par le biais du « Programme de financement pour la prochaine génération de chercheurs de renommée mondiale (programme NEXT) », initié par le Conseil pour la politique scientifique et technologique (CSTP) et le programme CORE asiatique de JSPS.

1. GNS de préparation d&#39;échantillons <ol><li> Avant de préparer l&#39;échantillon, sonication 1 ml GNS solution colloïdale pendant au moins 15 min à environ 40 kHz pour empêcher l&#39;agrégation des particules, qui peut provoquer le pic LSPR de changer. </li><li> Déposez 100-200 pi de GNS colloïde sur une lame de verre avec commerciale silicate de magnésium aluminium (MAS) pour fixer le revêtement GNSS. </li><li> Après au moins 1 min, retirez le colloïde supplémentaire par rinçage avec de l&#39;eau distillée. Le temps d&#39;attente dépend de la densité de distribution requise du GNSS. Typiquement, les résultats de 1-3 min dans une densité appropriée qui permet aux particules d&#39;être facilement identifiées puisque la plupart d&#39;entre eux sont isolés les uns des autres. Agrégation significative peut se produire si le temps d&#39;attente est trop long. </li><li> Sécher l&#39;échantillon en le purgeant avec de l&#39;azote gazeux. </li><li> (Facultatif) Pour la carte du GNSS sur la vitre avec une haute résolution, effectuer la microscopie électronique à balayage (MEB) à ce stade 23. Une image d&#39;exemple est fourni dans Figure 1, montrant la densité caractéristique du GNSS. Utiliser une émission de champ MEB d&#39;acquérir l&#39;image. Une fois que l&#39;huile est ajoutée à l&#39;échantillon (étape suivante), il sera difficile d&#39;enlever l&#39;huile et à observer l&#39;échantillon par SEM. </li><li> Ajouter une goutte d&#39;huile avec le même indice de réfraction sur l&#39;échantillon pour couvrir le GNSS et à éliminer la forte réflexion à partir du substrat de verre. </li><li> Placez un couvercle en verre sur le dessus de l&#39;échantillon et le sceller avec du vernis à ongles. </li><li> Attendez au moins 5 min jusqu&#39;à ce que le vernis à ongles sèche. L&#39;échantillon est maintenant prêt. </li></ol> 2. Alignement du microscope confocal maison construite <ol><li> Voir Figure 2 pour le schéma de l&#39;installation. Aligner le blanc trajet d&#39;illumination de la lumière du corps de microscope lui-même. Allumez la source de lumière halogène du microscope, et suivre le manuel du fabricant de microscope pour obtenir la condition d&#39;éclairage Köhler. Veiller à ce que les blancs faisceaux de lumière halogène sont à peu près parallèle à l&#39;arrière deouverture de l&#39;objectif, partiellement réfléchie par le diviseur de faisceau 50/50, puis se propage vers le laser. </li><li> Allumez les miroirs de galvanoplastie à veiller à ce qu&#39;ils restent dans la position initiale correcte, qui est, au centre de la plage de balayage. </li><li> Placez au moins deux cibles, faites par une mince feuille de papier avec des anneaux concentriques sur elle, le long du chemin de lumière halogène, et les aligner avec le faisceau d&#39;halogène. </li><li> Pour effectuer l&#39;imagerie, sélectionnez le laser de 532 nm. Pour effectuer des mesures de spectroscopie, sélectionnez le laser super-continuum. Au cours de l&#39;alignement, la puissance des lasers doit être inférieure à 10 mW à l&#39;ouverture arrière de l&#39;objectif d&#39;éviter la non-linéarité. Ensuite, collimater le faisceau laser incident opposé au faisceau sortant d&#39;halogène à l&#39;aide des deux cibles. Lorsque ce processus est terminé, l&#39;alignement grossier du faisceau laser a été atteint. </li><li> Aligner le faisceau laser à travers le centre de l&#39;ouverture arrière de la lentille d&#39;objectif. Typiquement, utiliser un oiobjectif l-immersion. Ajouter une goutte d&#39;huile entre l&#39;huile d&#39;immersion objectif et l&#39;échantillon GNS. Utilisez un tube photomultiplicateur (PMT) que le détecteur de recueillir les signaux de diffusion du GNSS. </li><li> Placez un sténopé de 20 um de diamètre à l&#39;avant de la PMT pour bloquer out-of-focus signaux de diffusion. Tourner sur les miroirs de galvanoplastie et PMT (via le logiciel maison construite), ajuster la position sténopé et la hauteur de la scène de l&#39;échantillon afin de maximiser les signaux de rétrodiffusion du GNSS, puis observer une GNS individuels sur un écran d&#39;ordinateur. Un exemple d&#39;image xy du GNSS avec un alignement correct est montré dans la figure 2B. </li><li> Modifiez légèrement la hauteur de la scène de l&#39;échantillon pour vérifier la concentricité de la mise au point. Dans le cas contraire concentrique, ajuster le faisceau avec les deux miroirs en avant du scanner jusqu&#39;à ce que le centre du GNS reste à la même position tandis que la hauteur de la platine porte-échantillon est changé. Assurez-vous que l&#39;image de XZ de la PSF est similaire à la figure 2Cpour assurer l&#39;alignement du faisceau correcte. Traiter ces deux images avec passe-bas et filtres lisses gaussiennes. </li></ol> 3. Caractérisation de la diffusion non-linéarité <ol><li> A faible intensité d&#39;excitation (moins de 10 4 W / cm 2), acquérir une image de nanoparticules d&#39;or en suivant le protocole 2.6. </li><li> Ouvrez l&#39;image dans ImageJ (ou tout autre logiciel d&#39;analyse d&#39;image). Tracez une ligne sur l&#39;un des GNSS dans l&#39;image (voir la figure 2B), et utiliser l&#39;analyse -&gt; profil du terrain des outils de ImageJ pour récupérer le profil d&#39;intensité de diffusion. Monter le profil de la PSF choisi par une fonction gaussienne: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq2.jpg" /> où y est la valeur de lecture de PMT, y 0 est la valeur de fond (le cas échéant), A est l&#39;amplitude de crête, w est la largeur, x est la coordonnée spatiale, et x c est le centre Coordonnateure de la fonction gaussienne. Le FWHM de la PSF correspondante est (½ln2) w. Sur la base de l&#39;ouverture numérique (NA) de l&#39;objectif, la FWHM théorique de la PSF confocal peut être estimée à environ 0.43l / NA, où l est la longueur d&#39;onde d&#39;excitation. Comparez ces deux numéros pour vérifier l&#39;alignement du système d&#39;imagerie. </li><li> Augmenter l&#39;intensité d&#39;excitation en modifiant manuellement le filtre à densité neutre (ND) sur la figure 2A, et d&#39;enregistrer les images de rétrodiffusion à chaque niveau d&#39;intensité. Prendre la valeur du signal de diffusion du centre de chaque GNS à différentes intensités d&#39;excitation, et de tracer la courbe de diffusion des signaux par rapport aux intensités d&#39;excitation. Vérifier la linéarité des premiers points qui doivent présenter une relation linéaire lorsque l&#39;intensité d&#39;excitation est suffisamment faible. Tracez une ligne sur la base de montage linéaire des quelques premiers points. Si les intensités de diffusion des points suivants tombent en dessous de cette tendance linéaire, saturation est produite. </li><li> Après avoir observé la diffusion saturable, diminuer progressivement l&#39;intensité en dessous du seuil de saturation, et l&#39;image de la même GNSS à nouveau pour assurer la réversibilité des comportements non linéaires. </li></ol> 4. Mesure de la diffusion d&#39;un spectre d&#39;un simple Or Nanosphere <ol><li> Pour mesurer le spectre de rétrodiffusion partir d&#39;un seul GNS, utiliser le laser super-continuum que la source laser. La longueur d&#39;onde initial du laser est comprise entre 450 nm et 1750 nm. Pour supprimer la puissance infrarouge excès qui pourraient causer des dommages à l&#39;échantillon et les composants optiques, placer un ou deux miroirs juste après le laser super-continuum pour réfléchir la lumière visible, et utiliser faisceau décharges pour recueillir l&#39;excès de lumière infrarouge. </li><li> Suivez les procédures d&#39;alignement de la section 2 pour diriger le laser super-continuum dans le microscope à balayage laser confocal. Utilisez une large bande 50/50 BS pour assurer une couverture spectrale sur toute la gamme visible. </li><li> Acquérir uneimage des GNSS sur verre. Repérer un seul GNS dans l&#39;image, et de fixer la mise au point de l&#39;incident à large bande de lumière sur la particule. </li><li> Utilisez un miroir de retournement en face de la PMT pour diriger le signal de rétrodiffusion vers le spectromètre, qui est équipé d&#39;un dispositif à couplage de charge, et ensuite prendre un spectre des GNS simples sélectionnés. Veillez à ce que le spectre est ici un mélange de GNS diffusion et de fond dû à des réflexions d&#39;autres surfaces. </li><li> Revenez au détecteur de PMT, et de prendre une autre image pour confirmer que la position des particules n&#39;a pas changé. Ensuite, déplacer le focus à un point où aucune particule est présente. Revenez au spectromètre, et de prendre un spectre plus large, qui représente l&#39;arrière-plan. </li><li> Soustraire le spectre de l&#39;étape 4.5 de fond à partir du spectre de l&#39;étape 4.4 pour obtenir un spectre de rétrodiffusion clairement d&#39;une seule GNS. </li></ol> 5. Alignement de Microscope SAX <ol><li> Voir la Figure 3pour le régime du microscope SAX, où une modulation temporelle sinusoïdale idéale est obtenue à partir de la fréquence de battement entre deux modulateurs acousto-optiques (AOM). Tout d&#39;abord, régler la taille du faisceau du laser pour répondre à l&#39;exigence des AOM ultérieures. Diviser la lumière laser 532 nm en deux faisceaux à l&#39;aide d&#39;un diviseur de faisceau 50/50. </li><li> Guider les deux faisceaux à travers les deux AOM, avec un faisceau traversant chaque AOM. Les fréquences de modulation des deux AOM doivent être différents. Par exemple, on peut être à 40,000 MHz et l&#39;autre à 40,010 MHz, ce qui donne une différence de fréquence de 10 kHz. Cette fréquence de différence fondamentale sera la fréquence de modulation f m pour les signaux de SAX. </li><li> Prenez le premier ordre des deux faisceaux diffractés AOM, et de combiner les deux faisceaux en utilisant un autre diviseur de faisceau 50/50. Réglez les rétroviseurs après les AOM pour collimater les deux faisceaux. </li><li> Ajouter un photodétecteur qui est relié à un oscilloscope pour surveiller la temporel modulation. Diviser une petite partie du laser avec une lame de verre, et de l&#39;envoyer vers le photodétecteur, comme représenté sur la figure 3. Avec modulation correcte et le chevauchement de faisceau, observer la modulation d&#39;intensité sinusoïdale à la fréquence principale f m, similaire à celle de la forme d&#39;onde montrée la figure 4. Remarque: Le fond de la modulation doit être aussi faible que possible pour atteindre la profondeur de modulation maximale. En outre, utiliser la fonction de l&#39;analyse de Fourier de l&#39;oscilloscope pour vérifier que la distorsion harmonique de la modulation diminue. Pour réaliser la mise en œuvre de SAX succès, d&#39;assurer une modulation de l&#39;intensité d&#39;excitation sinusoïdale parfaite avec non-linéarité initial minimisé. </li><li> Déconnecter la sortie électrique du photodétecteur de l&#39;oscilloscope et connecter à l&#39;entrée d&#39;un amplificateur lock-in référence. </li><li> Comme le montre la Figure 3, aligner le faisceau laser dans le système confocal suivant les protocoles précédents. Havant, connecter la sortie électrique du PMT à l&#39;amplificateur lock-in que l&#39;entrée de signal. </li><li> Utiliser un couvercle en verre blanc comme l&#39;échantillon, et vérifier la linéarité de l&#39;installation de détection électrique en augmentant progressivement la puissance d&#39;excitation ,, comme le montre la Figure 5, où le détecteur linéaire est inférieure à une valeur de lecture de 1-V. Dans toutes les mesures ultérieures, prendre soin de restreindre l&#39;affichage au-dessous de cette valeur. </li><li> Réglez la sortie de l&#39;amplificateur lock-in pour exporter l&#39;amplitude absolue du signal de tension. En changeant la composante harmonique la mise à la voie de référence, obtenir les amplitudes des signaux de Sax, A 1, A 2, et ainsi de suite. </li><li> Export de la linéaires et non linéaires des signaux de l&#39;amplificateur lock-in à une carte d&#39;acquisition de données, qui reçoit également les signaux de tension d&#39;entraînement de miroirs de galvanoplastie de numérisation les raster. A l&#39;aide d&#39;un programme de mesure Labview, synchroniser les signaux de l&#39;amplificateur et le lock-ingalvano miroirs pour former une image. </li><li> Pour optimiser le rapport signal-sur-bruit dans les images, sélectionner de manière appropriée l&#39;acquisition de pixel et des temps d&#39;intégration de l&#39;amplificateur lock-in. Par exemple, lorsque le principal fréquence de modulation f m de l&#39;excitation est de 10 kHz, qui est, quand la période est de 100 microsecondes, régler l&#39;heure de l&#39;intégration de l&#39;amplificateur lock-in pour être au moins trois fois plus longtemps que la période. L&#39;ajout de l&#39;heure du mouvement de miroir galvano, la vitesse d&#39;acquisition est fixée à 1500 pixels par seconde dans le mode d&#39;imagerie SAX. </li></ol>

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<li>Heintzmann, R., Jovin, T. M., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+patterned+excitation+microscopy+-+a+concept+for+optical+resolution+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Saturated patterned excitation microscopy - a concept for optical resolution improvement.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 19 (8), 1599-1609 (2002).</li>
<li>Tzang, O., Pevzner, A., Marvel, R. E., Haglund, R. F., Cheshnovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+in+Label-Free+Photomodulated+Reflectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution in Label-Free Photomodulated Reflectivity.</a> Nano Lett. 15 (2), 1362-1367 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans le protocole, il ya plusieurs étapes critiques. Tout d&#39;abord, lors de la préparation des échantillons, la densité de nanoparticules ne doit pas être trop élevée, pour éviter un couplage plasmonique entre particules. Si deux ou plus de particules sont très proches les uns des autres, les résultats de couplage à la longueur d&#39;onde LSPR déplacent vers des longueurs d&#39;onde, réduisant ainsi de façon significative la non-linéarité. Cependant, cette technique d&#39;imagerie en fait correspondre la répartition ...

L&#39;étude de la plasmonique a suscité un grand intérêt en raison de ses applications dans de nombreux domaines différents 1-4. L&#39;un des domaines les plus étudiés dans la plasmonique est plasmonique de surface, dans lequel l&#39;oscillation collective des électrons de conduction couples avec une onde électromagnétique externe à une interface entre un métal et diélectrique. Plasmonique de surface a été exploré pour ses applications potentielles dans Subwavelength optique, la biophotonique, la microscopie et 5,6. L&#39;amélioration forte de champ dans le volume ultra-faible de nanoparticules métalliques en raison de localisée résonance plasmonique de surface (LSPR) a attiré une grande attention, non seulement en raison de sa sensibilité exceptionnelle à des tailles de particules, des formes de particules, et les propriétés diélectriques du milieu environnant 7 -10, mais aussi en raison de sa capacité à stimuler intrinsèquement faibles effets optiques non linéaires 11. La sensibilité exceptionnelle de LSPR est précieux pour la bio-détection et quasi-FIELes techniques d&#39;imagerie ld 12,13. D&#39;autre part, la non-linéarité améliorée de structures plasmoniques peut être utilisé dans des circuits intégrés photoniques dans des applications telles que la commutation optique et tout-optique de traitement de signal 14,15. Il est bien connu que l&#39;absorption plasmonique est linéairement proportionnelle à l&#39;intensité d&#39;excitation à un niveau de faible intensité. Lorsque l&#39;excitation est assez forte, l&#39;absorption devient saturé. Curieusement, à des intensités plus élevées, l&#39;absorption augmente à nouveau. Ces effets non linéaires sont appelés absorption saturable (SA) 15-17 et arrière absorption saturable (RSA) 18, respectivement. Il est connu qu&#39;en raison de la LSPR, la diffusion est particulièrement forte dans les structures plasmoniques. Basé sur l&#39;électromagnétisme fondamentaux, la réponse de diffusion par rapport à l&#39;intensité de l&#39;incident doit être linéaire. Cependant, dans des nanoparticules, diffusion et l&#39;absorption sont étroitement liés par la théorie de Mie, et les deux peuvent être expressed en termes de parties réelle et imaginaire de la constante diélectrique. Dans l&#39;hypothèse où un seul GNS se comporte comme un dipôle sous illumination de lumière, le coefficient de diffusion (Q SCA) et coefficient d&#39;absorption (Q abs) à partir d&#39;une unique nanoparticule plasmonique en fonction de la théorie de Mie peuvent être exprimées comme 19 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq1.jpg" /> où x est 2 πa / λ, a est le rayon de la sphère, et m 2 est ε m / ε d. Ici, ε et ε m d correspondent aux constantes diélectriques du métal et des diélectriques environnantes, respectivement. Etant donné que la forme du coefficient de diffusion est similaire à celle de thcoefficient d&#39;absorption de e, il est donc prévu d&#39;observer la diffusion saturable en une seule nanoparticule plasmonique 20. Récemment, la diffusion saturable non linéaire dans une particule plasmonique isolé a été démontrée pour la première fois 21. Il est remarquable que, à saturation de profondeur, l&#39;intensité de diffusion en fait légèrement diminué lorsque l&#39;intensité d&#39;excitation augmente. Encore plus remarquable, lorsque l&#39;intensité d&#39;excitation continué à augmenter après la diffusion est saturé, l&#39;intensité de diffusion a de nouveau augmenté, montrant l&#39;effet de la diffusion inverse saturable 20. En longueur d&#39;onde et les études de taille-dépendante ont montré une forte relation entre LSPR et non linéaire de diffusion 21. Les dépendances d&#39;intensité et de longueur d&#39;onde de la diffusion plasmonique sont très semblables à ceux de l&#39;absorption, ce qui suggère un mécanisme commun qui sous-tend ces comportements non linéaires. En termes d&#39;applications, il est bien knoWN que la non-linéarité contribue à améliorer la résolution de la microscopie optique. En 2007, saturé excitation (SAX) microscopie a été proposé, ce qui peut améliorer la résolution en extrayant le signal saturé via une modulation sinusoïdale temporelle du faisceau d&#39;excitation 22. Microscopie SAX est basée sur le concept selon lequel, pour un foyer de laser, l&#39;intensité est plus forte au centre qu&#39;à la périphérie. Si le signal (soit fluorescence ou diffusion) présente un comportement de saturation, la saturation doit commencer à partir du centre, tandis que la réponse linéaire reste à la périphérie. Par conséquent, si il existe un procédé pour extraire uniquement la partie saturée, on laisse seulement la partie centrale tout en rejetant la partie périphérique, améliorant ainsi efficacement la résolution spatiale. En principe, il n&#39;y a pas de limite inférieure de la résolution en microscopie SAX, aussi longtemps que la saturation est atteinte profonde et il n&#39;y a pas de dégâts de l&#39;échantillon en raison de l&#39;éclairage intense. Il a été démontré que la resolution de l&#39;imagerie par fluorescence peut être considérablement améliorée en utilisant la technique de SAX. Cependant, la fluorescence souffre de l&#39;effet de photoblanchiment. La combinaison de la découverte de la non-linéarité de diffusion et le concept de SAX, la microscopie de super-résolution basée sur la diffusion peut être réalisée 21. Par rapport aux microscopies classiques de super-résolution, sur la base de la technique de diffusion-fournit un procédé de contraste non blanchiment roman. Dans cet article, une description étape par étape est donnée de décrire les procédures nécessaires pour obtenir et extraire la non-linéarité de la diffusion plasmonique. Méthodes d&#39;identification des non-linéarités introduites par diffusion changeant l&#39;intensité incidente sont décrites. Plus de détails seront fournis à démêler comment ces non-linéarités affectent images de nanoparticules simples et comment résolution spatiale peuvent être améliorées en conséquence par la technique de SAX.

<table><tbody><tr><td>corps de microscope</td><td>Olympus, Japon</td><td>Objectif BX-51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus, Japon</td><td>UPlanSapo, 100X, NA 1.4</td><td></td></tr><tr><td>80-nm gold</td><td>colloid BBI Solutions, UK</td><td>EM. Laser supercontinuum GC80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fianium, Royaume-Uni</td><td>SC400-2-PP</td><td></td></tr><tr><td>miroirs diélectriques à large bande</td><td>Thorlabs,</td><td>États-Unis BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>émission de champ SEM</td><td>JEOL, Japon</td><td>JSM-6330F</td><td>spectromètre optionnel</td></tr><tr><td></td><td>Andor Technology, Royaume-Uni</td><td>Shamrock 163</td><td></td></tr><tr><td>dispositif à couplage de charge</td><td>Andor Technology, UK</td><td>iDus DV420A-OE</td><td></td></tr><tr><td>modulateurs acousto-optiques</td><td>IntraAction Corp., États-Unis</td><td>AOM-402AF1</td><td></td></tr><tr><td>amplificateur à verrouillage</td><td>Stanford Research Systems, États-Unis</td><td>SR-830</td><td></td></tr><tr><td>Verre diapositive revêtu de</td><td>MAS Verre Matsunami, Japon,</td> <td>S9215</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la diffusion non-linéarités d&#39;une nanoparticule plasmonique simple

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

Les plasmoniques, qui sont basées sur l’oscillation collective des électrons due à l’excitation de la lumière, impliquent des champs électriques locaux fortement améliorés et ont donc des applications potentielles en optique non linéaire, ce qui nécessite une intensité optique extraordinaire. L’une des non-linéarités les plus étudiées en plasmonique est l’absorption non linéaire, y compris les comportements de saturation et de saturation inverse. Bien que la diffusion et l’absorption dans les nanoparticules soient étroitement corrélées par la théorie de Mie, il n’y a pas eu de rapport de non-linéarités dans la diffusion plasmonique jusqu’à très récemment. 
L’année dernière, non seulement la saturation, mais aussi la saturation inverse de la diffusion dans une particule plasmonique isolée ont été démontrées pour la première fois. Les résultats ont montré que la diffusion saturable présente une dépendance claire à la longueur d’onde, qui semble être directement liée à la résonance plasmonique de surface localisée (LSPR). Combinés aux mesures dépendantes de l’intensité, les résultats suggèrent la possibilité d’un mécanisme commun sous-jacent aux comportements non linéaires de diffusion et d’absorption. Ces non-linéarités de diffusion à partir d’une seule nanosphère d’or (GNS) sont largement applicables, y compris en microscopie à super-résolution et en commutateurs optiques. 
Dans cet article, nous décrivons en détail comment mesurer la non-linéarité de la diffusion dans un seul PNB et comment utiliser la technique de super-résolution pour améliorer la résolution de l’imagerie optique basée sur la diffusion saturable. Cette découverte comprend la première microscopie à super-résolution basée sur la diffusion non linéaire, qui est une nouvelle méthode de contraste sans blanchiment qui peut atteindre une résolution aussi basse que l/8 et qui sera potentiellement utile en biomédecine et dans les études de matériaux.

La figure 6 montre le spectre mesuré partir d&#39;un GNS 80 nm. Une courbe calculé sur la théorie de Mie est donnée dans la même parcelle, montrant excellent accord. Le pic est de l&#39;ordre LSPR 580 nm. Dans l&#39;expérience suivante, la longueur d&#39;onde du laser était de 532 nm, qui a été choisi car il est situé à l&#39;intérieur de la bande plasmon pour améliorer diffusion optique avec effet plasmonique et de permettre la diffusion de saturation 21. <strong...

La diffusion saturable et saturable inverse a été découverte dans des particules plasmoniques isolées et adoptée comme nouvelle méthode de contraste non blanchissant en microscopie à super-résolution. Ici, les procédures expérimentales de détection et d’extraction de la diffusion non linéaire sont expliquées en détail, ainsi que la façon d’améliorer la résolution à l’aide de la microscopie à excitation saturée.

Mesure de la diffusion non-linéarités d&#39;une nanoparticule plasmonique Simple

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

L'objectif général de cette expérience est de démontrer l'amélioration de la résolution grâce à la diffusion non linéaire provenant de nanostructures plasmoniques. Dans le domaine de la microscopie optique, le contraste et la résolution sont les facteurs les plus importants. Notre technique s'étend au domaine de la super-résolution avec une nouvelle méthode de contraste fondée sur la diffusion.Le principal avantage de cette technique est que la diffusion provenant des nanoparticules est forte, fortement non linéaire et ne s'efface pas. La démonstration de la procédure sera assurée par Hsuan Lee, un étudiant de mon laboratoire.L'expérience sera réalisée sur un banc optique, où se trouve un microscope et deux sources laser. La première source laser est un laser à onde continue de 532 nanomètres utilisé pour l'imagerie.Le second est un laser à supercontinuum utilisé pour les mesures de spectroscopie. Il s'agit d'un schéma de l'installation de base pour l'imagerie et la spectroscopie. Les échantillons seront montés sur une platine de positionnement piézoélectrique dans le microscope confocal.La lumière du laser de 532 nanomètres traverse un filtre à densité neutre. Le faisceau est dirigé par un séparateur de faisceau vers des miroirs galvanométriques qui assurent un balayage en raster dans le plan focal de l'objectif du microscope confocal. La lumière diffusée en arrière est collectée par l'objectif et focalisée sur le détecteur.Commencez par aligner le trajet d'illumination en lumière blanche du microscope. Utilisez la source de lumière halogène en éclairage à fond clair. Pour vérifier l'alignement de l'iris interne, assurez-vous d'observer des bords nets de l'octogone à travers l'oculaire ou le CCD.Ensuite, utilisez une feuille de papier pour vérifier le trajet lumineux externe. Vérifiez que les faisceaux sont partiellement réfléchis par le séparateur de faisceau et se propagent vers le laser en déplaçant le papier le long du trajet lumineux. Préparez maintenant des cibles en papier pour faciliter l'alignement ultérieur.Les cibles doivent être sur du papier fin avec des anneaux concentriques. Placer ces cibles le long du trajet du faisceau de manière à ce qu'elles soient alignées avec le faisceau halogène. Ici, une cible est positionnée sur l'ouverture arrière de l'objectif.Ceci est un autre objectif positionné le long du trajet optique. Ensuite, allumez le laser de 532 nanomètres utilisé pour l'imagerie afin de l'aligner. Utilisez les cibles en papier pour faciliter la collimation de la lumière laser incidente, opposée au faisceau halogène.Procédez à un réglage plus fin du faisceau laser avant de retirer les cibles et de poursuivre. Après avoir aligné le laser, préparez un échantillon de nanosphères d'or pour l'expérience. Cet échantillon contient des nanosphères d'or de 80 nanomètres dans de l'huile.Le mélange est scellé entre deux lames de verre. Poursuivez en montant l'échantillon sur la platine du microscope et en ajoutant de l'huile à immersion. À ce stade, préparez le système de détection pour l'acquisition d'images.Recueillir la lumière diffusée à l’aide du tube photomultiplicateur situé à l’extrémité du trajet optique. En remontant le long du trajet du faisceau, placer un diaphragme de 20 micromètres de diamètre afin de bloquer la lumière diffusée hors du plan focal provenant du tube photomultiplicateur. Procéder à l’imagerie en activant les miroirs galvanométriques et le tube photomultiplicateur.Observer l'écran d'ordinateur pour voir le balayage arrière en signal des nanoparticules d'or. Maximiser le signal du balayage arrière en ajustant la position du diaphragme et la hauteur de la platine d'échantillon. Après avoir aligné le microscope confocal, caractériser la non-linéarité de diffusion de l'échantillon.Pour ce faire, utilisez d'abord un puissancemètre pour mesurer la puissance du laser après la lentille de l'objectif. La valeur lue doit être inférieure à 10 microwatts, ce qui correspond à une intensité d'excitation inférieure à 10 à la puissance quatre watts par centimètre carré. Ensuite, acquérez une image des nanoparticules d'or à l'aide du tube photomultiplicateur.Ouvrez l'image capturée dans un logiciel d'analyse d'image pour caractériser le profil d'intensité de diffusion. Sélectionnez une nanosphère d'or parmi celles présentes sur l'image et tracez une ligne à travers celle-ci. Ensuite, suivez les étapes requises dans le logiciel pour obtenir le profil de diffusion.Adapter le profil à une gaussienne, ce qui permet une vérification supplémentaire de l'alignement du système d'imagerie. Commencez ensuite à balayer systématiquement les intensités d'excitation. Tout d'abord, modifiez le filtre de densité neutre afin d'augmenter l'intensité d'excitation.Déterminez la nouvelle intensité d'excitation et enregistrez l'image de rétrodiffusion à ce nouveau niveau d'intensité. Utilisez l'image pour extraire un profil de diffusion d'une nanosphère comme précédemment. Tracez le profil de diffusion et identifiez sa valeur au centre de la sphère comme étant le signal de diffusion.Répétez ces étapes plusieurs fois afin d'élaborer un graphique du signal de diffusion en fonction de l'intensité d'excitation. Sur cette figure, les points bleus représentent les données. La ligne rouge correspond à un ajustement polynomial.Il existe une relation linéaire entre le signal de diffusion et les faibles valeurs de l'énergie d'excitation. La chute en dessous de cette relation linéaire indique qu'une saturation s'est produite. L'étape suivante consiste à effectuer une spectroscopie sur une seule nanosphère d'or.Ce schéma fournit un aperçu du dispositif. Utilisez une source laser supercontinuum ayant une plage de longueur d'onde de 450 à 1750 nanomètres. Utilisez également un séparateur de faisceau large bande 50/50 afin d'assurer une couverture spectrale sur tout le spectre visible.Placer un miroir orientable devant le tube photomultiplicateur afin de diriger la lumière vers le spectromètre, qui est équipé d'un dispositif à transfert de charge. Le laser à continuum supercontinuum doit être aligné en utilisant la même procédure que pour le laser de 532 nanomètres.À la sortie du laser à spectre large, prenez certaines précautions pour éliminer l'excès de puissance infrarouge du système. Placez des miroirs réfléchissant la lumière visible sur le trajet optique juste après la sortie du laser, avant d'envoyer le faisceau vers le microscope. En complément des miroirs, utilisez des absorbeurs de faisceau pour capter le rayonnement infrarouge susceptible d'endommager le système.Une fois le laser aligné, acquérez et imagez les nanosphères d'or. Examinez l'image et identifiez une nanosphère unique à étudier. Fixez la mise au point de la lumière large bande incidente sur la nanosphère choisie.Ensuite, assurez-vous que le spectromètre est bien placé dans le trajet optique. Dans cette position, le miroir basculant dirige la lumière incidente vers le tube photomultiplicateur. Réorientez le miroir afin de diriger la lumière incidente vers le spectromètre.Procédez à la collecte de données sur le spectre de diffusion de la nanoparticule d'or unique. Comme dans cet exemple, le spectre mesuré sera un mélange de diffusion provenant de la nanosphère et d'un fond dû aux réflexions. Après avoir enregistré le spectre, remettez le miroir basculant en position initiale.Dirigez la lumière vers le tube photomultiplicateur. Prenez une autre image pour confirmer que la nanoparticule d'or n'a pas changé de position. Ensuite, déplacez le point de focalisation de la lumière large bande vers un endroit où il n'y a aucune particule.Changer à nouveau le miroir pour diriger la lumière vers le spectromètre, puis procéder à une autre mesure de spectre. Le nouveau spectre correspond au fond. Il sera soustrait du spectre des nanosphères d'or.Voici le spectre de rétrodiffusion clair obtenu en soustrayant le spectre du fond du spectre contenant les nanosphères d'or. La microscopie en excitation saturée de l'échantillon nécessite un dispositif différent. Voici le schéma du microscope en excitation saturée.La source laser est un laser de 532 nanomètres. Utilisez un séparateur de faisceau 50/50 pour créer deux faisceaux à partir de la source laser. Faites passer chaque faisceau à travers un modulateur acousto-optique séparé.Les différentes fréquences de modulation génèrent une fréquence de battement qui servira de fréquence de modulation des signaux d'excitation saturés. Combinez les faisceaux diffractés du premier ordre provenant des modulateurs acousto-optiques à l’aide d’un autre séparateur de faisceau 50/50. Pour surveiller la modulation temporelle, utilisez une lame de verre afin de dériver une petite partie de la lumière laser vers un photodétecteur.Pour vérifier le système, connectez le photodétecteur à un oscilloscope. Assurez-vous qu'aucun échantillon n'est en place. Évaluez le signal du photodétecteur sur l'oscilloscope.Le signal doit être une sinusoïde à la fréquence de battement si la modulation et le recouvrement des faisceaux sont corrects. Pour cette expérience, la fréquence de battement attendue est de 10 kilohertz. S'efforcer d'obtenir une sinusoïde aussi parfaite que possible, avec une non-linéarité minimale.L'étape suivante consiste à intégrer un amplificateur d'enregistrement dans le système. Pour la microscopie par excitation saturée, l'amplificateur d'enregistrement reçoit un signal d'entrée provenant du photodétecteur et du tube photomultiplicateur. Débranchez la sortie du photodétecteur de l'oscilloscope et reliez-la à l'entrée de référence de l'amplificateur.Connectez la sortie du tube photomultiplicateur à l'amplificateur synchrone en tant que signal d'entrée. Envoyez la sortie de l'amplificateur vers une carte d'acquisition de données. À ce stade, fixez l'échantillon sur la platine du microscope.Utilisez le même échantillon avec des nanosphères d'or de 80 nanomètres dans de l'huile scellées entre deux plaques de verre. Revenez à l'amplificateur synchrone tout en effectuant les mesures. Réglez l'amplificateur pour exporter la magnitude absolue du signal de tension.Dans ce cas, en sélectionnant R dans le panneau d'affichage du canal 1. Modifier le réglage de la composante harmonique sur le canal de référence afin d'obtenir les amplitudes uniques d'excitation saturée. Ces images en couleurs sont générées à l'aide d'un logiciel personnalisé permettant de synchroniser et de combiner les signaux provenant de l'amplificateur à détection synchrone et des tensions d'entraînement des moteurs galvanométriques.L'image au microscope électronique à balayage est fournie à titre comparatif. Les images illustrent l'amélioration de la résolution grâce à différentes composantes harmoniques. Le spectre mesuré d'une nanosphère d'or de 80 nanomètres est représenté en rouge.La courbe continue calculée à l'aide de la théorie de Mie montre un excellent accord. La résonance de plasmon de surface localisée se situe à 580 nanomètres. Les images de diffusion, ci-dessus, et les profils en ligne, ci-dessous, présentent des caractéristiques différentes en fonction de l'intensité d'excitation.À faible intensité, la fonction d'étalement du point correspond à un profil gaussien standard. Des intensités plus élevées entraînent un aplatissement et un élargissement de la fonction, indiquant une saturation. À des valeurs plus élevées, l'intensité centrale n'est plus la valeur maximale, ce qui donne une fonction d'étalement du point en forme de beignet.Éventuellement, l'intensité centrale redevient le pic lors de la saturation inverse. Les points de données bleus sur ce tracé de l'intensité centrale à différentes intensités d'excitation révèlent à la fois le comportement de saturation et de saturation inverse. Les points de données sont ajustés à un polynôme du cinquième ordre, tracé en rouge.Ces données peuvent être utilisées pour extraire les composantes de fréquence harmonique. Les composantes harmoniques peuvent également être déterminées directement à l'aide de l'amplificateur synchrone. Ce graphique de gauche représente des données expérimentales.Le graphique de droite est le résultat du calcul utilisant un ajustement polynomial du 5e ordre. Les deux graphiques présentent des creux à des intensités spécifiques le long des courbes. Par exemple, trois creux dans l'harmonique secondaire.Également, dans chaque tracé, pour chaque ordre harmonique, la pente augmente après le premier minimum. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de vérifier la qualité de la modulation sinusoïdale, la linéarité du système de détection et la stabilité mécanique de l'échantillon.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment obtenir un renforcement de la résolution fondé sur la diffusion non linéaire provenant de nanostructures plasmoniques. Cette technique offre un échantillon prometteur aux chercheurs dans le domaine de la microscopie à super-résolution pour explorer de nouveaux contrastes dans d'autres interactions fondamentales entre la lumière et la matière.

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