Name: Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Apprenez à isoler des fibroblastes dermiques murins par FACS sans culture in vitro, préservant ainsi leur phénotype natif. Cette méthode permet d'étudier l'hétérogénéité cellulaire dans la cicatrisation et la fibrose.

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Ce travail a été financé en partie par une subvention du NIH R01 GM087609 (à HPL), un cadeau d&#39;Ingrid Lai et Bill Shu en l&#39;honneur d&#39;Anthony Shu (à HPL), subvention du NIH U01 HL099776 (MTL), le Laboratoire Hagey pour pédiatrique médecine régénérative et la Fondation Oak (MTL, GCG et HPL). GMV a été soutenu par l&#39;École de médecine de Stanford, le Programme de formation scientifique médicale de Stanford, et la subvention de formation NIGMS GM07365. ZNM a été soutenu par la chirurgie plastique Research Foundation Fellowship Grant et le Fonds de la famille Hagey. MSH a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) la formation Fellow clinique de subvention TG2-01159, l&#39;American Society of maxillo-chirurgiens (ASMS) / maxillo-faciale chirurgiens Foundation (MSF) Subvention de recherche, et de la transplantation et de génie tissulaire Fellowship Award.

Ce protocole fait suite à des méthodes approuvées par la commission administrative Université de Stanford sur Laboratory Animal Care. 1. Digestion des murins derme <ol><li> Euthanasier souris par dislocation cervicale après anesthésie par une injection intraperitoneale de kétamine 100 mg / kg de xylazine + 20 mg / kg + acépromazine 3 mg / kg. Remarque: différents âges et milieux peuvent être utilisés. </li><li> Rasage et épiler la peau du dos. Environ 100.000 cellules peuvent être isolées à partir d&#39;un morceau de peau du dos 60 mm x 100 mm. </li><li> Immerger la souris dans 70% d&#39;éthanol et le placer sur une surface propre, stérile pour les sécher. </li><li> Immédiatement récolter la peau dorsale de souris à l&#39;aide des ciseaux de dissection stériles. Chez les souris femelles, éviter d&#39;inclure le tissu mammaire. </li><li> Démarrage de la base de la queue, utiliser une pince pour tente la peau et faire une coupe transversale avant de disséquer le long du plan supra-aponévrotique. </li><li> Eviter soigneusement y compris toute graisse sous-cutanée pendant la récoltela peau. Examiner la peau prélevée pour toute graisse sous-cutanée et grattez soigneusement le tout en utilisant le bord tranchant d&#39;un scalpel. </li><li> Rincer la peau récoltées dans la bétadine suivie par 5x lavages PBS sur la glace. Remarque: Il est important de garder la peau au plus près stérile que possible pour éviter toute contamination. </li><li> Émincer la peau en utilisant des lames de rasoir et la dissection des ciseaux dans un plat stérile jusqu&#39;à l&#39;échantillon est d&#39;une consistance uniforme avec 2-3 mm morceaux. </li><li> Préparer des tubes coniques de 50 ml contenant 20 ml de collagénase IV à une concentration de 1 mg / ml dans du DMEM. Diviser le derme dans les tubes sur la base de cinq souris par tube. </li><li> Agiter vigoureusement échantillons tout en incubation à 37 ° C pendant 1 h dans une baignoire d&#39;eau ou au four. </li><li> Retirer les échantillons de l&#39;incubateur et passer à travers une seringue de 10 ml sans aiguille 3-5x dans une hotte stérile. </li><li> Placer les échantillons de nouveau dans l&#39;incubateur à 37 ° C et agiter vigoureusement pendant encore 30 min. </li><li> Dans une hotte stérile, Une pipette les échantillons de haut en bas 3-5x utilisant une pipette de 10 ml. Pipeter l&#39;échantillon à travers un filtre de 100 um dans un nouveau 50 ml tube conique. </li><li> Faire passer 20 ml de DMEM 10% de FBS à travers le même filtre pour maximiser le rendement de la cellule et porter le volume total à 40 ml. Centrifugeuse à 300 g pendant 8 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre stérile, en prenant grand soin d&#39;enlever d&#39;abord la couche supérieure de la graisse avant surnageant restant. Remarque: Cette étape est essentielle pour réduire la contamination de l&#39;adipocyte. </li><li> Remettre en suspension les culots dans 20 ml de DMEM 10% de FBS. </li><li> Passez la suspension de cellules / DMEM à travers un filtre de 70 um. </li><li> Rincez le filtre avec 10 ml 10% de FBS DMEM et centrifuger la suspension filtrée à 300 g pendant 8 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre stérile, en prenant également soin d&#39;enlever d&#39;abord toute couche de graisse restante. </li><li> Si la contamination est importante RBC (le culot est visiblement rouge), remettre en suspension les pastillesdans 20 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Sinon, passez à l&#39;étape 24. </li><li> Ajouter un volume égal (20 ml) de tampon FACS (PBS, 10% de FBS, de l&#39;azoture de sodium à 0,1%), puis mélanger et garder de côté une aliquote de 5 ml comme un témoin non coloré. Centrifuger l&#39;échantillon restant à 300 g pendant 8 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et de mettre granulés sur la glace. Les cellules peuvent être congelées à ce stade si le temps FACS ne sont pas disponibles. </li></ol> 2. Isolement des fibroblastes par FACS <ol><li> Faire 500 pi d&#39;anticorps de la lignée mélange d&#39;incubation pour chaque pastille. Pour ce faire, en ajoutant d&#39;abord 475 pi de tampon pour FACS contenant de la DNase (10 ug / ml) dans un tube, puis en ajoutant fluorophore conjugué à CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200), et EpCAM (1: 100) pour obtenir l&#39;anticorps respectif pour chaque dilution d&#39;anticorps. </li><li> Re-suspendre chaque culot dans 500 pl d&#39;anticorps de lignée incubation et incuber ce mélange suspension sur de la glace pendant 20 min. </li><li> Ajouter 5ml FACS tampon contenant de la DNase (10 ug / ml) à l&#39;échantillon et mélanger doucement. Centrifugeuse à 300 g pendant 8 min à 4 ° C. </li><li> Eliminer le surnageant et laver le culot cellulaire avec un tampon FACS contenant 5 ml de DNase (10 ug / ml) et centrifugation dans les mêmes conditions que dans l&#39;étape 26. </li><li> Reprendre le culot dans un tampon FACS contenant 500 ul de DNase (10 ug / ml) et mettre de côté une partie aliquote de 50 ul en tant que témoin viabilité de colorant. </li><li> Ajouter la viabilité colorant de choix pour l&#39;échantillon restant dans la concentration indiquée pour le colorant choisi. </li><li> Effectuer une analyse FACS 31 et de tri pour la viabilité Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- cellules (voir figure 2A). Trier directement dans le tampon FACS. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit dans ce manuscrit offre un moyen d&#39;isoler les fibroblastes par tri à base de FACS, par rapport aux méthodes existantes, qui soit sélectionner une sous-population ou nécessitent du temps dans la culture cellulaire avant les analyses ultérieures. Le temps nécessaire à partir de la récolte de la peau pour le tri des fibroblastes est d&#39;environ 6 h; toutefois, le nombre de souris utilisées dans la récolte aura une influence sur cette estimation. Plusieurs points du pro...

Les fibroblastes sont souvent morphologiquement définies comme des cellules en forme de fuseau qui adhèrent à des substrats en matière plastique. Les fibroblastes sont le type cellulaire principe responsable de la synthèse et le remodelage de la matrice extracellulaire dans des organes embryonnaires et adultes 1. Les fibroblastes sont donc cruciale pour le développement des mammifères et contribuent sensiblement au milieu extracellulaire qui influe sur le comportement des types présents dans chaque tissus et des organes de cellule voisine. Les fibroblastes sont aussi le type de cellule principale derrière un ensemble diversifié de conditions médicales qui causent énorme fardeau clinique. L&#39;activité des fibroblastes pathologique altère la fonction tissulaire normale et comporte des tissus et de la fibrose d&#39;organes (tels que le poumon et le foie), la cicatrisation suivant la cicatrisation cutanée des plaies, l&#39;athérosclérose, la sclérose systémique, et la formation de plaques d&#39;athérome après une lésion de vaisseau sanguin 05/02. La cicatrisation des plaies, en particulier, à la fois aiguë et chronique, implique deposition de tissu cicatriciel que ni ressemble ni fonctions comme le tissu normal environnant, et conduit à une morbidité significative dans divers états pathologiques. À la suite de blessures, il existe une transition de fibroblastes de myofibroblastes, qui sécrètent des composants structuraux puis ECM, exercent des effets paracrines sur des types de cellules voisines, et rétablir la stabilité mécanique par dépôt de tissu cicatriciel 6. Dans les tissus cutanés, il existe une variation significative de la qualité de la réparation des plaies à travers le temps de développement et entre les sites anatomiques. Dans les deux premiers trimestres de la vie du fœtus guérit sans laisser de cicatrices; Toutefois, à partir du troisième trimestre de la grossesse et de l&#39;âge adulte, les humains guérir avec une cicatrice. Spécifique au site, en plus de la fonction de l&#39;âge, les différences dans la cicatrisation des plaies existent. Les plaies dans la cavité buccale avec un minimum de remodeler la formation de cicatrices 7,8, tandis que le dépôt de tissu cicatriciel à l&#39;intérieur de plaies cutanées 9 est significatif. La controverse persiste cONCERNANT l&#39;influence relative de l&#39;environnement par rapport aux propriétés intrinsèques des fibroblastes locaux sur les résultats de la cicatrisation des plaies en ce qui concerne à la fois l&#39;âge et l&#39;emplacement 10,11. Compte tenu des différences significatives dans la guérison des souris par voie orale contre derme cutanées et embryonnaire antérieure (E15) vs tard embryonnaire (E18) derme, il est probable qu&#39;il existe des différences intrinsèques dans les populations de fibroblastes à certains âges de développement et parmi les différents sites anatomiques . En 1986, Harold F. Dvorak posé tumeurs sont des plaies qui ne guérissent pas 12. Dvorak a conclu que les tumeurs se comportent comme des blessures dans le corps et induisent leur stroma par l&#39;activation de la cicatrisation des plaies réponse de l&#39;hôte. De nombreuses études ont depuis étudié la contribution des fibroblastes à la progression de carcinomes 13-15, mais comme dans le cas de la cicatrisation des plaies, l&#39;identité et l&#39;origine embryonnaire des fibroblastes qui contribuent au compartiment stromal cutanée de carcinomas n&#39;a pas été suffisamment défini. La réponse à cette question porte pertinence médicale donnée études récentes exposant le fibroblaste associé à une tumeur comme une cible potentiellement efficace pour la thérapie anti-cancer 16. Identifier et isoler de façon prospective les lignées de fibroblastes dotés d&#39;un potentiel fibrogène in vivo est une étape essentielle vers manipuler efficacement leur réponse à une blessure dans un large éventail d&#39;états pathologiques aigus et chroniques. En 1987, Cormack a démontré deux sous-populations de fibroblastes, un résidant dans la papillaire et un dans le derme réticulaire 17,18. Un troisième sous-population a été trouvée associée à follicules pileux dans la région de la papille dermique du follicule de 19,20. Lorsqu&#39;elle est cultivée, ces différences sous-types de fibroblastes d&#39;exposition dans le potentiel de croissance, la morphologie, et des facteurs de croissance / cytokines profils 21-24. À ce jour, les études examinant fibroblastes ilterogeneity ont largement échoué à caractériser adéquatement la diversité de développement et fonctionnelle entre les fibroblastes in vivo. Ceci est, en partie, est le résultat d&#39;une dépendance à l&#39;égard des populations de fibroblastes en culture et l&#39;effet d&#39;homogénéisation de la culture cellulaire ou la sélection positive sur la base d&#39;un récepteur de surface libre ne sont pas exprimés par les fibroblastes 25. Une étude récente de notre laboratoire a démontré un marqueur de surface profonde et changement de transcription dans les fibroblastes cultivés contre incultes isolés par la méthode d&#39;isolation à base de FACS présenté dans ce manuscrit 26. Par la suite, nous avons identifié une lignée de fibroblastes spécifique dans le derme dorsales murines et déterminé que cette lignée, défini par l&#39;expression embryonnaire de Engrailed-1, est principalement responsable pour le dépôt de tissu conjonctif dans la peau du dos. Les fonctions de la lignée pendant deux formes aiguës et chroniques de la fibrose, notamment la cicatrisation, la formation de stroma du cancer, etrayonnement induit une fibrose 27. La caractérisation des lignées distinctes fibroblastes a des conséquences critiques pour les thérapies visant à moduler le comportement fibrogénique. Plutôt que d&#39;utiliser les protocoles existants qui reposent sur ​​la manipulation in vitro pour obtenir l&#39;isolement cellulaire 28,29, le protocole de récolte (Figure 1) détaillé ici aidera rendement analyses informatives de fibroblastes qui captureront plus exactement phénotype et le comportement in vivo.

<table><tbody><tr><td>Pince chirurgicale</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ciseaux</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine Prep Solution</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (crème dépilatoire)</td><td>Church and Dwight Co.</td><td></td><td></td>22600267058</tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse ammoniaque-chlorure-potassium (ACK)</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; m filtres</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; filtres m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; filtres Fisher</td><td>Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>iodure de propidium (coloration de viabilité PI)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

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 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Les fibroblastes sont le type de cellules sécrétant principe responsable de la matrice extracellulaire et sont une composante essentielle de nombreux organes et tissus. Fibroblastes et la pathologie sous-tendent la physiologie un spectre d&#39;entités cliniques, y compris les fibroses dans plusieurs organes, les cicatrices hypertrophiques brûlures suivantes, la perte de la fonction cardiaque après une ischémie, et la formation de stroma du cancer. Cependant, les fibroblastes restent un type mal caractérisé de la cellule, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. Les procédés existants pour l&#39;isolement des fibroblastes en culture ont besoin de temps de cellule qui influence profondément phénotype et le comportement cellulaire. Par conséquent, de nombreuses études sur la biologie fibroblastes reposent sur ​​la manipulation in vitro et ne reflètent pas fidèlement le comportement des fibroblastes in vivo. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un protocole à base de FACS pour l&#39;isolement des fibroblastes de la peau du dos de souris adultes qui ne nécessite pas de culture cellulaire, ainsi preserving de la transcription physiologique et le profil protéomique de chaque cellule. Notre stratégie permet exclusion des lignées non-mésenchymateuses par une porte de lignée négative (Lin -) plutôt que d&#39;une stratégie de sélection positive pour éviter de pré-sélection ou à l&#39;enrichissement d&#39;une sous-population de fibroblastes exprimant des marqueurs de surface spécifiques et être aussi inclusif que possible sur ce hétérogène type de cellule.

La validité de cette approche (Figure 1) a été vérifiée dans un certain nombre de façons, qui peuvent être examinés en détail dans notre publication récente 27. Ceux-ci comprennent immunocytochimie des cellules triées et la masse cellulaire et unique analyse transcriptionnelle de la cellule des cellules fraîchement triées. Tri fibroblastes directement plutôt que de compter sur la culture avec plus de précision capte leur phénotype in vivo. En utilisant une approche de la lignée négative de l&#39;épuiseme...

Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des fibroblastes par tri cellulaire par flux (FACS), évitant ainsi la culture in vitro, qui s'est révélée provoquer un changement phénotypique dans ces cellules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie du développement et en cicatrisation, comme la manière d'identifier les sous-types de fibroblastes impliqués dans la formation de cicatrices et la fibrose. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'éviter les expériences in vitro, l'adhérence au plastique altérant le phénotype des fibroblastes.Cette méthode permet non seulement d'obtenir des informations sur les fibroblastes dermiques, mais peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les fibroblastes péritonéaux et les adhérences abdominales. Commencez par raser et épiler la peau dorsale de la souris étudiée. Ensuite, immergez la souris dépilée dans de l'éthanol à 70 % et placez l'animal sur une surface propre et stérile pour le faire sécher.Ensuite, en partant de la base de la queue, utilisez une pince pour soulever la peau et effectuez une incision transversale à l’aide de ciseaux de dissection. Puis, disséquez le long du plan sus-fascial pour prélever le tissu dorsal. Lorsqu’un morceau de peau de 60 par 100 millimètres a été retiré, utilisez le bord contondant d’un scalpel pour enlever soigneusement toute graisse sous-cutanée.Ensuite, rincez la peau prélevée à la bétadine, puis effectuez cinq lavages au PBS sur glace. À l’aide de lames de rasoir et de ciseaux de dissection, hachez les morceaux de derme dans une boîte stérile jusqu’à ce que les échantillons aient une taille uniforme d’environ deux à trois millimètres. Puis, transférez les fragments de tissu provenant de jusqu’à cinq souris dans le nombre approprié de tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 20 millilitres de collagénase 4 dans du dmem.Agiter vigoureusement les échantillons à 37 degrés Celsius. Après une heure, transférer les tubes dans une hotte stérile et faire passer les fragments de tissu à travers une seringue de 10 millilitres sans aiguille trois à cinq fois. Remettre les échantillons sur l'agitateurs pendant encore 30 minutes, puis effectuer trois à cinq passages supplémentaires à l’aide d’une seringue de 10 millilitres.Ensuite, filtrez les échantillons à travers un tamis de 100 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres et rincez la maille avec 20 millilitres de DMEM, complété par du FBS afin d'ajuster le volume total à 40 millilitres. Puis, centrifugez les cellules et utilisez une pipette en verre stérile pour aspirer la couche lipidique supérieure. Une fois les tissus adipeux contaminants éliminés, utilisez une pipette en verre neuve pour retirer le reste du surnageant et resuspendre les culots dans 20 millilitres de DMEM supplémenté de FBS.Filtrez maintenant les cellules à travers un tamis de 75 microns et rincez le maillage avec 10 millilitres de DMEM supplémenté de FCS. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules et éliminez la graisse et le surnageant comme vient de l'être démontré. Resuspendez le culot dans 20 millilitres de tampon FACS, en prélevant un aliquot de cinq millilitres pour le témoin non marqué.Ensuite, centrifuger l'échantillon restant, éliminer le surnageant et placer le culot sur de la glace. Pour isoler les fibroblastes par tri cellulaire (FACS), resuspendre les culots dans 500 microlitres de mélange d'incubation avec les anticorps de lignage, sur de la glace. Après 20 minutes, mélanger délicatement cinq millilitres de tampon FACS, supplémenté avec de la DNase, avec les cellules, puis les centrifuger.Lavez le culot dans un second volume de cinq millilitres de DNase. Ensuite, resuspendez les cellules dans 500 microlitres de tampon FACS et de DNase, en réservant un aliquot de 50 microlitres de cellules pour le témoin du colorant de viabilité. Enfin, ajoutez le colorant de viabilité à l'échantillon restant et triez les cellules selon le schéma.Utiliser une approche de déplétion négative de lignée plutôt qu'une approche de sélection positive permet d'éviter la présélection de sous-populations particulières. L'analyse par puces à ARN montre que les fibroblastes cultivés isolés par les méthodes de prélèvement à vie et d'explant de tissu présentent un haut degré de similitude au niveau du transcriptome, avec un coefficient de corrélation produit-moment de Pearson de 0,92. En comparaison, les fibroblastes cultivés différaient significativement des fibroblastes non cultivés obtenus par prélèvement à vie, ce qui souligne l'importance d'analyser les fibroblastes prélevés à vie plutôt que les fibroblastes cultivés.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement et de la cicatrisation pour confirmer l'hétérogénéité des fibroblastes et identifier les sous-populations responsables des cicatrices et d'autres formes de fibroses.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cancer fibroblastes associés (CAF) de faciliter l'initiation des tumeurs, la croissance et la progression à travers signalisation qui favorise la prolifération, l'angiogenèse et l'inflammation. Nous décrivons ici une méthode pour isoler des populations pures de fibroblastes normaux et de souris CAF frais et tissus humains par tri cellulaire, en utilisant PDGFRα comme un marqueur de surface.

Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Cette vidéo décrit la méthode rapide pour isoler et cultiver simultanément les mélanocytes et le fibroblaste à partir de la peau du bébé souris postnatal. Ces cellules peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier la biologie des cellules de la peau, la cicatrisation des plaies et le mélanome.

Culture rapide de mélanocytes et de fibroblastes murins primaires : isolement des mélanocytes et des fibroblastes à partir d’un échantillon de peau murine entière

Le follicule pileux de souris est un modèle idéal pour étudier la biologie des cellules souches adultes. Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler différentes populations de follicules pileux, de cellules souches et de kératinocytes épidermiques, en utilisant la digestion enzymatique de la peau dorsale de souris suivie d’une analyse FACS.

Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

Ce manuscrit décrit un protocole basé sur le FACS pour l’isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine. Il contourne la culture in vitro qui était inévitable avec le protocole d’isolement couramment utilisé par les cultures explant. Les sous-ensembles de fibroblastes qui émanent sont fonctionnellement distincts et présentent une expression et une localisation différentielles dans le derme.

Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

Ce protocole décrit une méthode rapide pour générer simultanément des cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir de la peau de souris de 0 à 4 jours. Ces cultures primaires peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier une variété de processus physiologiquement pertinents, y compris la biologie des cellules de la peau, la pigmentation, la cicatrisation des plaies et le mélanome.

Génération rapide de cultures de murine primaire et de fibroblaste

Nous présentons un protocole pour isoler les fibroblastes adultes primaires d'une manière facile, rapide et fiable, performable par les débutants (p. ex., les étudiants). La procédure combine la digestion des tissus enzymatiques et l'agitation mécanique avec des ondes ultrasoniques pour obtenir des fibroblastes primaires. Le protocole peut facilement être adapté à des exigences expérimentales spécifiques (p. ex., tissus humains).

Isolement du fibroblaste primaire adulte à ultrasons

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

L’obtention d’une population pure de fibroblastes est cruciale pour étudier leur rôle dans la réparation des plaies et la fibrose. Décrit ici est une méthode détaillée pour isoler les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés suivis par la caractérisation de leur pureté et de leur fonctionnalité par immunofluorescence, RTPCR, tri cellulaire assisté par fluorescence, et contraction du gel de collagène.

Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes

Cet article décrit une méthode basée sur la culture d’explants pour l’isolement et la culture de cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires spécifiques au patient et de fibroblastes dermiques. En outre, une nouvelle méthode est présentée pour mesurer la contraction cellulaire et l’analyse ultérieure, qui peut être utilisée pour étudier les différences spécifiques au patient dans ces cellules.

Isolement des cellules musculaires lisses aortiques primaires spécifiques au patient et mesures semi-quantitatives de contraction en temps réel in vitro

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

Ce protocole décrit une méthode optimisée pour dissocier les glandes lacrymales de souris âgées afin d’obtenir des cellules uniques viables pour le séquençage de l’ARN unicellulaire. La digestion enzymatique séquentielle et la manipulation douce préservent l’intégrité cellulaire, produisant des suspensions de haute qualité adaptées à l’isolement spécifique au type cellulaire et à l’analyse transcriptomique des changements associés au vieillissement dans les populations de glandes lacrymales.

Protocole pour la dissociation unicellulaire, le séquençage de l’ARN et l’isolement des cellules myoépithéliales et des fibroblastes des glandes lacrymales et salivaires âgées

Apprenez à isoler des fibroblastes dermiques murins par FACS sans culture in vitro, préservant ainsi leur phénotype natif. Cette méthode permet d'étudier l'hétérogénéité cellulaire dans la cicatrisation et la fibrose.

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

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