Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l'aide du

L'objectif général de cette procédure est de caractériser quantitativement la réponse immunitaire d'Arabidopsis diliana au moyen d'un dosage d'infiltration à la seringue optimisé. Cela est réalisé en premier lieu par l'utilisation de l'infiltration à la seringue pour introduire manuellement des bactéries dans la feuille par les ouvertures naturelles appelées sada. La deuxième étape consiste à prélever des disques de tissu foliaire infecté après l'apparition des symptômes de la maladie.

Ensuite, les bactéries sont extraites des disques foliaires par homogénéisation à haut débit. La dernière étape consiste en des dilutions sériées et en leur dépôt sur des plaques de dénombrement bactérien afin de comptabiliser les colonies. En définitive, la croissance bactérienne au sein de chaque disque foliaire peut être corrélée à l'intensité relative de la réponse immunitaire de la plante.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunité végétale, comme l'identification des gènes contribuant aux réponses de défense contre les stress biotiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans sa capacité à quantifier précisément la croissance du pathogène dans le tissu végétal infecté, tout en aidant à éviter les erreurs expérimentales dues à l'échantillonnage de feuilles présentant des stades de développement variés. Cette méthode permet d'obtenir des informations sur la réponse immunitaire de la plante face à une infection par un pathogène bactérien virulent, et elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les réponses immunitaires induites par l'acide salicylique ou par des motifs moléculaires associés aux microbes.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés à introduire les bactéries dans la feuille sans endommager le tissu. La procédure suivante sera démontrée par le chercheur postdoctoral Hindu et les étudiants diplômés Shalu et Yali. Sous peu, depuis mon laboratoire, le test d'augmentation de la sensibilité aux maladies sera démontré dans cette vidéo.

Avant l'expérience, préparez des boîtes de milieu King's B ou milieu KB ; préparez un litre de milieu solide KB comme décrit dans le texte du protocole et laissez-le refroidir sur un agitateur magnétique. Lorsque le milieu est refroidi au toucher, ajoutez du glycérol à 80 %, un sulfate de magnésium à une molaire et de la streptomycine au milieu, puis versez le milieu sur deux tailles différentes de boîtes de milieu KB. La boîte de Pétri plus petite sert de boîte de culture bactérienne primaire, tandis que la grande boîte de Pétri sert de boîte de dénombrement bactérien.

Conserver les plaques à quatre degrés Celsius pendant deux jours avant la stérilisation pour le test. PSM ES 43 26. Prélever des bactéries à partir d'un stock glycérolé à moins 80 degrés Celsius sur une plaque de culture bactérienne KB strep et incuber à 28 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures le jour suivant.

Initier la culture liquide dans un tube à essai stérile avec quatre millilitres de milieu liquide KB contenant 50 microgrammes par millilitre de streptomycine. Agiter à 250 tr/min à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Les plantes d'Arabidopsis destinées à l'expérience sont cultivées dans des conditions détaillées dans le texte du protocole le même jour où la culture bactérienne liquide est initiée.

Marquez les pétales des feuilles numéro cinq et six avec un marqueur émoussé et imperméable pour faciliter l'identification du tissu infecté lors de l'échantillonnage. Pour favoriser l'ouverture des STA et faciliter l'entrée de la solution pathogène dans l'eau foliaire, arrosez bien les plantes en imbibant le plateau par le bas pendant 20 minutes.

Au bout de 20 minutes, éliminer l'excès d'eau. L'infection des plantes d'arabidopsis est réalisée le jour suivant le début de la culture liquide.

Transférez la culture bactérienne dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et centrifugez à 9 600 g pendant deux minutes. À température ambiante, jetez le surnageant et resuspendez le culot bactérien avec un millilitre de chlorure de magnésium stérile à 10 millimolaire. Diluez la suspension bactérienne avec neuf millilitres de chlorure de magnésium à 10 millimolaire dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Après avoir mesuré la densité optique des bactéries, diluez-les avec du chlorure de magnésium à 10 millimolaire jusqu’à une densité optique finale à 600 nm de 0,0002.

Pour le test d'infection EDS. Une seringue de un millilitre à embout émoussé sans aiguille, couramment appelée seringue à insuline, est utilisée pour l'infiltration. Remplir la seringue avec 0,5 à 0,6 millilitre de la solution bactérienne diluée afin d'obtenir un meilleur contrôle durant le processus d'infiltration ; ne pas remplir la seringue à sa capacité maximale.

Exposer la surface inférieure de la feuille sur le dessus du doigt index, puis, à l'aide du pouce, ajuster délicatement la position de la feuille. Placer la seringue verticalement contre la surface de la feuille afin d'assurer une répartition uniforme de la pression et réduire ainsi les dommages foliaires. Éviter autant que possible la zone de la nervure médiane lors de l'infiltration.

Poussez lentement le piston pour infiltrer la solution bactérienne. L'entrée du liquide dans le mésophylle foliaire sera visualisée par l'assombrissement de la couleur de la feuille ; assurez-vous d'infiltrer toute la surface de la feuille, même si plusieurs tentatives sont nécessaires. Une fois l'infiltration terminée, tamponnez délicatement la feuille avec du papier absorbant afin d'éliminer l'excès de solution pathogène.

Inspecter visuellement le tissu foliaire infecté pour détecter les dommages. Laisser les plantes infiltrées sécher pendant une à deux heures, puis replacer les plantes dans leurs conditions de croissance initiales. Pulvériser de l'eau sur un dôme transparent et couvrir les plantes infectées pendant deux heures.

Ensuite, fendez le dôme pour créer une ouverture de deux à trois pouces et laissez-le en place pendant le reste de l'expérience d'infection, qui dure généralement trois jours. Un jour avant de quantifier la croissance du pathogène, prédesséchez les plaques de milieu KB de 150 millimètres par 15 millimètres.

Séchez les plaques en les maintenant à température ambiante pendant environ 24 heures. Traitez le tissu infecté après l'apparition de la sclérose, indiquée par le jaunissement du tissu infecté chez les génotypes sensibles, mais avant le développement de lésions nécrotiques. Pour chaque génotype, préparez six tubes de broyage.

Placer une bille de broyage en acier inoxydable et ajouter 500 microlitres de chlorure de magnésium stérile à 10 millimolaire dans chaque tube. Ensuite, détacher la feuille infectée de la plante et prélever un disque foliaire à l’aide d’un perforateur à un trou et de pinces de manière aléatoire, puis placer deux disques foliaires provenant de deux plantes différentes dans chaque tube de broyage. Fermer hermétiquement les tubes et homogénéiser les tissus à l’aide d’un homogénéisateur à haut débit à vitesse maximale pendant 10 minutes.

Répétez ce processus si nécessaire jusqu'à ce que le tissu soit bien homogénéisé et que les solutions deviennent vertes en raison du relargage de la chlorophylle provenant des feuilles infectées pendant l'attente. Pour l'homogénéisation, remplissez chaque puits des six premières rangées d'une plaque de culture à 96 puits avec 180 microlitres de chlorure de magnésium à 10 millimolaire. Transférez 20 microlitres de la suspension de tissu broyé dans chaque puits de la première rangée de la plaque à 96 puits et mélangez en aspirant et en expulsant le liquide plusieurs fois à l’aide d’une pipette.

Si de petits fragments de tissu obstruent l'embout, coupez-en deux à trois millimètres afin de faciliter la prise du volume correct de solution, ce qui permettra de disposer d'un espace suffisant pour la goutte en haut de la plaque. Répartissez les tissus provenant de génotypes différents en alternant les rangées. Pour préparer une dilution sérielle dix fois, transférez 20 microlitres de la suspension tissulaire dans la deuxième rangée et répétez cette procédure jusqu'à la sixième dilution. À l'aide d'embouts de pipette divisés, transférez 20 microlitres de la solution depuis la plaque à 96 puits vers la plaque KB de 150 millimètres par 15 millimètres.

Travaillez en commençant par la suspension la plus diluée jusqu'à la plus concentrée afin qu'il ne soit pas nécessaire de changer les embouts de pipette entre les dilutions. Séchez la plaque à température ambiante avec le couvercle entrouvert. Une fois qu'aucun liquide n'est plus visible à la surface de la plaque, fermez le couvercle, retournez la plaque et incubez-la à température ambiante.

Incuber les boîtes pendant 40 à 60 heures jusqu'à ce que les colonies deviennent visibles. Vérifier que les bactéries sur les boîtes reflètent la diminution prévisible d'un facteur dix des unités formant des colonies.

Compter les bactéries avant qu'elles ne surcroissent et que les colonies ne fusionnent. Déterminer le nombre de bactéries dans la dilution la plus faible ne présentant pas de colonies chevauchantes. Habituellement, la dilution privilégiée à compter contiendra entre 10 et 50 colonies, et peut varier selon les réplicats techniques.

Pour calculer les niveaux de prolifération bactérienne, déterminez le nombre d'unités formant des colonies par disque foliaire à l'aide de cette formule, où R correspond au nombre de la rangée et T au nombre de bactéries dans chaque réplicat technique. Les données sont ensuite utilisées pour produire un graphique. Chaque point de données est représenté comme la moyenne de six réplicats techniques sur une échelle logarithmique.

Les barres représentent l'intervalle de confiance à 95 % de la moyenne de la maladie aggravée. La susceptibilité au P-S-M-E-S 43 26 a été évaluée par infection avec un inoculum ayant une DO à 600 de 0,0002. Les résultats montrent que les mutants NPR un trait d'union un hautement sensibles présentent une croissance du pathogène d'environ 2,5 log, soit 300 fois plus importante, par rapport aux plantes de type sauvage Columbia zéro.

Le test d'infiltration par seringue peut être modifié pour évaluer différentes couches de la réponse immunitaire. Pour analyser l'immunité induite par l'acide salicylique, une application externe de salicylate de sodium est utilisée afin de déclencher la réponse immunitaire, laquelle est quantifiée par la croissance du pathogène. La perte de NPR1, qui fonctionne comme récepteur de l'acide salicylique et comme co-régulateur transcriptionnel majeur des gènes cibles dépendants de l'acide salicylique, conduit à une insensibilité à l'application exogène du dérivé de l'acide salicylique.

Pour caractériser l'immunité induite par les motifs moléculaires associés aux microorganismes, les plantes ont été prétraitées avec deux inducteurs connus. Les plantes sauvages de type Columbia zéro traitées au FLAG 22 ont montré une réduction d'un facteur logarithmique, soit 10 fois, de la population bactérienne, tandis que les plantes mutantes FLS deux n'ont pas réussi à induire l'effet de restriction de la croissance bactérienne. De même, les plantes mutantes EFR se sont révélées insensibles au prétraitement par le L 18.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de quantifier la réponse immunitaire d'Arabic opsys par le biais du test d'infiltration à la seringue. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller le développement de la maladie et de prélever les tissus après l'apparition des corsis. Le pathogène Pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 est un hémiatrophe.

Ainsi, l'échantillonnage doit être effectué avant la transition vers la phase neurotrophique. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la PCR quantitative en temps réel et l'analyse sanguine par immunobuvardage peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple quelle voie spécifique de signalisation immunitaire est perturbée. N'oubliez pas que vous travaillez avec des bactéries vivantes.

Bien que Pseudomona Senge ne soit pas pathogène pour l'homme, veuillez vous assurer de bien éliminer les consommables contaminés et les plantes infectées lors de la réalisation de cette procédure.