Name: Lateral système inductible Racine dans Arabidopsis Et de maïs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez le système inductible de racines latérales pour étudier le développement racinaire chez Arabidopsis thaliana et le maïs. Cette méthode in vitro permet une induction synchrone et homogène grâce à des traitements hormonaux.

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Les auteurs remercient Davy Opdenacker pour son assistance technique et sa photographie. Nous remercions grandement la Dre Annick Bleys pour ses suggestions utiles afin d’améliorer le manuscrit. Ce travail a été financé par le Programme Interuniversitaire des Pôles d’Attraction IUAP P7/29 'MARS' de la Politique scientifique fédérale belge, par le FWO grant G027313N et par l’Agence pour l’Innovation par la Science et la Technologie, IWT (IR).

1. Arabidopsis Protocole SCIF Note: Le texte se réfère à &quot;petits&quot; ou &quot;grands&quot; expériences à grande échelle. Expériences à petite échelle, telles que l&#39;analyse de la ligne de marqueur et coloration histologique 6, 14, ne nécessitent que quelques échantillons. Expériences à grande échelle, tels que quantitative en temps réel qRT-PCR, micro-arrays 9-11 ou séquençage de l&#39;ARN, exigent une plus grande quantité d&#39;échantillons. En tant que tel, un montant de ~ 1000 plants par échantillon a été utilisé par 11 Vanneste et al. Pour effectuer expérience de puces à ADN après segment de racine dissection. JOUR 1 <ol><li> Stérilisation des graines d&#39;Arabidopsis Remarque: Sélectionnez l&#39;une des procédures suivantes pour la stérilisation des semences. Chacun d&#39;entre eux est adapté pour les prochaines étapes du protocole. La stérilisation de gaz (1.1.2) présente deux principaux avantages sur la stérilisation de liquide (1.1.1): il prend moins de temps lors de la manipulation d&#39;un grand engourdieer de graines, car aucune pipetage doit se produire pour les échantillons individuels; et les graines stérilisées peuvent être stockées pendant une période plus longue. Cependant, elle nécessite un dessiccateur et une manutention prudente. <ol><li> Liquide de stérilisation <ol><li> Verser le nombre souhaité de graines dans des tubes de micro-centrifugation. Utilisez jusqu&#39;à 20 mg (~ 800 graines) dans un tube de 1,5 ml ou de 40 mg (~ 1600 graines) dans 2 ml d&#39;un des tubes de micro-centrifugation. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 70%. Inversez ou secouer doucement pendant 2 min. </li><li> Remplacer l&#39;éthanol avec 1 ml de solution de stérilisation de 70% pendant 15 min. (Préparer la solution de stérilisation frais: 3,85 ml d&#39;hypochlorite de sodium (NaOCl) stock (12%) (ATTENTION: L&#39;utilisation hotte), 5 pi de Tween 20, jusqu&#39;à 10 ml avec de l&#39;eau inverser les tubes à plusieurs reprises pour faire en sorte que toutes les graines viennent. en contact avec la solution. </li><li> Dans une hotte à flux d&#39;air laminaire, remplacer la solution de stérilisation avec 1 ml d&#39;eau distillée stérile et rincer les graines 5 fois pendant 5 min répété parLy remplaçant avec 1 ml d&#39;eau fraîche distillée stérile. </li></ol></li><li> Stérilisation de gaz <ol><li> Verser le nombre souhaité de graines dans un tube de micro-centrifugeuse de 2 ml. Utilisez des tubes individuels lorsque vous travaillez avec plusieurs lignes indépendantes, et les disposer ouverts dans une boîte ou un support de micro-tubes à centrifuger en plastique. Si le nombre de graines dans un tube est supérieure à 500 (12,5 mg), de subdiviser les graines dans le nombre approprié de tubes pour assurer la stérilisation réussie. Assurez-vous que les bouchons des tubes voisins ne couvrent pas l&#39;autre. Assembler le couvercle de la boîte sur le fond, car il a besoin d&#39;être dans le dessiccateur ainsi pour la stérilisation. </li><li> Placez la boîte dans le bol d&#39;un dessiccateur, avec un gobelet de verre (ATTENTION: L&#39;utilisation hotte). </li><li> Remplir le bécher avec 100 ml de 12% NaOCl (ATTENTION: L&#39;utilisation capot fumées). Mettez le couvercle sur le dessiccateur, mais laisser une petite ouverture où le bécher est placé. </li><li> Ajouter 3 ml d&#39;acide chlorhydrique à 37% (fumant) (CAUTION: utilisation hotte) dans le bécher à travers la petite ouverture et fermer rapidement le dessiccateur. La volonté bulle de solution pour un certain temps en raison de la formation Cl 2 -gaz. Laissez le système fermé O / N (ou au moins 8 heures). </li><li> Retirer le couvercle du dessiccateur. Sortez la boîte et le couvrir avec le couvercle pour éviter toute contamination pendant le transport. </li><li> Mettez la boîte dans une hotte à flux d&#39;air laminaire, retirez le couvercle et laisser les graines pendant environ 1 heure à température ambiante pour permettre la libération de gaz. Note: Les graines peuvent être stockés en toute sécurité à sec dans des tubes de micro-centrifugation fermés jusqu&#39;à 2 semaines à 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Induction des racines latérales chez Arabidopsis <ol><li> Inhibition de racines latérales (traitement NPA) <ol><li> Préparer un milieu de croissance pour la croissance in vitro. Le milieu contient la moitié de la force mélange Murashige et Skoog 15 sel, 0,1 g / L de myo-inositol, 10 g / L de saccharose, et est tamponnée avec 0,5g / L 2- (N-morpholino) éthanesulfonique (MES). </li><li> Ajuster le pH à 5,7 avec KOH 1 M. Ajouter 8 g / L de gélose de tissus végétaux et de l&#39;autoclave le moyen pendant 20 min à 121 ° C. </li><li> Préparer un mM solution de NPA 25 dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) (ATTENTION: Utiliser des gants). Dans une hotte à flux d&#39;air laminaire, refroidir le milieu autoclave jusqu&#39;à environ 65 ° C (qui est la température à laquelle la bouteille peut être tenu à la main), et d&#39;ajouter mM NPA solution stock 25 pour obtenir une concentration finale de 10 uM NPA. </li><li> Homogénéiser lors de l&#39;addition en agitant doucement le flacon pendant 10 secondes. Verser 50 ml de milieu par boîte de Pétri carrée (12 cm x 12 cm). Remarque: En cas de grande expérience à grande échelle, appliquer un filet de nylon (20 um) pour assurer le transfert facile. Préparer une maille (9 cm x 9 cm) de l&#39;autoclave (figure 1A). Quand l&#39;autoclave, à appliquer le maillage du milieu de croissance en utilisant des pinces stériles (Figure 1B). Poussez doucement le maillage pour le milieu de croissance en utilisant un sterilized drigalsky pour vous assurer qu&#39;il est en bon contact avec le milieu de croissance (figure 1B) (ATTENTION: travailler dans des conditions stériles). </li><li> Semez les graines sur les NPA-plaques. Remarque: Dans le cas d&#39;une grande expérience à grande échelle est prévu, sèment 2 lignes denses et bien alignées de 50 graines pour faciliter l&#39;échantillonnage (voir 1.2.2.3). <ol><li> En cas de stérilisation liquide, semer les graines sur NPA-plaques à l&#39;aide d&#39;une pipette de 200 pi. Coupez 3 - 4 mm de la fin des conseils de pipetage dans des conditions stériles (ou avant la stérilisation des conseils) afin d&#39;être en mesure de pipeter les graines. Pipet monter et descendre une couple de fois pour remettre en suspension les graines, puis de pipettes à aspiration de l&#39;eau à environ 150 pi stérile avec 10 - 20 graines et attendre que les sédiments des semences au bas de la pointe. (ATTENTION: travailler dans des conditions stériles) Note: Lorsque vous touchez la agar ou la maille délicatement avec la pointe, une goutte d&#39;eau avec une graine sera libéré de ce (figure 1C). </li> &lt;li&gt; En cas de stérilisation au gaz, semer les graines à l&#39;aide autoclave toothpicks.Pinch le cure-dent dans la gélose avant de prendre les graines pour assurer une surface collante. Ramassez la graines une à une aide de la cure-dent et de distribuer les graines sur les plaques (figure 1D). Alternativement, ajouter de l&#39;eau stérile pour les graines, et de semer comme décrit dans 1.2.1.5.1 (ATTENTION: travailler dans des conditions stériles). </li></ol></li><li> Sceller les plaques avec du ruban adhésif respirant et rangez-les plaques à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant au moins 2 jours et au maximum une semaine. Ceci est nécessaire pour la stratification et assure la synchronisation et la germination plus efficace. Note: Alternativement, les graines peuvent être stratifiés avant le semis, immergés dans de l&#39;eau distillée dans les micro-centrifugeuse tubes, ce qui nécessite moins d&#39;espace de réfrigérateur. Dans ce cas, stocker les tubes pendant au moins une semaine à 4 ° C, et déplacer les plaques à l&#39;armoire de croissance immédiatement après le semis (voir 1.2.1.7). JOUR 3 </li&gt; <li> Déplacer les plaques à l&#39;armoire de croissance (lumière continue (110 uE m -2 s -1), 21 ° C) pendant 5 jours (2 jours de germination et 3 jours de croissance) dans une position presque verticale (80 à 90 °) pour assurer la croissance des racines sur, et non dans le milieu. JOUR 8 </li></ol></li><li> De racines latérales induction (traitement NAA) <ol><li> Préparer le même milieu de croissance tel que décrit dans 1.2.1.1 1.2.1.2 et. Préparer une solution à 50 mM de NAA dans le DMSO (ATTENTION: Utiliser des gants). Refroidir le milieu à l&#39;autoclave à 65 ° C et ajouter la solution NAA pour le moyen d&#39;obtenir une concentration finale de 10 uM NAA (ATTENTION: travailler dans des conditions stériles). <ol><li> Homogénéiser lors de l&#39;addition en agitant doucement le flacon pendant 10 secondes. Verser 50 ml de milieu par boîte de Pétri carrée (12 cm x 12 cm). </li></ol></li><li> Transférer les plants provenant des plaques contenant du milieu de croissance supplémenté avec 10 uM de l&#39;APM à celles supplétées avec 10 uM NAA. <ol><li> Accrocher les bras de pincettes courbes sous les cotylédons de la plantule et retirez-le délicatement de la plaque. Transférer seulement les plants dont les racines sont cultivées dans tout contact avec le milieu de croissance et l&#39;APM de préférence vers le bas. </li><li> Écumer la racine sur la surface du milieu de croissance contenant NAA sur une petite distance. Assurez-vous que les racines des plantes sont en bon contact avec le milieu de croissance. Si nécessaire, appuyez sur la racine doucement à la surface du milieu de croissance avec la pince à épiler. Remarque: Dans le cas d&#39;une expérience à grande échelle, supprimer tous les plants qui ne sont pas en contact avec la maille et le transfert en soulevant le filet sur les deux coins supérieurs avec des pincettes. Assurez-vous que le maillage est en bon contact avec le milieu contenant NAA par écrémage de la maille sur la surface de la gélose sur une petite distance (figure 1E). </li></ol></li><li> Sceller les nouvelles plaques avec du ruban adhésif respirant et placez-les dans l&#39;armoire de la croissance (conlumière continu (110 uE m -2 s -1), 21 ° C) dans une position verticale pendant le temps désiré après induction jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillonnage. Remarque: Dans le cas d&#39;une expérience à grande échelle, utiliser un scalpel pour couper les segments de racines à la fois directement sur le maillage et les déguster en grattant délicatement la surface de la maille. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. SCIF Protocole maïs <ol><li> Stratification de maïs Kernels <ol><li> Incuber les grains de maïs à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant au moins une semaine. Remarque: Ce protocole a été développé en utilisant la lignée consanguine B73 de maïs. </li></ol></li><li> Stérilisation des des grains de maïs JOUR 1 Remarque: Bien que les semis de maïs ne doivent pas être cultivées dans des conditions stériles, il est recommandé de stériliser les grains de maïs et de travailler avec du matériel stérile pour empêcher la croissance fongique dans le rouleau de papiersystème. <ol><li> Mettez le nombre nécessaire de grains de maïs dans un bécher en verre stérilisée. </li><li> Ajouter 100 ml de solution de stérilisation (6% NaOCl dans l&#39;eau) (ATTENTION: Utiliser hotte fumées). </li><li> Ajouter une barre d&#39;agitation magnétique et placer le bécher sur un agitateur magnétique à faible vitesse d&#39;agitation (environ 250 rpm) à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Rincer cinq fois pendant 5 minutes par le remplacement de la solution avec 100 ml d&#39;eau stérile frais. </li></ol></li><li> Semer des grains de maïs <ol><li> Mettez des gants afin de réduire le risque de contamination, et de prendre un rouleau de serviettes en papier. </li><li> Déchirez deux tronçons de papier essuie-main avec une longueur totale de deux feuilles (environ 92 cm x 24 cm) et de les placer sur le dessus de l&#39;autre sur une surface propre (figure 2A). </li><li> Pliez les feuilles de doubler sur la longueur (environ 92 cm x 12 cm) (figure 2A). </li><li> Utilisez des pinces à distribuer 10 noyaux à environ 2 cm du haut sur til toute la longueur du papier, tout en gardant un espace de 8 cm entre chaque noyau et 8 cm libre aux deux extrémités (figure 2B). Assurez-vous que la radicule du noyau est orientée vers le bas et vers le papier (figure 2B). </li><li> Rouler délicatement le papier sur la longueur, tout en gardant les graines en place (figure 2B). Pour faciliter le roulement, il est facultatif pour pulvériser d&#39;abord le papier avec de l&#39;eau stérile. </li><li> Placez les rouleaux de papier en tubes de verre stérilisés d&#39;environ 6 cm de diamètre et 14 cm de hauteur (par exemple, 250 ml tubes de centrifugeuses) et les placer dans un rack (figure 2C). </li></ol></li><li> Induction des racines latérales chez le maïs <ol><li> Préparer une solution stock mM NPA 50 (dissous dans du DMSO) (ATTENTION: Utiliser des gants). </li><li> Pour chaque tube, préparer une solution 50 uM NPA en ajoutant 125 pi du NPA mM solution stock de 50 à 125 ml d&#39;eau stérile dans un récipient en verre stérilisés. </li><li> Mélangez bien etversez 125 ml de la solution 50 uM NPA sur le rouleau de papier dans le tube. Le rouleau de papier va absorber la solution et devenir complètement trempé. Remarque: Lors de l&#39;utilisation des rouleaux et des tubes de papier avec d&#39;autres dimensions, ajuster le volume en conséquence. Le liquide devrait atteindre la moitié du tube pour assurer l&#39;absorption suffisante. </li><li> Placez le système de rouleau de papier dans une armoire de croissance pendant trois jours (27 ° C, éclairage continu, 70% d&#39;humidité relative). Assurez-vous que les rouleaux de papier restent trempés par l&#39;ajout supplémentaire solution à 50 uM NPA, puisque la solution évapore au fil du temps (figure 2D). JOUR 4 </li><li> Préparer une NAA mM solution stock 50 (dissous dans du DMSO) (ATTENTION: Utiliser des gants). </li><li> Pour chaque tube, préparer une solution de NAA 50 uM en ajoutant 125 pi de stock mM NAA 50 à 125 ml d&#39;eau stérile dans un récipient en verre stérilisés. </li><li> Doucement extraire plus de la solution APM restant des rouleaux de papier et placez lem dans l&#39;eau stérile pendant 5 min à laver sur (ATTENTION: Utiliser des gants). Appuyez doucement sur la plupart de l&#39;eau à partir des rouleaux de papier. Répéter cette étape de lavage à trois reprises. </li><li> Mélangez bien et versez la solution de NAA 50 uM sur les rouleaux de papier dans les tubes. Assurez-vous qu&#39;ils sont complètement trempés. </li><li> Placer le système de rouleau de papier dans l&#39;armoire de croissance (27 ° C, lumière continue, humidité relative 70%) pendant la durée voulue après l&#39;induction. </li></ol></li><li> Induction de racines latérales dans des racines adventives de la Couronne de maïs Remarque: Le SCIF comme décrit ci-dessus induit racines latérales dans la racine primaire. Toutefois, dans le maïs et d&#39;autres monocotylédones, la racine primaire et les racines séminales embryonnaires, avec leurs racines latérales, sont principalement important pendant le développement des semis. A un stade ultérieur de la croissance des plantes, les racines adventives post-embryonnaires posent sur ​​la tige et aussi développent des racines latérales pour former un nouveau système de racine 16. Le SCIF peut également être utiliséd pour induire racines latérales sur ces racines adventives de la Couronne post-embryonnaires en suivant quelques ajustements mineurs à la SCIF sur la racine primaire embryonnaire. <ol><li> Pour faire les rouleaux de papier, créer un sandwich de papiers avec respectivement deux couches de papier essuie-mains sur le côté extérieur, et deux couches de papier de germination sein. Placez les grains stérilisés (voir les étapes 02/01 au 02/02) entre les deux feuilles de papier de germination. Papier de germination, par rapport au papier essuie-mains, sera moins enclin à être pénétré par les poils absorbants et les racines latérales, ce qui rendra l&#39;ouverture de la rouleaux de papier plus facile plus tard. D&#39;autre part, les deux couches externes de papier essuie-mains vont faciliter l&#39;absorption du liquide. </li><li> Insérez les rouleaux dans 700 ml tubes de verre et versez de l&#39;eau stérile sans NPA sur eux. Assurez-vous qu&#39;ils sont complètement trempés. </li><li> Germer les grains stérilisés dans l&#39;armoire de la croissance (voir l&#39;étape 2.4.9). </li><li> Cultivez les semis jusqu&#39;à ce que les racines adventives de la Couronnecommencer à émerger (6 jours pour les B73). Assurez-vous que les rouleaux de papier sont maintenus humides en tout temps en ajoutant de l&#39;eau stérile si nécessaire. </li><li> Transfert à une solution à 25 uM NPA pendant 4 jours (voir les étapes 2.4.1 à 2.4.4), suivie par une induction similaire de latéral initiation des racines en remplaçant la solution APM avec une solution de NAA 50 uM après une étape de lavage (voir l&#39;étape 2.4 0,5 à 2.4.9). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Dans le protocole d&#39;Arabidopsis LRIS, il est important de transférer uniquement les plants qui ont poussé entièrement en contact avec le milieu de croissance contenant l&#39;APM. Cela garantit que l&#39;initiation de racine latérale est bloquée sur toute la longueur des racines. Afin d&#39;éviter de blesser les plantules pendant le transfert, les bras de la pince courbes peuvent être accrochés sous les cotylédons de la plantule. Lors du transfert, assurez-vous que les racines des plantules sont suffisamment...

Le système racinaire est crucial pour la croissance des plantes, car il assure l&#39;ancrage et l&#39;absorption de l&#39;eau et les nutriments du sol. Étant donné que l&#39;expansion d&#39;un système racinaire repose principalement sur la production de racines latérales, leur initiation et de la formation ont été largement étudiées. Les racines latérales sont lancés dans un sous-ensemble spécifique de cellules péricycle, appelées cellules fondateurs 1. Dans la plupart des dicotylédones, telles que Arabidopsis thaliana, ces cellules se trouvent au niveau des pôles de protoxylème 2, alors que dans les monocotylédones telles que le maïs, ils se trouvent au niveau des pôles du phloème 3. Fondateur de cellules sont marquées par une réponse de l&#39;auxine augmenté de 4, suivie par l&#39;expression de gènes du cycle cellulaire spécifiques (par exemple, la cycline B1; 1 / CYCB1; 1), après quoi ils subissent une première série de divisions anticlinales asymétriques 5. Après une série de divisions anticlinales et périclines coordonnés, une ébauche de racine latérale est formée qui a finalement émergera comme unracine latérale utonomous. Le lieu et le moment de l&#39;initiation des racines latérales ne sont cependant pas prévisible, depuis ces événements ne sont ni abondante ni synchronisées. Cela empêche l&#39;utilisation d&#39;approches moléculaires tels que la transcriptomique pour étudier ce processus. Pour y remédier, un système latéral inductible Root (SCIF) a été développé 6, 7. Dans ce système, les semis sont d&#39;abord traités avec N -1-naphthylphthalamique (NPA), qui inhibe le transport de l&#39;auxine et l&#39;accumulation par conséquent, bloquer latéral initiation des racines 8. En transférant ensuite le plant de milieu contenant de l&#39;acide acétique 1-naphtalène auxine synthétique (NAA), la couche de péricycle entier répond à des niveaux élevés d&#39;auxine ainsi massivement profondes ouverture divisions cellulaires latérales inducteurs 6. En tant que tel, ce système conduit à rapides, synchrones et de vastes racines latérales initiations, permettant la collecte facile des échantillons de racines enrichis pour une étape spécifique de la finle développement des racines RAL. Par la suite, ces échantillons peuvent être utilisés pour déterminer les profils d&#39;expression du génome entier au cours de la formation de racines latérales. Le SCIF a donné des connaissances déjà important au sujet latérale initiation des racines chez Arabidopsis et le maïs 9-13, mais la nécessité d&#39;appliquer ce système à d&#39;autres espèces de plantes devient plus apparente que plusieurs génomes sont séquencés et il ya un intérêt croissant pour transférer les connaissances aux économique importante espèce. Ici, les protocoles détaillés de l&#39;Arabidopsis et du maïs LRISs sont donnés. Ensuite, un exemple de l&#39;utilisation du système est prévu, en illustrant la façon dont les données acquises à partir de la transcriptomique LRIS de maïs peuvent être utilisées pour identifier des homologues fonctionnels qui ont une fonction conservée lors de l&#39;initiation de racine latérale dans différentes espèces végétales. Enfin, les lignes directrices pour optimiser la SCIF pour d&#39;autres espèces de plantes sont proposées.

<table><tbody><tr><td>ARABIDOPSIS LRIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis</td><td></td><td></td><td>seeds Col-0type ecotype</td></tr><tr><td>Stérilisation au gaz des graines</td><td></td><td></td><td></td></tr>tubes <tr><td>de micro-centrifugeuse 1,5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifugeuses tubes 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock microtubes à centrifuger</td></tr><tr><td>acide chlorhydrique</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37 % (fumant) pour analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. </td></tr><tr><td>Dessiccateur en verre</td> Ph Eu <td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Bécher</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>en verre</tr> Pyrex <tr><td>micro-tubes à centrifuger en plastique boîte ou support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stérilisation à l’eau de Javel des graines</></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>éthanol</td><td>fort Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Éthanol, abs. 100 % a.r. dilué à 70 %</td></tr><tr><td>hypochlorite de sodium (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12 %</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>eau</td><td></td><td></td><td></td> stérile</tr><tr><td><fort>milieu de croissance</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige et Skoog mélange de sels</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR, International LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-Saccharose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>granulés d’analyse (max. 0,002 % Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>Chemical d’induction latérale des racines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphtylphtalamique acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>N0926.0250</td><td>10 & micro ; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>Acide 1-naphtalène acétique (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>Réf. N0903.0050</td><td>10 & micro ; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Réalisation d’une maille pour transfert</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Mesh en nylon synthétique 20 &micro ; m</td></tr><tr><td>Manipulation des semis et des semis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaques carrées de Pétri</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml Tubes DURAN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&nbsp ; Tubes à centrifuger de 50 ml</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>coupe pointes de pipette</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, coupe 5 mm de pointe avant autoclave</td></tr><tr><td>ruban respirant&nbsp ;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>, réf. 1530-1</td><td></td></tr>, <tr><td>pince à épiler</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1 ; K344.1</td><td>Pince à épiler Dumont type a n° 5 ; Pince à épiler Dumont type e nr 7</td></tr><tr><td>Conditions de croissance</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>croissance room</td><td></td><td></td><td>21 &deg ; C, continu léger</td></tr><tr><td><fort>Matériaux</fort></td><td><fort>Entreprise</fort></td><td><fort>Catalogue</fort></td><td><fort>Commentaires</fort></td></tr><tr><td><fort>MAÏS LRIS</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Graines</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noyaux de</td><td></td><td></td> maïs <td>B-73</td></tr><tr><td><fort>Stérilisation à l’eau de Javel des grains</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr>agitateur magnétique à <tr><td>bécher</td><td></td><td></td><td></td>en verre</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>hypochlorite de sodium (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12 %</td></tr> eau stérile<tr><td><forte>Produits chimiques d’induction</td> latérale des racines</forte><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td>N-1-acide naphtylphtalamique (NPA)DUCHEFA Biochemie B.V.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>N0926.0250</td><td>50 & micro ; M (racine primaire de maïs), 25 & micro ; M (racine adventice du maïs)</td></tr><tr><td>Acide acétique 1-naphtalène (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>N0903.0050</td><td>50 & micro ; M (maïs)</td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Semis et manipulation des semis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>essuie-mains</td><td>en papier Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Essuie-mains - Rouleau / Blanc ; format feuille (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>papier de germination des graines</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# papier de germination des graines</td></tr><tr><td>pince à épiler</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1 ; K344.1</td><td>Pince à épiler Dumont type a n° 5 ; Pince à épiler Dumont type e n° 7</td></tr><tr><td>tubes de 250 ml (centrifugeuse)</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>environ 5,6 cm de diamètre et 14,7 cm de hauteur</td></tr><tr><td>Tubes de 700 ml</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cylindres, tube de pied rond, D 60 x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>pour tubes de maïs,</td></tr><tr><td>eau</td><td></td><td></td><td></td> stérile</tr> faite maison<tr><td><conditions de croissance fortes></fortes></td> armoire de croissance 27 &deg<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> ;<td></td><td></td><td> C, lumière continue, 70 % d’humidité relative</td></tr></tbody></table>

lateral système inductible racine dans<em&gt; arabidopsis</em&gt; et de maïs

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Le développement racinaire latéral contribue de manière significative au système racinaire et est donc crucial pour la croissance des plantes. L’étude de l’initiation radiculaire latérale est cependant fastidieuse, car elle ne se produit que dans quelques cellules à l’intérieur de la racine et de manière imprévisible. Pour contourner ce problème, un système inductible de racine latérale (LRIS) a été développé. En traitant les plantules consécutivement avec un inhibiteur de transport de l’auxine et une auxine synthétique, l’initiation latérale hautement contrôlée de la racine se produit de manière synchrone dans la racine primaire, ce qui permet un échantillonnage abondant d’un stade de développement souhaité. Le LRIS a d’abord été développé pour Arabidopsis thaliana, mais peut également être appliqué à d’autres plantes. En conséquence, il a été adapté pour être utilisé dans le maïs (Zea mays). Un aperçu détaillé des différentes étapes du SIIR dans les deux usines est donné. La combinaison de ce système avec la transcriptomique comparative a permis d’identifier des homologues fonctionnels des gènes d’initiation de la racine latérale d’Arabidopsis chez d’autres espèces comme illustré ici pour le CYCLIN B1 ; 1 (CYCB1 ; 1) Gène du cycle cellulaire chez le maïs. Enfin, les principes qui doivent être pris en compte lors de l’élaboration d’un SIIR pour d’autres espèces végétales sont discutés.

Application de la SCIF à Effectuer transcriptomique comparative des processus racine Initiation latéral Une application de la LRIS est la comparaison et de corrélation des profils d&#39;expression de gènes au cours de la formation de racines latérales chez différentes espèces. Transcriptomique comparative des approches de créer la possibilité d&#39;identifier les gènes orthologues impliqués dans le processus d...

Le système inductible de racines latérales (LRIS) permet l’induction synchrone des racines latérales et est présenté pour Arabidopsis thaliana et le maïs.

Lateral système inductible Racine dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Et de maïs

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

L'objectif général du système inductible de racines latérales est d'induire de façon synchrone l'initiation des racines latérales chez les plantes à l'aide de traitements hormonaux. Les racines des plantes sont dissimulées et sont reconnues comme extrêmement difficiles à étudier. Nous avons mis au point un système in vitro qui permet d'étudier le processus d'initiation des racines latérales au niveau cytologique, histologique et moléculaire.En général, les scientifiques novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés car les plantes n'ont pas établi un contact adéquat avec le milieu, empêchant ainsi une induction homogène des racines latérales. La démonstration visuelle de cette méthode permet de montrer les étapes critiques à prendre en compte pour assurer une induction homogène. Bien que ce système ait été initialement mis au point chez une petite plante, Arabidopsis, il peut également être appliqué à d'autres systèmes comme le maïs, le riz ou l'orge.Pour commencer, appliquez un tamis en nylon de 20 microns sur le milieu de croissance enrichi en NPA à l’aide d’une paire de pinces stériles. Poussez délicatement le tamis sur le milieu de croissance à l’aide d’un drigalski afin de vous assurer qu’il est bien en contact avec le milieu. Ensuite, pincez un cure-dent stérile dans l’agar pour créer une surface collante sur le cure-dent.Utilisez un cure-dent pour répartir uniformément un lot de graines stérilisées par gaz sur les boîtes préparées. Scellez les boîtes avec du ruban adhésif perméable et conservez-les à quatre degrés Celsius à l'obscurité pendant au moins deux jours et au maximum une semaine. Cette étape est nécessaire pour la stratification et assure une germination synchronisée et efficace.Le troisième jour, transférez les boîtes dans la chambre de croissance pour deux jours de germination, suivis de trois jours de croissance à un angle de 80 à 90 degrés. Au huitième jour, identifiez les racines qui ont poussé entièrement en contact avec la maille, et, au contraire, celles qui ne sont pas en contact avec la maille. Éliminez toutes les plantules dont les racines ne sont pas en contact avec la maille.Transférez les filets contenant les semis vers des boîtes complémentées avec 10 micromolaire de NAA. Une fois sur la boîte, lissez délicatement le filet sur la surface du milieu si nécessaire, afin de vous assurer qu’il est bien en contact avec le milieu de croissance. Pour garantir une induction homogène de tous les semis, il est important d’éliminer les semis qui n’ont pas poussé en contact avec le filet sur milieu supplémenté en NPA, et de bien lisser le filet si nécessaire sur milieu supplémenté en NAA.Sceller les nouvelles plaques avec du ruban perméable et les placer dans la chambre de croissance verticalement pendant la durée souhaitée après l'induction. Lorsque vous êtes prêts à collecter les échantillons, utilisez un scalpel pour couper les segments racinaires tous ensemble directement sur le treillis et prélevez-les en grattant doucement la surface du treillis. Nous allons maintenant montrer quelques étapes du système inductible de racines latérales chez le maïs.Commencez par stériliser les grains de maïs en plaçant d'abord le nombre nécessaire de grains dans un bécher en verre stérile. Ajoutez ensuite 100 millilitres d'hypochlorite de sodium à 6 % dans l'eau au bécher, ainsi qu'une barre d'agitation magnétique. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et agitez doucement pendant cinq minutes à température ambiante.Retirer délicatement la solution d'eau de Javel. La remplacer par 100 millilitres d'eau stérile fraîche et rincer les grains pendant cinq minutes. Répéter cette étape cinq fois.Mettez une paire de gants et déchirez deux morceaux de papier essuie-main, puis placez-les l’un sur l’autre sur une surface propre. Ensuite, pliez les feuilles en deux dans le sens de la longueur. À l’aide de pinces, répartissez 10 grains à environ deux centimètres du haut, sur toute la longueur du papier, en conservant une distance d’espacement de huit centimètres entre chaque grain et en laissant huit centimètres libres aux deux extrémités.Veillez à ce que le radicule du grain soit orienté vers le bas et vers le papier. Roulez délicatement le papier sur toute sa longueur tout en maintenant les graines en place. Pulvériser le papier avec de l'eau stérile peut faciliter cette étape si nécessaire.Placer les rouleaux dans des tubes en verre stérilisés et regrouper les tubes supplémentaires dans un porte-tubes. Verser 125 millilitres d'une solution de NPA à 50 micromolaire sur le rouleau de papier dans le tube. Le rouleau de papier absorbera la solution et sera complètement imbibé.Placer le système de rouleau de papier dans une enceinte de croissance pendant trois jours. Veiller à ce que les rouleaux de papier restent imbibés pendant l'incubation en ajoutant de la solution de NPA supplémentaire si nécessaire. Pour assurer une induction homogène de l'initiation des racines latérales, il est important de vérifier que les rouleaux de papier restent humidifiés dans la solution de NPA, mais que les racines ne soient pas submergées dans le liquide lui-même.Après trois jours sur le NPA, le plant de maïs présente une petite pousse et une racine d’environ deux à trois centimètres. Au quatrième jour, exprimez délicatement la majeure partie de la solution restante de NPA à partir des rouleaux de papier et placez les rouleaux dans de l’eau stérile jusqu’à ce qu’ils soient saturés. Après environ cinq minutes, exprimez délicatement la majeure partie de l’eau des rouleaux de papier.Répétez l'étape de lavage trois fois. Après le rinçage final, exprimez la majorité de l'eau et replacez le rouleau dans le tube. Versez une solution de 50 micromolaire de NAA sur les rouleaux de papier dans les tubes jusqu'à ce qu'ils soient complètement imbibés.Ensuite, placer le système de rouleau de papier dans l'armoire de croissance pendant la durée souhaitée après induction. Par rapport aux plantules de la lignée marqueuse de réponse aux auxines pDR5-GUS qui n'ont pas été cultivées sur NAA ou qui ont été cultivées pendant une heure sur NAA, les plantules cultivées pendant deux heures sur NAA présentent une réponse aux auxines, qui constitue l'un des premiers événements déclenchant l'initiation des racines latérales. Ces divisions commencent à progresser vers le haut à partir de l'extrémité, environ deux heures après le début du traitement, et augmentent avec une exposition prolongée au NAA.À l’aide de la lignée marqueuse du cycle cellulaire pCYCB1;1-Gus, les premières divisions cellulaires menant à la formation de racines latérales peuvent être observées à partir d’environ six heures après le début du traitement par l’acide 1-naphthalèneacétique (NAA). Des puces à ADN et une RT-PCR quantitative peuvent être utilisées pour évaluer l’expression de divers gènes dans les différentes régions des racines d’Arabidopsis et de maïs au cours de l’induction des racines latérales. Chez l’Arabidopsis comme chez le maïs, lorsque les plantes poussent pendant une période plus longue, les divisions induites conduisent au développement et à l’élongation des racines latérales.À titre de preuve de concept pour le système appliqué au maïs, voici des plantules cultivées dans différentes conditions, présentées à des fins de comparaison. Les plantules cultivées pendant 10 jours dans l'eau possèdent des racines latérales qui ne se sont pas initiées de manière synchrone et sont largement espacées le long de l'axe. Les plantules cultivées pendant 10 jours en présence de NPA ne présentent aucune racine latérale du tout.Les plantules cultivées pendant trois jours sur NPA, suivies d'un traitement à l'ANA, présentent une induction massive et synchronisée de racines latérales. Dans cette vidéo, nous vous avons montré comment mettre en place un système inductible de racines latérales qui s'est révélé essentiel pour la découverte d'insights fondamentaux sur le processus de ramification racinaire. Nous vous avons montré son fonctionnement chez Arabidopsis et le maïs, mais il peut facilement être adapté à d'autres espèces végétales au choix.Bonne chance.

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JoVE Journal

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Nous présentons la procédure pour assembler une literie de manteau essai de semences (ARA) de Arabidopsis thaliana graines. L'ARA s'est révélée être un outil puissant pour explorer génétiquement in vitro et la façon dont la germination des contrôles de l'endosperme de graines en dormance des graines et en réponse à des signaux lumineux. L'ARA est en principe applicable en vertu d'une situation où l'endosperme est soupçonné d'influencer la croissance embryonnaire.

Un tégument Literie dosage à explorer génétiquement<em&gt; In Vitro</em&gt; Comment la germination des contrôles endosperme des semences dans<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Un double interférence ARN brin (dsRNAi) technique est employée pour réguler à la baisse la coenzyme maïs cinnamoyl A réductase (ZmCCR1) gène à faible teneur en lignine des plantes. La lignine régulation à la baisse à partir de la paroi cellulaire est visualisée par des analyses microscopiques et quantifiée par la méthode Klason. Changements dans la composition de l'hémicellulose et la cellulose cristalline sont analysés.

Lignine régulation à la baisse de<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi et Klason lignine analyse

De nombreux gènes importants pour le développement ont des modèles d’expression spécifiques aux cellules ou aux tissus. Cet article décrit des expériences de séquençage de l’ARN LM pour identifier les gènes qui sont exprimés de manière différentielle à la limite limbe-gaine de la feuille de maïs et chez les mutants lg1-R par rapport aux mutants de type sauvage. Les considérations expérimentales discutées ici s’appliquent aux analyses transcriptomiques d’autres phénomènes de développement.

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La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

Ce protocole présente un résumé détaillé des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. Exemple pour les champignons Verticillium longisporum et Verticillium dahliae, trois systèmes d’infection racinaire différents sont décrits. Les applications potentielles et les analyses en aval possibles sont mises en évidence, et les avantages ou les inconvénients sont discutés pour chaque système.

Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol

Nous utilisons des outils de laboratoire simples pour examiner l’architecture du système racinaire (RSA) d’Arabidopsis et de Medicago. Les plantules sont cultivées en hydroponie sur des mailles et étalées à l’aide d’un pinceau d’art pour révéler le RSA. Les images sont prises à l’aide d’un balayage ou d’une caméra haute résolution, puis analysées avec ImageJ pour cartographier les traits.

Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal

Découvrez le système inductible de racines latérales pour étudier le développement racinaire chez Arabidopsis thaliana et le maïs. Cette méthode in vitro permet une induction synchrone et homogène grâce à des traitements hormonaux.

Lateral système inductible Racine dans

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