Multifonctionnel, Micropipette à base Méthode de constitution et la stimulation de la société Bacterial mécanosensible Canaux ioniques en gouttelettes interface Bilayers

L’objectif global de cette procédure est de reconstituer fonctionnellement les canaux du mezcal en une interface de gouttelettes, un système bicouche, et d’examiner la réponse de ces canaux sensibles au mécano-sensible aux stimuli mécaniques harmoniques. Cette méthode permet d’étudier l’activité électrique mécano-électrique du mutant méscal V 23 T en réponse à une excitation mécanique harmonique après reconstitution en un système d’interface de gouttelettes par couche. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise les avantages techniques de la technique du patch clamp et de l’interface gouttelette par les méthodes de couche, avec la possibilité d’être miniaturisée ainsi que la capacité de contrôler la composition chimique de chaque côté de la membrane.

Pour formuler des liposomes, préparez 10 millilitres d’une solution lipidique de deux milligrammes par millilitre en ajoutant 10 millilitres de tampon de chlorure de potassium à 20 milligrammes de lipides synthétiques D-P-H-P-C achetés sous forme de poudre lyophilisée. Assurez-vous que les véhicules lipidiques et la solution tampon sont bien mélangés. Le mélange doit avoir l’air homogène et flou lorsque tout est dissous.

Congelez le mélange à moins 20 degrés Celsius et décongelez complètement le nouveau mélange de lipides, en laissant le mélange décongeler à température ambiante et non dans un environnement chauffé. Après un total de six cycles de congélation-décongélation, utilisez un extrudeur disponible dans le commerce pour extruder les lipides en forçant la suspension lipidique entière d’abord à travers un filtre à membrane en polycarbonate de 0,4 micron, puis six fois à travers un filtre à membrane de 0,1 micron. Ce processus produit des particules d’un diamètre proche de 100 nanomètres.

Pour fabriquer le réservoir d’huile, percez deux trous opposés à travers la paroi d’un cylindre acrylique de deux pouces de diamètre et de 1,5 centimètre de long. Les trous doivent avoir un millimètre de diamètre et un centimètre du bas. Percez ensuite deux trous de quatre millimètres concentriques aux trous d’un millimètre précédemment percés.

La profondeur des trous doit être d’un millimètre chacun. Veillez à ne pas les percer complètement. Ces trous sont faits pour s’adapter aux joints en caoutchouc.

Placez et collez deux joints en caoutchouc d’un millimètre de diamètre intérieur dans les trous les plus grands afin d’éviter les fuites d’huile. Ensuite, collez la machine sur un cylindre sur une feuille acrylique de 10 centimètres sur 10 centimètres d’épaisseur en utilisant n’importe quel époxy polyvalent le jour de l’expérience, coupez une longueur de sept centimètres de fils d’argent de 2 250 microns de diamètre, puis plongez leurs pointes dans de l’eau de Javel pendant deux heures. Pour former une couche de chlorure d’argent, une couleur grise indique qu’une couche de chlorure d’argent a été formée.

À l’aide d’un coupe-verre, fendez un capillaire en verre de silicate de 10 centimètres de long, d’un millimètre de diamètre extérieur et de 58 millimètres de diamètre intérieur, en deux capillaires de cinq centimètres. À l’aide d’une seringue d’un millilitre avec une aiguille à pointe émoussée de calibre 18, remplissez les capillaires avec l’hydrogel P-E-G-D-M-A pour empêcher l’hydrogel hydraté de gonfler du capillaire. Gardez un dégagement de trois millimètres aux extrémités et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les capillaires.

Insérez les électrodes d’argent et de chlorure d’argent dans les capillaires remplis d’hydrogel. Durcissez l’hydrogel P-E-G-D-M-A par photopolymérisation des radicaux libres lors d’une exposition à la lumière ultraviolette pendant deux minutes à un watt à l’aide d’un spot ultraviolet, l’expérience est mise en place sous une cage de Faraday mise à la terre sur une connexion à la terre sur l’amplificateur de patch. Fixez l’une des micro-pipettes à un porte-micro-électrode droit doté d’un connecteur mâle.

Connectez ensuite le support de micro-électrode à l’étage de tête de l’amplificateur de patch. Pour connecter l’étage de tête au sol, soudez un fil de cuivre isolé de calibre 18 à un connecteur approprié pour l’étage de tête, montez l’étage de tête sur un micromanipulateur manuel à trois axes en fixant d’abord la plaque de montage de l’étage de tête au micromanipulateur, puis en connectant l’étage de tête à la plaque de montage. À l’aide des vis appropriées, fixez la deuxième micropipette à l’actionneur linéaire à l’aide d’un connecteur fabriqué en laboratoire, puis montez les deux sur un deuxième manipulateur micrométrique.

Les micropipettes doivent être opposées, alignées et horizontales. Ensuite, dans un flacon en verre, mélangez 0,1 millilitre de liposomes D-P-H-P-C avec 0,01 millilitre de la solution de liposomes de protéa méscal V 23 T. À l’aide d’une aiguille de microremplissage de calibre 34, remplissez les pointes des deux micropipettes avec une solution de protéosome.

Placez le réservoir sur le dessus d’un microscope vertical et faites passer les micro-pipettes à travers les trous opposés d’un millimètre. Remplissez ensuite le réservoir jusqu’à la surface avec de l’hexa décane pour former les gouttelettes sphériques à l’extrémité des micropipettes. À l’aide d’une troisième micropipette en verre de silicate de 10 microns de diamètre montée sur un manipulateur de troisième microm, on peut distribuer une solution diluée de liposomes de protéa de mescal V 23 T aux extrémités des micropipettes et former les gouttelettes.

Contrôlez la taille des gouttelettes en diminuant ou en augmentant le volume à volonté, et laissez-les reposer pendant 10 minutes pour que les monocouches se forment complètement. Mettez ensuite les gouttelettes en contact par couche. La formation se produira en une à deux minutes.

Après avoir configuré le logiciel et l’équipement comme décrit dans le protocole texte, utilisez un câble BNC pour connecter la sortie d’un générateur de formes d’onde au commutateur avant d’entrée de commande externe. Envoyez une forme d’onde triangulaire de 10 hertz, 500 millivolts de crête à la tête de scène. À l’aide du manipulateur microm.

Déplacez les micropipettes en verre horizontalement pour mettre les gouttelettes en contact jusqu’à ce qu’elles se touchent légèrement et attendez qu’un amincissement bicouche se produise. La progression du processus de formation des bicouches peut être observée visuellement au microscope et peut être surveillée par mesure de courant. Ajustez la taille de la bicouche à environ 250 microns de diamètre en contrôlant la position de la gouttelette montée sur l’actionneur à l’aide du manipulateur, la taille de la bicouche peut être estimée visuellement à travers le microscope.

Une fois que la bicouche s’est formée et est stable, stimulez les gouttelettes en envoyant un signal sinusoïdal à l’aide d’un générateur de fonctions pour stimuler l’incorporation de la protéine mescale dans la bicouche. Envoyez une forme d’onde sinusoïdale avec une amplitude de crête à crête de 175 microns, une fréquence de 0,2 hertz et un cycle de service de 50 % au contrôleur de serveur électrique Pieto. L’enregistrement atypique du courant en temps réel est présenté ici.

La capacité mesurée de la bicouche augmente soudainement, indiquant un amincissement et une formation de la bicouche avant qu’elle n’atteigne un état stable. La bicouche pourrait être contrôlée en changeant la position des gouttelettes lorsque le DIB est stimulé mécaniquement tout en maintenant un potentiel CC constant à travers la membrane. Le mutant V 23 T du mezcal génère des activités fiables, y compris principalement des états sous-conducteurs et parfois des événements d’ouverture complète.

Le gating se produit principalement à la compression maximale, ce qui indique qu’il est lié à une augmentation de la tension bicouche, comme le montre le graphique polaire. Ici, la capacité de cette technique à être utilisée pour tester d’autres types de biomolécules est mise en évidence ici. L’étain, qui est un canal ionique dépendant de la tension, augmente la perméabilité de la membrane lors de l’application d’un maître de potentiel transmembranaire CC.

Cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas casser accidentellement les capillaires en verre ou autre. Vous devez redémarrer la configuration et vous assurer que tous les fils sont connectés après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des canaux activés par étirement pour explorer de nouvelles méthodes par lesquelles des forces externes peuvent être transmises à la porte des canaux sensibles au mécanisme intégré DIB. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de former une interface de gouttelettes par couches, d’incorporer des canaux sensibles au mécano dans les membranes artificielles et de stimuler mécaniquement ces canaux.