Name: Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez le mécano-profilage cellulaire sur micropost arrays pour la recherche en mécanobiologie et cancer. Cette méthode open-source quantifie les forces d'adhésion cellulaire avec une formation minimale.

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Ce travail a été soutenu par le Comité Technologie et Innovation (CTI) Suisse subvention 14796-PFLS-LSCTI. Les réseaux MicroPost ont été généreusement fournis par MicroDuits GmbH.

1. la culture de cellules sur Micropost Arrays Remarque: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour assurer la stérilité. Les volumes sont indiquées ici pour des flacons de culture T25 cellulaire. La densité de la recette et ensemencement cellulaire milieu de culture cellulaire sont optimisés pour les lignées cellulaires de cancer de l&#39;os HuO9 et M132. <ol><li> Préparer une culture de cellules pour l&#39;ensemencement sur un réseau de micro-message. <ol><li> Inspecter la qualité d&#39;une culture de cellules en plaçant le flacon de culture sur un microscope optique standard. Veiller à ce que les cellules montrent une croissance et une morphologie en estimant la quantité de fond de flacon de culture est couvert. Une couverture de 70% -80% reflète un taux de croissance saine. Faites attention à la quantité de cellules flottantes, car ils représentent les cellules mortes et / ou une culture envahie. </li><li> Trypsiniser les cellules en éliminant milieu et on lave avec 4 ml 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) tampon. Ajouter 0,8 ml de trypsine 1x / acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incubation à température ambiante jusqu&#39;à ce que la cellules déloger, ce qui prend environ 2-4 min. Vérifier le processus avec le microscope et parfois appuyez sur le flacon doucement pour soutenir le délogement. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire (le milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / F12 avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% de pénicilline / streptavidine (Pen / Strep)) pour arrêter la réaction et pour laver les cellules résiduelles qui siègent encore sur le fond du flacon. Par la suite pipette cette suspension monter et descendre plusieurs fois pour obtenir un mélange homogène. Assurez-vous de la pipette toutes les solutions à travers la zone de croissance d&#39;origine du flacon pour obtenir un délogement efficace. </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à l&#39;aide d&#39;une centrifugeuse de table à 0,5 g pendant 3 min. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu par aspiration et refoulement 5 fois. Veillez à éviter la formation de bulles en le faisant. </li><li> Déterminer la densité cellulaire en utilisant une chambre de comptage de cellules et une lumière microscope. Vérifier la suspension de cellules dans la chambre de comptage de cellules pour des agrégats de cellules et s&#39;assurer d&#39;avoir seulement des cellules individuelles pour l&#39;expérience suivante. Pipette à nouveau de haut en bas plusieurs fois si les cellules ont tendance à former des agrégats de les séparer. </li><li> Diluer la suspension cellulaire avec du milieu suffisante pour obtenir une solution de cellules de 25.000 cellules / ml. Bien mélanger en inversant le tube fermé à plusieurs reprises. </li></ol></li><li> Préparer un réseau de micro-message pour l&#39;ensemencement des cellules. Remarque critique: Ne pas pipeter sur le réseau de micro-message directement car cela pourrait potentiellement nuire les microposts, en particulier lorsque des bulles indésirables sont introduits. En outre, assurez-vous que le réseau de micro-message ne sèche jamais comme se produisant forces capillaires conduisent à l&#39;effondrement des micro-messages. <ol><li> Placer le substrat de verre avec la matrice de micro-message face dans un puits d&#39;une plaque à 12 puits en utilisant une paire de pinces et de le mouiller par addition de 1 ml d&#39;éthanol (99%). Incuber à température ambiante pendant 20-30 secondes. </li><li> Diluer l&#39;éthanolpar étapes en ajoutant environ 1 ml de l&#39;eau déminéralisée stérile (eau DI) sur le côté du puits et aspirer environ 1 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert ou d&#39;un dispositif d&#39;aspiration. Répétez cette étape au moins 3 fois. </li><li> Remplacer l&#39;eau déminéralisée avec du PBS-tampon de la même façon par addition d&#39;aspiration et environ 1 ml. Répétez cette étape 3 fois. </li><li> Remplacer le tampon PBS avec du milieu par addition d&#39;aspiration et environ 1 ml de milieu. Répétez cette étape 3 fois. </li></ol></li><li> Solution de la pipette de 1 ml de cellules (25.000 cellules) sur le dessus de chaque réseau de micro-message préparé. Fermer plaque multi-puits et le transférer dans un incubateur (5% de CO 2, 37 ° C). Laissez les cellules adhèrent et se développent au-dessus de microposts pour 6 -7 h. </li><li> Inspectez le processus d&#39;adhésion à l&#39;occasion en utilisant une lumière d&#39;un microscope. Vérifiez que la plupart des cellules apparaissent propagés sur plusieurs microposts. </li></ol> 2. Fixation et coloration des cellules Remarque: Toutes les étapes etvolumes donnés ici sont pour un seul puits d&#39;une plaque de 12 puits. Il est recommandé de traiter pas plus de quatre des douze puits à la fois pour éviter un assèchement des puits après l&#39;aspiration de tout liquide, qui se traduira par un effondrement des micro-messages. <ol><li> Aspirer le milieu du puits et laver les cellules 2 fois avec 1 ml de PBS-tampon. Assurez-vous d&#39;appliquer une force douce tout en lavant avec du PBS pour éliminer les débris cellulaires qui se sont accumulés sur le réseau de micro-message pendant l&#39;incubation et de détacher les cellules mortes. </li><li> Fixer les cellules avec une solution de formaldehyde tamponnée 0,5 ml de 3,7% pendant 5 min. </li><li> Remplacer la solution de formaldéhyde en lavant les micro-message matrice 2x avec 1 ml d&#39;eau désionisée stérile. </li><li> Colorer les cellules avec 0,05% (colorant bleu brillant de Coomassie à 50% d&#39;eau, 40% d&#39;éthanol et d&#39;acide acétique à 10%) pendant environ 90 sec. Laver la solution de coloration excès hors 2x avec 1 ml d&#39;eau DI stérile. Ajouter 1 ml d&#39;eau DI à Micropost tableau. </li><li> Vérifier le résultat de la coloration à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Répétez til l&#39;étape de coloration, si le corps cellulaire est trop faible pour être visualisées. </li><li> Tableaux de Micropost de magasin avec les cellules colorées sur le dessus dans un réfrigérateur à 4 ° C. Assurez-vous de les garder sous l&#39;eau en tout temps. </li></ol> 3. imagerie cellulaire Nota: L&#39;étape 4 applique uniquement aux microscopes sans corrigé à l&#39;infini optique. <ol><li> Ajouter 2 ml de l&#39;eau déminéralisée à une boîte de Pétri avec un fond de verre mince pour l&#39;imagerie haute résolution. </li><li> Transfert tableau micropost utilisant une paire de pince à épiler dans le plat d&#39;imagerie avec les micro-messages vers le haut. </li><li> Placez l&#39;imagerie boîte de Petri sur une scène mobile d&#39;un microscope optique. </li><li> Tournez la bague de compensation de la lentille utilisée pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à ce que le chiffre de l&#39;échelle représente l&#39;épaisseur totale de tous les matériaux le long du trajet optique afin de compenser la non-concordance des indices de réfraction du substrat de verre, l&#39;élastomère de silicone et le liquide sur le dessus. Cela devrait conduire à un aspect brillant des micropostsnoyaux. </li><li> Fermer le diaphragme sur le côté d&#39;éclairage jusqu&#39;à 50% et retirez les anneaux de contraste de phase du trajet optique permettant un mode champ lumineux ordinaire. </li><li> Aligner le réseau de micro-message que les microposts forment une ligne horizontale à travers le champ d&#39;observation. Définir un point de départ (par exemple, en haut à gauche) et déplacer le plat Petri par étapes à travers la scène balayage de la matrice de micro-message tout en prenant de nombreuses images. </li><li> Prenez toutes les images avec le réglage de la résolution la plus élevée pour l&#39;appareil photo en utilisant un objectif 20X ou 40X. But d&#39;avoir une seule cellule dans le centre de l&#39;image. </li><li> Balayer le long de l&#39;axe z à travers le substrat jusqu&#39;à ce que les conseils de Micropost sont en discussion. Utilisez la molette de réglage de mise au point fine du microscope et tournez vers concentrant sur le fond de micropost pendant environ 2-3 um. </li><li> Établir une procédure d&#39;imagerie standard en prenant série d&#39;images d&#39;essai d&#39;une section de tableau balayant les imagerie paramètres un à la fois (par exemple, le temps d&#39;exposition,réglage de l&#39;iris, les paramètres de la lampe, etc.). Analyser les images avec MechProfiler et de déterminer un ensemble de paramètres appropriés pour une analyse rapide et fiable. </li></ol> 4. Analyse d&#39;image avec l&#39;Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Remarque: Toutes les fonctions du logiciel peuvent être activés avec un dispositif de pointage en utilisant le bouton gauche de la souris. Toutefois, un opérateur formé va utiliser les touches de raccourci documentés conçus pour être sur la moitié gauche du clavier pour permettre un traitement d&#39;image à deux mains efficace. <ol><li> Commencez analyse d&#39;image MechProfiler logiciel et ouvrir une série d&#39;images qui doivent être analysés en cliquant sur «Ouvrir». </li><li> Insérez tous les paramètres dans la section &quot;Paramètres&quot; donnée par le développeur du logiciel. Déterminer les paramètres qui doivent être configurés sur mesure (par exemple, le seuil de contour et la distance minimale) selon les modes opératoires décrits en détail dans le manuel du logiciel. </li><li> Analyser l&#39;images un par un en les recadrage pour la zone d&#39;intérêt en utilisant &quot;cultures&quot; (cliquez et glissez avec le bouton de la souris enfoncé). Double-cliquez à l&#39;intérieur du rectangle dessiné pour terminer cette action. </li><li> Marquage chaque contour de la cellule visible un par un en cliquant sur &quot;Dessiner les contours de cellules&quot; et utilisez le curseur en forme de croix pour le dessin y compris tous les microposts la cellule est attaché. </li><li> Jeter toutes microposts indésirables en cliquant sur &quot;Supprimer les messages&quot; et utilisez le curseur en forme de croix pour le dessin. Joindre les micro-messages qui appartiennent à une cellule à l&#39;extérieur de la section d&#39;image qui sont déviées ou pour toute autre raison, mais pas par la cellule d&#39;intérêt. </li><li> Démarrez le sous-programme de logiciel &quot;Trouver Centroïdes&quot; par clic de souris. Ajustez le réglage juste à côté du bouton &quot;Trouver Centroïdes&quot; jusqu&#39;à ce que tous les micro-messages sont enregistrés, ce qui est visible par une croix rouge dans leur centre filtre. Si le réglage du filtre est trop faible microposts seront ignorés, si elle est trop élevée multiple positions seront marqués pour un seul micropost. Gardez réglage constant au cours d&#39;une séance d&#39;analyse du filtre. </li><li> Utilisez la fonction manuelle d&#39;édition &quot;Edit Manuel» pour centroïdes avec multiples ou manqués positions de Micropost. Utilisez les cheveux de croix de la souris pour sélectionner le micropost en question en cliquant et en faisant glisser partout. Double-cliquez dans le rectangle et placez le marqueur rouge manquant dans la section image agrandie, qui se ferme automatiquement. Jeter un tel micropost si elle est à l&#39;extérieur du contour des cellules dessinée (voir l&#39;étape 4.5) avant de continuer. </li><li> Trouver la grille de micropost idéal en activant la fonction &quot;Générer Grille&quot; avec un clic de souris. Vérifiez que la position correspond à la vraie tête de micropost, indiqué par un anneau bleu, l&#39;intérieur du contour de la cellule dessinée. </li><li> Corrigez tout fabricant de grille déplacée à l&#39;intérieur de la zone de la cellule si nécessaire en utilisant la fonction correspondante &quot;Manuel Edition&quot; avec un clic de souris. Utilisez la croix pour sélectionner le micropost dans question en cliquant et en faisant glisser partout. Double-cliquez dans le rectangle apparaissant et placez le marqueur bleu manquant dans la section image agrandie, qui se ferme automatiquement. </li><li> Utilisez le bouton &quot;calculer&quot; Déviations par clic de souris pour obtenir un histogramme des valeurs de déviation calculé sur la différence entre la position d&#39;un micro-message à l&#39;intérieur de la section de l&#39;image et la grille idéal engendré. </li><li> Enregistrer l&#39;analyse complète, y compris les tableaux de valeurs par un clic de souris sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Poursuivre l&#39;analyse d&#39;image soit en cliquant sur &quot;Reset View&quot; et d&#39;analyser une autre section de l&#39;image ou de la souris, cliquez sur &quot;Image suivante&quot;, qui peut facilement être fait en utilisant la touche de curseur droite du clavier. </li></ol> 5. Analyse des données - Mechanoprofiling <ol><li> Ouvrez le fichier &quot;results.xls&quot; avec un tableur de bureau à partir du dossier avec les images analysées. Il contient les données avec all valeurs calculées, y compris toutes les déviations de Micropost et mesures dérivés standards tels que le travail (par exemple, l&#39;énergie de déformation du substrat) par la cellule analysé. </li></ol>

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L’auteur principal (NG) est cofondateur de MicroDuits GmbH, le fournisseur commercial des réseaux de micropoteaux utilisés dans cette étude. Aucun autre auteur n’a de conflit d’intérêts potentiel avec ce travail.

Ce travail vise à faire progresser le domaine de la force de traction microscopie en abaissant considérablement les obstacles techniques et pratiques à l&#39;entrée. Ces obstacles proviennent de deux côtés. Tout d&#39;abord sont les nombreux défis techniques non négligeables qui doivent être surmontés pour la fabrication reproductible et mettre en service un réseau de micropost expérimentalement. Deuxièmement, la nécessité est de même non négligeable pour une analyse semi-automatique fiable des forces de cellules unique...

Tests cellulaires mécano-sensibles permettent d&#39;enquêter sur les cellules adhérentes, avec une large gamme d&#39;applications qui reflètent le rôle central que peuvent jouer la mécanique en biologie cellulaire. Ces applications se concentrent souvent sur les mécanismes sous-jacents qui animent les processus intracellulaires ou le comportement de cellules entières. D&#39;une part, les facteurs externes environnementaux tels que la composition de la matrice extra-cellulaire ou la rigidité de la matrice peuvent considérablement influer sur la réponse mécanique et biologique d&#39;une cellule. 1 La même chose peut être observée après utilisation de plusieurs classes de composés pharmaceutiques actifs, dont les effets sont caractérisé souvent en utilisant des modèles de culture de cellules. 2 Dans les autres propriétés génotypiques à main, tels que ceux causés par des mutations génétiques spontanées ou induites expérimentalement, peut induire des changements marqués dans le phénotype des cellules qui sont associées à des altérations de la structure et la fonction du cytosquelette. 3 Ces exemples sont quelques-uns des nombreux possiblesujets pour lesquels phénotypage mécanique des cellules est pertinente, et tous ceux-ci ont été utilement étudiée avec des tableaux de Micropost. Au moment d&#39;écrire ces lignes, environ 200 articles ont été publiés décrivant l&#39;interaction cellule-micropost. Ces œuvres de discuter des aspects théoriques de Micropost principes de déviation ainsi que des instructions pratiques sur leur fabrication. Le premier article décrivant l&#39;interaction des cellules et des tableaux de Micropost flexibles a été publié par Tan et ses collègues en 2003. 4 Contrairement à la microscopie à force de traction classique (TFM) où substrats souples continues sont utilisées pour estimer la contractilité cellulaire nanonewton échelle, Tan et al. décrit une méthode utilisant des faisceaux multiples verticales rapprochées en élastomère silicone. Les principaux avantages de cette technique se dégagent de deux caractéristiques principales. D&#39;abord afin de modifier la rigidité du substrat cellulaire apparente il suffit de modifier les dimensions de Micropost tout en gardantla composition du substrat par ailleurs constante et en évitant ainsi les différences de topologie de surface et la chimie. Deuxième microposts agissent comme des ressorts individuels qui peuvent être analysés discrètement avec force et résolution spatiale de l&#39;ordre des adhésions focales individuels et peut réduire les défis analytiques qui sont inhérents à l&#39;analyse analogue par la norme TFM. Aujourd&#39;hui, la gamme d&#39;applications pour les réseaux de Micropost dépasse grandement simplement la cartographie des forces pendant quelques cellules individuelles. Par exemple, Akiyama rapporte l&#39;utilisation d&#39;un tissu de vaisseau dorsal isolé à partir d&#39;une chenille de papillon comme un actionneur destiné à un réseau de micro-message, afin de développer un robot autonome micro-propulsion musculaire insecte. 5 Cependant, la plupart des applications publiées de microposts ont mis l&#39;accent sur les études de conditions médicales telles que l&#39;infection ou un cancer. Par exemple, les tableaux de Micropost ont été utilisés pour étudier la production d&#39;groupé pili de type IV de Neisseria gonorrh de forceoea colonies qui est associé à l&#39;amélioration de cascades de signaux infection. 6 D&#39;autres ont utilisé microposts pour étudier les cellules de cancer du sein traitées avec des composés pharmaceutiques ciblant le cytosquelette. 7 Déviation d&#39;un micro-message est souvent décrit en utilisant la théorie de faisceau classique pour une console avec une charge d&#39;extrémité en supposant que la cellule attache seulement à la pointe de la micropost. Ici, la force F appliquée qui provoque une déviation δ dépend de &quot;rigidité de flexion&quot; S k et le micro-message est calculée par: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) avec E, I et L étant le module de Young, le moment d&#39;inertie de la zone et de la poutre longueur respectivement. Cependant, les résultats de cette équation ne donnent qu&#39;une approximation générale des forces à l&#39;œuvre depuis le cisaillement de la poutre et de flexion ainsi que la déformation du substrat ne sont pas prises en courant alternatifcompter. Considérant que microposts sont généralement fabriqués à partir de matériaux souples comme le polydiméthylsiloxane (PDMS) à base de caoutchouc de silicone de ces facteurs doivent être inclus. . Schoen et al a montré qu&#39;il existe un tel facteur de correction en se basant sur ​​le rapport d&#39;aspect du micro-message (L / D) et du polymère correspondant coefficient de Poisson v 8 Il est donné par.: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Avec T Tilt (v) étant un coefficient de basculement qui comprend un raccord paramètre = 1.3 que l&#39;on peut trouver dans le même article: <img alt="Équation 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Cela signifie que la rigidité d&#39;un micropost corrigée k corr est le produit de la rigidité à la flexion pur k = k virage et le facteur de correction corrdonné par: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Par conséquent, les calculs de la force de cellules devraient être effectuées en utilisant la variation plus raffinée de l&#39;équation (1) en train de lire: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) L&#39;impact de la correction devient plus évident dès que les valeurs typiques pour les dimensions de Micropost sont utilisés. Par exemple, une longue micro-message 15 microns avec une section transversale circulaire et un diamètre de 5 um en caoutchouc de silicone à base de PDMS conduit à un facteur de correction de 0,77 et donc un calcul non corrigé serait surestimer les forces de cellules exercée par 23%. Cela devient encore plus sévère pour les micro-messages avec des rapports d&#39;aspect plus petits. Traditionnellement, micropost analyse d&#39;image a également été basée sur la théorie de flexion du faisceau idéalisée. En 2005, le groupe qui a lancé l&#39;utilisation de MICRtableaux de opost publié un logiciel d&#39;analyse d&#39;image adaptée à l&#39;analyse de micropost 9 Le logiciel requiert une licence de logiciel et l&#39;utilisateur doit prendre trois images pour chaque position. une chacune de plans supérieur et inférieur de la micro-message en mode de transmission et une autre en mode de fluorescence avec la cellule colorée. Après avoir comparé les positions supérieure et inférieure pour chaque Micropost le logiciel détermine un champ force de vecteur et calcule les paramètres connexes comme force par poste. Les autres logiciels existent et leurs principes de l&#39;analyse sont brièvement mentionnés dans les articles correspondants qui les décrivent, mais ces progiciels d&#39;analyse sont généralement pas accessibles au public. 10,11 Les tableaux de Micropost conçus pour les forces de cellules de cartographie peuvent être classés comme étant dans une mise en micropost orthogonale ou un être hexagonale, dont le dernier qui ont l&#39;avantage de lacunes équidistants entre tous microposts voisins. Microposts typiques have une section transversale circulaire et vont de 1,0 um à 10 um de diamètre et de 2 à 50 mm de longueur. 4 leurs dimensions Cependant, microposts avec section elliptique ou carrée ont également été signalés. 12,13 L&#39;utilisation de mélanges de silicones à base de PDMS comme matière de micro-message pour l&#39;ajout de nanoparticules permet dans le mélange. Par exemple en ajoutant cobalt nano-barres permet une activation magnétique de la micropost et donne ainsi un autre degré de liberté de modèles expérimentaux potentiels. 14 La plupart des groupes produisent leurs réseaux de Micropost sur ​​des substrats rigides plats comme le verre de couverture ou à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri. Cependant, Mann et ses collègues ont récemment rapporté une matrice de micro-message formé sur une membrane extensible. 15 Cela permet à l&#39;application de l&#39;étirement cellulaires forces de cellules adhérentes tout en étudiant cellules vivantes subcellulaire réponses dynamiques en termes de la contractilité cellulaire. L&#39;éta et le plus largement utiliséblies processus pour la fabrication de tableaux de Micropost est basé sur la lithographie douce comme décrit dans les protocoles perspicaces de Sniadecki et collègues. 16-18 Dans courtes processus de salle blanche standard sont utilisés pour générer les microstructures sur le dessus d&#39;une plaquette de silicium en utilisant résine photosensible SU8. Ceci est suivi par un processus de copie, dans lequel le caoutchouc silicone est moulée sur les structures les transférer dans les moules. Dans une deuxième étape ces moules sont utilisés pour reproduire la microstructure initiale en utilisant un caoutchouc de silicone sur le dessus d&#39;un substrat choisi. Cependant, malgré le nombre important et croissant de publications liées à leur application, en établissant un processus de fabrication pour microposts prend beaucoup de temps, même pour des experts micro-ingénierie; il existe de nombreuses étapes de traitement qui nécessitent une optimisation et l&#39;adaptation à l&#39;environnement de laboratoire micro-message spécifique et la mise en page pour obtenir un niveau de qualité acceptable. Tableaux de Micropost commerciales sont maintenant disponibles dans un prête-to-utilisation (&quot;off-the-shelf») format avec un qualité constante. Comme tels, ils sont une alternative à la longue et complexe processus de fabrication nécessaires à la production sur place. Dans cet article, un tableau de micropost disponible dans le commerce a été utilisé pour cartographier les forces cellulaires en utilisant une seule image à champ lumineux microscopie. Plus important encore cet article décrit et documente un logiciel open-source entièrement fonctionnelle nommé MechProfiler, qui est disponible en téléchargement en tant que matière supplémentaire à ce manuscrit. Une version maintenue activement du logiciel peut également être trouvé à http://www.orthobiomech.ethz.ch. La combinaison d&#39;un essai &quot;off-the-shelf» et un logiciel d&#39;analyse compatible open-source abaisse nettement l&#39;entrée obstacle pour atteindre expériences précises TFM. Chercheurs sans accès ni salles blanches ou des logiciels expertise en développement peuvent analyser les forces cellulaires succès. Il permet à un utilisateur de se concentrer sur les mechanossortie de dosage de ensitivity plutôt que la technologie elle-même, et qui rend la mesure de la force de traction disponible à une communauté plus large. En outre, cela est une étape importante pour ouvrir la voie vers le dépistage entièrement automatique de tableaux de Micropost. Le logiciel d&#39;analyse MechProfiler traite les images en format de fichier tiff, png, bmp et jpg. Les images peuvent être prises en utilisant la fluorescence, contraste de phase ou de la microscopie optique à champ lumineux. Le programme autonome fonctionne conjointement avec la libre MATLAB Compiler Runtime (disponible à l&#39;adresse: Figure 12) et algorithmes sous-jacents de permettre le traitement d&#39;image simplifiée, qui permet à l&#39;utilisateur de traiter des images avec des cellules uniques ou multiples dans environ 1 min. En outre, ces cellules peuvent être soit vivant ou «fixes». Le logiciel MechProfiler est capable d&#39;augmenter grandement l&#39;analyse de données débit en se fondant sur la reproductibilité de réseaux de Micropost commerciale de qualité, plus spécifiquement, la valeur par défaut &amp; #8220; non dévié &quot;position de chaque poste dans le tableau peut être présumé contre une grille idéale (les écarts de fabrication de la grille dans les tableaux utilisés pour cette étude étaient inférieures à 100 nm). En bref on ouvre une sélection de fichiers d&#39;image pour l&#39;analyse, les cultures de la région d&#39;intérêt, définit les postes couverts par des cellules ou qui doivent être mis au rebut, détermine les positions de départ, calcule les déviations / forces contre la grille idéale, et enfin enregistre toutes les données spécifiques des cellules avec une possibilité pour l&#39;exportation, y compris à une feuille de calcul de bureau standard.

<table><tbody><tr><td>Fioles de culture cellulaire T25</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x tampon PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Medium DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS Amérique du Sud</td> Life <td>Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Flacons à centrifuger 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Réseau de micropoteaux pré-enduit de collagène I/Fibronectine</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Dimensions du micropoteau : &Oslash ;=6.4&#160 ; et micro ; m, l = 18,2 et micro ; m; grille=13 & micro ; m, kcorr=2.87&#160 ; nN/&micro ; m</td></tr><tr><td>Éthanol abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formol, tamponnée neutre 10 %</td> <td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Bleu brillant G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Bleu Coomassie</td></tr><tr><td>Méthanol ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm de diamètre, ouverture 22&nbsp ; mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Microscope inversé</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Contrôleur d’appareil photo</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Appareil photo</td> <td>Nikon</td><td></td></tr></tbody></table>

mécano-profilage facile et précis sur micropost arrays

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Les substrats de culture cellulaire avec micro-tenons flexibles intégrés permettent à l’utilisateur d’étudier les interactions mécaniques entre les cellules et leur environnement immédiat. En particulier, les interactions cellule-substrat sont le principal intérêt. Aujourd’hui, les réseaux de micro-poteaux sont une méthode bien caractérisée et établie avec un large éventail d’applications qui ont été publiées au cours de la dernière décennie. Cependant, il semble y avoir une réserve parmi les biologistes pour adapter la technique en raison du processus long et difficile de fabrication des microposts ainsi que du manque de logiciels facilement accessibles pour analyser les images de cellules interagissant avec les microposts. 
La lecture de la force à partir des microposts est étonnamment facile. Un micro-poteau agit comme un ressort avec la cellule idéalement fixée à son extrémité. Selon la taille, une cellule applique une force à partir de son cytosquelette à travers un ou plusieurs points d’adhésion focaux au micropost, déviant ainsi le micropost. La quantité de déflexion est directement corrélée à la force appliquée en direction et en amplitude. Le nombre de micropostes couverts par une cellule et les motifs de déviation des tenons sont caractéristiques et permettent de déterminer des valeurs telles que la force par tenon et de nombreux paramètres biologiquement pertinents qui permettent le « mécano-profilage » des phénotypes cellulaires.
Une méthode pratique de mécano-profilage est décrite ici, combinant la première génération de microposts prêts à l’emploi et disponibles dans le commerce avec un progiciel développé en interne qui est maintenant accessible à tous les chercheurs. À titre de démonstration d’application typique, des images uniques de cellules cancéreuses osseuses ont été prises en microscopie à fond clair pour le mécano-profilage de modèles de lignées cellulaires de métastases. Cette combinaison de capteurs de force de traction commerciaux et de logiciels open source pour l’analyse permet pour la première fois une mise en œuvre rapide de la technique du réseau de micro-poteaux dans les travaux de laboratoire de routine effectués par des utilisateurs non experts. De plus, un processus d’analyse robuste et rationalisé permet à un utilisateur d’analyser un grand nombre d’images de micro-publications de manière très rapide.

Le principal avantage de la technique décrite réside dans sa simplicité et le potentiel pour une intégration rapide et efficace dans le travail de laboratoire de routine. La combinaison des réseaux de capteurs commerciaux de haute qualité jumelés avec des logiciels open-source fournit des informations sur la mécano-sensibilité qui autrement nécessite l&#39;accès à des installations de salles blanches et d&#39;une connaissance approfondie de l&#39;analyse de l&#39;image et le développement de logiciels. La figure...

sont décrits des protocoles pour quantifier les interactions mécaniques entre les cellules adhérentes et les substrats microstructurés. Ces interactions sont étroitement liées aux comportements cellulaires essentiels, notamment la migration, la prolifération, la différenciation et l’apoptose. Les protocoles présentent un logiciel d’analyse d’images open source appelé MechProfiler, qui permet de déterminer les forces impliquées pour chaque micro-post.

Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

L'objectif général de cette technique consiste à recueillir des propriétés mécanobiologiques pertinentes à partir de cellules isolées individuelles, en visualisant les forces issues de leurs interactions caractéristiques avec le substrat cellulaire à l’aide d’un microscope optique classique. La méthode présentée constitue une technologie de plateforme en mécanobiologie. Elle peut contribuer à l’étude de questions clés en recherche sur le cancer, telles que le rôle de la contraction cellulaire dans la métastase des cellules cancéreuses.Les principaux avantages de la technique sont qu'elle extrait de manière robuste des informations neurobiologiques avec peu de formation requise pour l'utilisateur. Elle est compatible avec la microscopie optique standard et est conçue pour un rendement élevé. Troisièmement, cette méthode permet de mieux comprendre les propriétés mécanobiologiques des cellules humaines de cancer osseux. Il peut également être appliqué à des types cellulaires automatiques tels que les cellules musculaires lisses ou les cardiomyocytes. Commencez par placer le substrat en verre de manière à ce que le réseau de micro-piliers soit orienté vers le haut, dans la cavité d'une plaque de 12 puits. Ajoutez indirectement un millilitre d'éthanol à 99 % dans la cavité afin que le substrat soit recouvert. Veillez à ce qu'aucune bulle ne se forme durant les manipulations liquides, et à ce que le réseau de micro-piliers soit toujours recouvert d'une fine couche de liquide.Incubez ensuite la matrice à température ambiante pendant 20 à 30 secondes avant d'ajouter un millilitre d'eau stérile déionisée sur le côté du puits. Une fois le mélange effectué avec l'éthanol, aspirez environ un millilitre de la solution d'éthanol du puits et ajoutez un millilitre supplémentaire d'eau déionisée. Répétez ce processus au moins trois fois pour humidifier l'échantillon.Ensuite, remplacez l'eau déionisée dans le puits par du PBS de la même manière, en ajoutant puis en aspirant environ un millilitre à la fois, pendant trois répétitions. Utilisez ensuite ce même processus pour remplacer le PBS par du milieu. Maintenant que la matrice est recouverte d'environ un millilitre de milieu, pipetez 25 000 cellules d'intérêt dans un millilitre de milieu dans le puits contenant la matrice de micro-piliers préparée.Ensuite, fermez la plaque multi-puits et transférez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Laissez les cellules adhérer et croître sur les micro-piliers pendant six à sept heures, en surveillant le processus d'adhésion. De temps en temps, à l’aide d’un microscope optique, aspirez le milieu du puits, puis lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS.Veillez à appliquer une force douce lors du lavage avec du PBS afin d'éliminer les débris cellulaires accumulés sur le réseau de micropiliers pendant l'incubation et de détacher les cellules mortes. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre d'une solution de formaldéhyde tamponnée à 3,7 % pendant cinq minutes pour fixer les cellules. Puis retirez la solution de formaldéhyde et lavez le réseau de micropiliers deux fois à l'aide d'un millilitre d'eau stérile désionisée.Pour chaque lavage, recouvrir les cellules fixées avec une solution de colorant bleu brillant de Kumasi à 0,05 % dans un mélange composé de 50 % d’eau, 40 % d’éthanol et 10 % d’acide acétique pendant environ 90 secondes, puis éliminer l’excès de solution de coloration par deux rinçages avec un millilitre d’eau désionisée stérile. Ensuite, ajouter un millilitre d’eau désionisée sur le réseau de micro-piliers et examiner le résultat de la coloration au microscope optique. Commencer par ajouter deux millilitres d’eau désionisée dans une boîte de Pétri à fond en verre mince à l’aide d’une pince, puis transférer le réseau de micro-piliers depuis la plaque à 12 puits vers la boîte d’imagerie, en veillant à ce que les micro-piliers soient orientés vers le haut.Placez ensuite la boîte de Petri d'imagerie sur la platine mobile d'un microscope optique. Si les optiques du microscope ne sont pas corrigées à l'infini, tournez l'anneau de compensation de l'objectif utilisé pour l'imagerie jusqu'à ce que le chiffre indiqué sur l'échelle représente l'épaisseur totale de tous les matériaux situés le long du trajet optique. Ensuite, retirez tous les anneaux de contraste en champ clair du trajet optique afin d'activer le mode ordinaire en champ clair, puis réduisez l'iris du côté de l'éclairage à 50 %. Alignez la boîte de Petri de manière à ce que les micro-piliers du réseau forment une ligne horizontale ou verticale traversant le champ d'observation.Définir un point de départ en haut à gauche et déplacer progressivement la boîte de Pétri sur la platine. Balayer le réseau de micro-piliers tout en prenant de nombreuses images haute résolution avec un objectif 20 x ou 40 x. Viser à obtenir une cellule unique au centre de chaque image à chaque nouvelle position.Effectuez un balayage le long des ZX depuis la base du micro-poste vers l'extrémité du micro-poste jusqu'à ce que l'extrémité soit en focus. Utilisez la molette de réglage fin du microscope. Abaissez ensuite le plan de mise au point de deux à trois micromètres vers la base du micro-poste.Commencez par charger le logiciel mec, profiler, puis importez un ensemble d'images à analyser en cliquant sur « ouvrir » et en sélectionnant les images. Ensuite, accédez à la section des paramètres et saisissez les paramètres conformément aux instructions du manuel du logiciel. Analysez ensuite les images une par une.Commencez par sélectionner le bouton de recadrage, puis cliquez et faites glisser pour former un contour rectangulaire autour de la zone d'intérêt. Une fois terminé, double-cliquez à l'intérieur du rectangle dessiné pour finaliser l'action. Ensuite, sélectionnez le tracé du contour cellulaire et utilisez le curseur en forme de croix pour dessiner un contour autour de tous les micro-piliers recouverts par la cellule visible sur l'image.Éliminer tous les micro-piliers indésirables en cliquant pour supprimer les piliers et en utilisant le curseur en forme de croix pour dessiner. Ensuite, entourer tous les micro-piliers appartenant à une cellule située en dehors de la section d'image ou déviés pour toute autre raison, mais pas par la cellule d'intérêt. Ensuite, cliquer sur Trouver les OID pour démarrer la sous-routine du logiciel.Réglez le filtre juste à côté du bouton « trouver les OIDs » jusqu'à ce que tous les micro-piliers soient détectés, ce qui se manifeste par une croix rouge en leur centre. S’il y a plusieurs positions de micro-piliers ou des positions manquées, utilisez la fonction d’édition manuelle en cliquant sur « édition manuelle » et utilisez le réticule de la souris pour sélectionner le micro-pilier concerné. Double-cliquez à l’intérieur du rectangle et placez un seul marqueur rouge dans la section agrandie de l’image, qui se ferme automatiquement.Trouvez la grille de micro-piliers idéale en activant la fonction de génération de grille au moyen d'un clic de souris. Assurez-vous que la position corresponde à celle du vrai sommet de micro-pilier, indiquée par un anneau bleu à l'intérieur du tracé du contour de la cellule. Ensuite, corrigez les marqueurs de grille mal positionnés à l'intérieur de la zone cellulaire, si nécessaire.À l’aide de la fonction d’édition manuelle correspondante en cliquant avec la souris, utilisez le réticule pour sélectionner la question du micro-poste en cliquant et en le faisant glisser à travers celui-ci. Double-cliquez à l’intérieur du rectangle apparaissant et placez le marqueur bleu corrigé dans la section agrandie de l’image, qui se ferme automatiquement. Cliquez ensuite sur « calculer les déflexions » pour obtenir un histogramme des valeurs de déflexion calculées, basé sur la différence entre la position d’un micro-poste dans la section de l’image et la grille idéale générée.Enfin, enregistrez l'analyse complète, y compris les tableaux de valeurs. Poursuivez l'analyse d'image soit en cliquant sur « réinitialiser la vue » pour analyser une autre section d'image, soit en cliquant sur « image suivante à afficher ». Voici un exemple de profilage MENO de deux lignées cellulaires de cancer osseux : les cellules Q oh neuf, qui possèdent un faible potentiel métastatique, et les cellules M 132 hautement métastatiques, qui ont été ensemencées à partir du même lot de production.L'analyse des valeurs de force montre que les cellules Q oh nine exercent généralement une force plus importante au niveau de leurs points d'attachement par rapport aux cellules hautement métastatiques. En ce qui concerne la surface cellulaire, on observe que la force moyenne par cellule est plus élevée pour les cellules huo nine par rapport aux cellules M 132. De plus, la force moyenne par micro-piliers augmente au fur et à mesure que les cellules s'étalent, jusqu'à ce que la force moyenne par pilier atteigne une valeur plus stable.Outre les différences morphologiques, les variances peuvent être quantifiées avec des résultats intéressants. Par exemple, contrairement aux cellules M 132 hautement métastatiques, qui ont tendance à occuper moins de micro-piliers, les cellules HU oh neuf présentent un profil plus hétérogène en termes de couverture des micro-piliers. En résumé, le profil Meno de la lignée cellulaire parentale HU oh neuf révèle qu'elles couvrent généralement une surface plus grande et exercent une force légèrement supérieure sur les micro-piliers.Alors que la lignée cellulaire métastatique M 132 et le type cellulaire agressif recouvrent caractéristiquement moins de micro-piliers et exercent une force moindre par micro-pilier. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de pipeter très soigneusement et jamais directement sur le réseau de micro-piliers. Évitez d'introduire des bulles, car elles entraînent l'effondrement des micro-piliers.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire des informations biologiques sur le mésone à partir de cellules isolées uniques en utilisant des micro-piliers en combinaison avec notre logiciel Mesh Profile. Bonne analyse de vos résultats.

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