Modélisation des étapes précoces de cancer de l'ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

L’objectif global de cette expérience est de créer un modèle organotypique qui imite le microenvironnement péritonéal afin de mieux comprendre la biologie du cancer de l’ovaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de l’ovaire, telles que comment les interactions entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement contribuent à la pathogenèse de la maladie, et comment les inhibiteurs potentiels de ces interactions peuvent être testés. Le principal avantage de cette technique est que les cellules humaines primaires qui forment les surfaces de la ligne mésothélium de la cavité pérale sont utilisées dans la co-culture de cellules cancéreuses de l’ovaire.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du cancer de l’ovaire, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres cancers qui se propagent dans toute la cavité péritonéale, tels que les cancers de l’estomac, du pancréas et du côlon. Lors de l’acquisition d’un échantillon chirurgical d’épiploon humain, immergez immédiatement l’échantillon dans du PBS à température ambiante. Dans les deux heures suivant l’immersion, transférez l’épiploon dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS frais, transférez le lavage PBS restant contenant les cellules mésothéliales humaines primaires ou HPMC et les globules rouges dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et faites tourner les cellules.

Versez ensuite le contenu du tube dans une boîte de culture stérile de 10 centimètres et utilisez deux scalpels pour hacher le tissu en morceaux de cinq millimètres cubes. Pour isoler les cellules mésothéliales humaines primaires ou HPMC, transférez les morceaux d’épiploon dans un tube conique de 50 millilitres et attendez une minute. Pour que les morceaux solides flottent vers le haut, le HPMC se déposera au fond du tube avec les globules rouges.

À l’aide d’une pipette, transférez le lavage PBS contenant des cellules mésothéliales et des globules rouges dans le tube contenant les cellules granulées et faites tourner les cellules. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de PBS frais à l’épiploon et collectez le PBS contenant HPMC et RB C3 plus de fois, ce qui vient de démontrer aux cellules granulées d’origine. Après la dernière plaque de centrifugation, les cellules dans un ballon de 75 centimètres carrés dans 15 millilitres de milieu de croissance complet.

Pour isoler un HPMC supplémentaire de l’échantillon d’épiploon, agitez le tissu solide restant dans 20 millilitres de PBS à 200 tr/min et 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, laissez reposer l’échantillon pendant une minute pour permettre au tissu solide de remonter vers le haut du tube. Ensuite, récupérez le HPMC et le RBC au fond du tube, comme nous venons de le démontrer.

Maintenant, faites tourner les cellules de ce lavage secondaire et plaquez-les dans un flacon séparé de 75 centimètres carrés dans 15 millilitres de milieu de croissance complet. Pour isoler tout HPMC restant, agitez le tissu pendant encore 10 minutes, cette fois dans un mélange de PBS et de 10 millilitres de tripsin EDTA et placez ces HPMC et RBC dans un flacon de 75 centimètres carrés, puis incubez les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un environnement humidifié, en nourrissant les cellules plaquées avec 15 millilitres de produits frais, milieu de croissance complet les troisième et cinquième jours sans retirer le milieu épuisé. Les HPMC peuvent être identifiés par leur forme cuboïde et leur expression de cytokératine huit et menton.

Pour isoler les fibroblastes normaux de l’épiploon, traitez le tissu de l’épiploon haché restant avec 10 millilitres de solution de 10 x collagénase de type trois fraîchement préparée diluée dans un milieu exempt de sérum pendant six heures en agitant à la fin de la période d’incubation, le tissu digéré sera devenu opaque avec la solution contenant des débris fibreux, centrifugez la suspension normale de fibroblastes de l’épiploon, et puis la culture. Les cellules dans 13 millilitres de milieu de croissance complet. Après 24 heures, remplacez l’ancien milieu par 15 millilitres de milieu de croissance frais.

Les fibroblastes de l’épiploon normaux peuvent être identifiés par leur forme allongée et plate, leur expression de vimentine et leur absence d’expression d’aide à la cytokératine. Pour libérer les fibroblastes normaux de l’épiploon de la culture, rincez le ballon de culture avec 10 millilitres de PBS, suivis de trois millilitres de trypsine pendant pas plus de cinq minutes. Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la trypsine avec au moins trois fois le volume du milieu de croissance complet et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres.

Faites tourner les cellules et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu de croissance complet. Ensuite, comptez les cellules et diluez-les à deux à quatre fois 10 à 10 à la troisième fibroblaste pour 100 microlitres de croissance complète, concentration moyenne. Ensuite, ajoutez 0,5 microgramme par 100 microlitres de collagène de queue de rat, un aux cellules et plaquez 100 microlitres de cellules par puits dans une plaque noire à fond transparent de 96 puits.

Transférez ensuite la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant au moins quatre heures ou jusqu’à ce que les cellules adhèrent à la surface de la plaque, pendant que les fibroblastes à élan normal se déposent. Détachez le HPMC de ses flacons de culture et diluez ces cellules à une à deux fois 10 à 10 à quatre HPMC par 50 microlitres de milieu de croissance complet. Ajoutez ensuite 50 microlitres de HPMC par puits aux fibroblastes normaux de l’épiploon attachés et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins 18 heures avant l’expérience.

Utilisez la graine du lendemain, les co-cultures 3D ORGANOTYPIQUES avec GFP exprimant des cellules cancéreuses de l’ovaire à partir d’une culture confluente de 80 à 90 % à la dilution appropriée pour le test en aval souhaité, le peptide RGD et des anticorps bloquants contre l’alpha cinq, le bêta un et l’alpha cinq. Bêta trois. Les intégrines inhibent l’adhésion des cellules cancéreuses de l’ovaire à la culture organotypique, contrairement au peptide RAD et aux anticorps anti-intégrine bêta-quatre.

Le peptide RRG D et les anticorps bloquants contre l’intégrine alpha cinq et bêta un inhibent également la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire sur la culture organotypique, contrairement au peptide RAD et aux anticorps anti-intégrine alpha cinq, bêta trois et bêta quatre. De plus, le peptide RGD et les anticorps bloquants contre l’intégrine alpha cinq et bêta un inhibent l’invasion de la culture 3D ORGANOTYPIQUE des cellules cancéreuses de l’ovaire. Alors que l’anticorps alpha-5-bêta-intégrine trois améliore ce processus, comme prévu d’après les données des tests d’adhérence et de prolifération, les anticorps anti-pentapage et anti-intégrine bêta-quatre n’ont pas non plus montré d’effet sur l’invasion des cellules cancéreuses.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en sept à 12 heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de toujours utiliser une enceinte de sécurité biologique et l’équipement de protection approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants après cette procédure. D’autres méthodes telles que les tests d’adhésion, d’invasion et de prolifération peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les interactions des cellules cancéreuses avec le microenvironnement après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer de l’ovaire pour explorer comment le microenvironnement influence les interactions des cellules cancéreuses avec les cellules de la cavité péritonéale humaine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules primaires de l’élan humain et de construire une culture organotypique de la muqueuse pérale.