Name: Modélisation des étapes précoces de cancer de lovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Découvrez comment construire un modèle organotypique 3D de la cavité péritonéale humaine utilisant des cellules mésothéliales et des fibroblastes primaires. Cette méthode permet d'étudier l'adhésion, l'invasion et la prolifération des cellules cancéreuses ovariennes.

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Nous remercions tous les résidents et les médecins traitants, notamment le Dr A.F. Haney (Université de Chicago, Département d’obstétrique et de gynécologie) pour la collecte des biopsies omentales. Nous remercions également Stacey Tobin et Gail Isenberg d’avoir soigneusement révisé ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par Bears Care, le bénéficiaire caritatif du Chicago Bears Football Club, le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, et la subvention R01 du National Cancer Institute CA111882 à E.L.

Tous les protocoles de recherche décrits ont été examinés par l&#39;Université de Chicago Institutional Review Board (IRB). Le consentement éclairé a été obtenu à partir de chaque patient avant la chirurgie et l&#39;étude a été approuvé par l&#39;Université de Chicago CISR. Une sécurité biologique type armoire 2 et des gants devraient être utilisés lors de la manipulation des tissus humains pour la protection et de réduire le risque de contamination des cellules. 1. Isolement et culture de cellules stromales primaires non transformés <ol><li> Collection de tissus humains et de préparation. <ol><li> Obtenir des échantillons de omentum humain, 2 cm 3, enlevé au cours d&#39;une intervention chirurgicale abdominale, et immerger le tissu immédiatement en RT-solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (figure 2A). Un morceau de épiploon 3 cm x 2 cm donne généralement 1 million de cellules primaires humaines mésothéliales (HPMC) et 200.000 fibroblastes humains primaires ou des fibroblastes normaux omentales (NOF). </li><li> Isoler la PBS le tissu a été immergé dans de 0,5 g pendant 3min dès que possible après la collecte (&lt;2 h dans du PBS) et transférer le tissu à frais 20 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml. Coupez le tissu en 5mm 3 pièces en hachant avec scalpels dans un diamètre de 15 cm, boîte de culture stérile (figure 2B). </li></ol></li><li> Isolement de cellules mésothéliales humaines primaires 8 <ol><li> Pour isoler HPMC, transférer le tissu haché dans 50 ml tubes coniques et attendre 1 min pour les morceaux solides de flotter vers le haut (figure 2C &amp; D). HPMC et les globules rouges (RBC) sont présents dans le liquide sur le fond. Utiliser une pipette pour éliminer le liquide de la partie inférieure du tube et dans un nouveau tube conique. Spin le liquide vers le bas à 0,5 g pendant 3 min et aspirer le surnageant du culot HPMC / RBC. <ol><li> Répétez le processus à trois reprises: ajouter 20 ml de PBS au tissu hachée, laisser le tissu se lever, enlever le liquide du fond avec une pipette et dans le tube HPMC / RBC, spin-down, et retirer lesurnageant. Après que tous les tours sont terminés et le surnageant est aspiré, le culot contiendra HPMC et RBC. </li></ol></li><li> Plaque de toutes les cellules de la pastille dans un 2 flacon de 75 cm dans 15 ml de milieu de croissance complet (DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal [FBS], 1% de vitamines MEM [93 mg / L], 1% MEM acides aminés non essentiels [81,4 mg / L], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine]). </li><li> Effectuer un lavage PBS secondaire pour isoler HPMC supplémentaires. <ol><li> Pour le secondaire PBS laver, secouez le tissu solide restant à 200 rpm, 37 ° C pendant 10 min dans 20 ml de PBS, puis attendre 1 min pour que le tissu flottent à la surface. Retirer le liquide depuis le fond du tube dans un nouveau tube, centrifuger à 0,5 g pendant 3 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Plate toute la HPMC / RBC de la PBS secondaire laver dans un 75 cm 2 ballon séparé dans 15 ml de milieu de croissance. </li></ol></li><li> Pour isoler toute remaining HPMC, secouez le tissu haché à 200 rpm, 37 ° degrés C pendant 10 min dans 20 ml d&#39;un 1: 1 0,25% mM EDTA trypsine 25: solution de PBS en volume. Laisser le tissu à la hausse, de recueillir le liquide au fond du tube dans un nouveau tube de 50 ml, tourner vers le bas et à 0,5 gx 3 min. <ol><li> Aspirer le surnageant et de la plaque toute la HPMC / RBC dans un 75 cm 2 ballon séparé dans 15 ml de milieu de croissance. </li></ol></li><li> Culture des cellules étalées à 37 ° C et 5% de CO2 dans un environnement humidifié. Flux cellules étalées en ajoutant 15 ml de milieu de croissance complète les jours 3 et 5 sans enlever les médias dépensé. HPMC peut être cultivé pendant 5-7 jours avant de se séparer. <ol><li> Utilisez faible passage HPMC (jusqu&#39;à passage 2) dans toutes les expériences de minimiser dédifférenciation et la modification du phénotype d&#39;origine. Utiliser un microscope à champ large de préférence avec un objectif 20x avec différentiel plastique capacités de contraste d&#39;interférence ou objectif 4-20x avec contraste de phase capabilities (filtres de phase de contraste sur microscope) pour prendre toutes les images de cellules, et un objectif 10x () dans le champ lumineux d&#39;analyser immunohistochimique 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) coloration. </li></ol></li><li> Vérifiez que le HPMC sont cubiques et expriment la cytokératine 8 et vimentine en effectuant immunohistochimie 8 (figure 3A, C, E). </li></ol></li><li> NOF isolement 8 <ol><li> Préparer 10 ml d&#39;un stock de III solution de type collagénase (10x) en combinant un mélange 1: 1 de 100x Pen-Strep: 1 1.500 unités activité / ml de collagénase de type III: activité 714 unités / ml de hyaluronidase dans du PBS. </li><li> Agiter le tissu haché épiploon qui reste après HPMC isolement à 200 rpm, 37 ° C pendant 6 heures dans 10 ml de la III solution de type 10x collagénase dilué dans un milieu sans sérum (DMEM avec 1% MEM vitamines [93 mg / l], 1% MEM acides aminés non essentiels [81,4 mg / L], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine]). Tissu digéré examinera opaque et peut avoir quelques débris fibreux (figure 2E). </li><li> Centrifuger les cellules NOF de solution contenant en suspension à 0,5 x g pendant 3 minutes à température ambiante, aspirer le surnageant et le culot de plaque dans une fiole 75 de 2 cm dans 13 ml de milieu de croissance complet. </li><li> Retirer les anciens médias et les remplacer par 15 ml de milieu de croissance complet frais après 24 h. NOF peut être cultivé pendant 1-3 jours avant de se séparer. Remarque prolifération de la NOF cessera lorsque les cellules atteignent la confluence. </li><li> Vérifiez que les fibroblastes humains primaires sont des cellules plates, allongées et expriment la vimentine mais ne cytokératine 8 en effectuant immunohistochimie 8 (figure 3B, D, F). Utilisez faible passage NOF pour les expériences (idéalement avant le passage 3) pour minimiser dédifférenciation et la modification du phénotype d&#39;origine. Utiliser un microscope à champ large avec un objectif 20x avec des capacités DIC en plastique de prendre toutes les images de phase de cellules,et un objectif 10x dans le champ lumineux d&#39;analyser coloration immunohistochimique de DAB. </li></ol></li></ol> 2. Placage la Culture organotypique 8 <ol><li> NOF de sortie du flacon de culture de 75 cm par rinçage avec 10 ml de PBS suivis par 3 ml de trypsine à 0,25% / EDTA 25 mM à pas plus de 5 min. Neutraliser la trypsine avec au moins 3 fois le volume de milieu de croissance complet. </li><li> Transfert cellules trypsinisées dans un tube conique de 50 ml et centrifuger à 0,5 gx 3 min. Retirer le surnageant et amener les cellules de retour dans 5 ml de milieu de croissance. Utiliser un compteur de cellules pour compter les cellules récupérées à partir du flacon de culture. </li><li> Diluer cellules dans le volume approprié de milieu de croissance complet à l&#39;assiette 2,000-4,000 NOF par 100 pi sur une plaque noire, fond transparent, 96 puits. Ajouter 0,5 ug / 100 ul de collagène de queue de rat I du mélange de cellules avant l&#39;étalement. Cellules laisser reposer à 37 ° C dans 5% de CO 2 dans un environnement humide pendant au moins 4 heures, ou jusqu&#39;à ce que les cellulesà adhérer à la surface de la plaque. </li><li> HPMC de sortie du flacon de culture en utilisant les mêmes procédés décrits dans les étapes 2.1 et 2.2. Diluer les cellules de la quantité appropriée de milieu de croissance complet à l&#39;assiette 10.000-20.000 HPMC par 50 pi au-dessus du NOF déjà plaqué avec du collagène I dans des plaques à 96 puits. Laissez les cellules sont assis à 37 ° C dans 5% de CO 2 dans un environnement humide pendant au moins 18 heures avant le début des expériences. </li><li> Culture protéine verte fluorescente (GFP) exprimant les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire HeyA8 dans les médias de croissance. Les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire HeyA8 sont marquées par fluorescence par l&#39;expression d&#39;un vecteur lentiviral exprimant copépode CGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire HeyA8 devrait être de 80 à 90% de confluence le jour de l&#39;utilisation (en phase de croissance logarithmique). Libérer les cellules de la plaque de la culture et de compter en utilisant les mêmes méthodes décrites dans les étapes 2.1-2.2 pour des cellules primaires. </li><li> Laisser les cellules cancéreuses d&#39;ovaire de récupérer dans un milieu de croissance complet pendant 15-20 min à 37 ° C dans untube conique avec le couvercle lâche scellé. </li></ol> 3. Essai d&#39;adhésion 8 <ol><li> Après la récupération, sédimenter les cellules de cancer de l&#39;ovaire en faisant tourner pendant 3 min à 0,5 XG, puis éliminer le surnageant et diluer les cellules dans le volume approprié de milieu sans sérum pour obtenir une concentration de 50.000 cellules / 100 pi. </li><li> Inverser les plaques à 96 puits avec les cultures organotypiques / NOF HPMC pour enlever milieu usé, et ajouter 100 pi de la suspension de cellules de cancer en milieu sans sérum à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans 5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 30 min pour 4 heures. </li><li> Inversez la plaque de 96 puits pour enlever les médias et les cellules non-adhérentes. Utilisez une pipette multicanaux à faible puissance à pipette soigneusement et doucement 100 pi de PBS dans chaque puits, et inverser à nouveau la plaque. Répétez la PBS laver une fois de plus. </li><li> Inversez pour enlever PBS et ajouter 100 ul paraformaldéhyde 4% à chaque puits. Laisser la plaque reposer pendant 20 min pour fixer les cellules. Après 20 minutes, retourner la plaque et ajouter 100 ul de PBS. </li><li> Notez que la fluorescence totale de puits peut être rapporté ou le nombre de cellules peut être quantifiée. Pour la quantification, première plaque une courbe standard en double exemplaire, en utilisant des cellules HeyA8 à une concentration de 1 millions de cellules / ml. <ol><li> Faire de la courbe standard par filage soit 1 million de cellules, de retirer le média, et en leur permettant de siéger dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% pendant 20 min. </li><li> Cellules Spin ramènerai et dans 1 ml de PBS (cellules de recomptage confirment 1 million / ml de concentration). Plate 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, et 0 cellules dans chaque puits en double, et d&#39;ajouter PBS pour un volume total final de 50 ul dans chaque puits. </li></ol></li><li> Bottom lire la plaque de culture sur un lecteur de plaque fluorescente (excitation = 488 nm, émission = 528 nm), mise à l&#39;échelle haute puits (50.000 sur la courbe standard). Utilisez la courbe standard pour calculer le nombre de cellules de cancer de l&#39;ovaire ont adhéré à la organotypic culture dans chaque puits (figure 4A-C). </li></ol> 4. Essai de prolifération 10 <ol><li> Après que les cellules de cancer de l&#39;ovaire récupérer (voir les étapes 2.5 et 2.6 ci-dessus), d&#39;une pastille les cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 0,5 x g et ensuite dilué les cellules dans le volume approprié de 1% de FBS médias (DMEM avec 1% de FBS, 1% de MEM vitamines [93 mg / L], 1% MEM non essentiels acides aminés [81,4 mg / l], 1% de pénicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine]) pour obtenir une concentration de 4000 cellules / 150 ul. </li><li> Inversez la plaque de 96 puits avec les HPMC / cultures organotypiques NOF pour enlever milieu usé, et ajouter 150 pi de la suspension de cellules de cancer de 1% de FBS à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans 5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 72 heures. </li><li> Bottom lire la plaque de culture sur un lecteur de plaque fluorescente une fois par jour (excitation = 488 nm, émission = 528 nm) pour évaluer la prolifération rapportdes cellules. Continuer l&#39;essai pendant 96 heures, en changeant les médias à 48 h (figure 5A-C). Soyez prudent de ne pas perturber la culture lors du changement de média (inversant la plaque est préférable). </li></ol> 5. Invasion Assay 8 <ol><li> Avant la culture 3D de placage, ajouter 7,5 ug de collagène de queue de rat I dans 200 ul de PBS dans une plaque de culture de 24 insert de puits (8 um de taille de pore). Laissez la plaque d&#39;incubation O / N, puis retirez soigneusement la PBS avec une pipette immédiatement avant l&#39;ensemencement de la culture organotypique HPMC / NOF sur les inserts revêtus de collagène (étape 2, ci-dessus). </li><li> Préparer les cellules de cancer ovarien comme à l&#39;étape 3.1. Pour plaquer les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire sur les cultures organotypiques sur les inserts, utiliser avec précaution une pipette pour enlever l&#39;excès des médias à partir du haut des inserts. Ajouter 100 ul de la suspension de cellules de cancer ovarien dans du milieu sans sérum à chaque puits. </li><li> Ajouter 750 ul de milieu de pleine croissance dans le bien en dessous de l&#39;insert pour induire des cellules cancéreuses dansinvasion dans les cultures organotypiques. Incuber la plaque à 37 ° C dans 5% de CO2 dans un environnement humidifié pendant 24 heures. Nota: Les cellules de cancer ovarien qui envahissent la culture organotypique traversera l&#39;insert et rester sur le côté inférieur de l&#39;insert. </li><li> Après 24 h, saisir l&#39;insert avec des pinces et brièvement rincer dans un bécher de PBS, puis déplacer l&#39;insert dans un puits vide. Frotter la partie supérieure de chaque insert avec deux côtés d&#39;un coton-tige pour un total de 1 min. Placer rapidement l&#39;insert dans une plaque contenant 750 pi 4% de paraformaldehyde dans chaque puits. Permettre à chaque insert de siéger dans paraformaldéhyde pendant 10 minutes avant de transférer les inserts dans les puits remplis de 750 pi de PBS. </li><li> Afficher les cellules envahies (collées et fixées sur le fond du inserts) avec un microscope à grossissement 2,5x. Lorsque l&#39;ensemble du bien est dans le champ de vision, ajuster l&#39;agrandissement de 10x et de prendre 5 photos, l&#39;un près du centre et 1 dans chaque quadrant du puits, en évitantprendre des images qui sont trop près des bords. Suivez la même pour chaque puits. </li><li> Utilisez le programme du fabricant à compter le nombre de cellules dans chaque image pour obtenir un nombre moyen de cellules envahies par champ dans chaque puits (figure 6A-C) en fonction de leur protocole. </li></ol>

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<li>Kishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+pattern+of+peritoneal+involvement+shown+by+in+vitro+and+in+vivo+ovarian+cancer+dissemination+models%5BTitle%5D)+AND+%22Invas.+Metast%22%5BJournal%5D)">Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models.</a> Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).</li>
<li>Casey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+assay+to+measure+the+invasion+of+ovarian+carcinoma+cells+through+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix.</a> Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+modeling+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional modeling of ovarian cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high+throughput+screening+using+a+primary+human+three-dimensional+organotypic+culture+predicts+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy.</a> Nature Comm. , (2015).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+is+a+prognostic+factor+in+ovarian+cancer+and+an+effective+target+for+inhibition+of+peritoneal+dissemination+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion.</a> Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).</li>
<li>Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-2+functions+as+an+early+response+protein+in+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis.</a> Cell cycle. 8, 683-688 (2009).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+ovarian+cancer+metastasis+via+alpha+5-integrin%2C+which+is+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target.</a> Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-independent+activation+of+c-Met+by+fibronectin+and+%CE%B1%285%29%CE%B2%281%29-integrin+regulates+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis.</a> Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un modèle organotypique du microenvironnement péritonéale a été créé pour évaluer la fonction (s) individuelle et collective à la fois des composants cellulaires et innées du microenvironnement dans la diffusion de cancer de l&#39;ovaire. Les protocoles spécifiques pour le placage et la personnalisation de la culture organotypique 3D pour étudier l&#39;ovaire adhérence des cellules cancéreuses, la prolifération et l&#39;invasion sont fournis. Cellules humaines omentales mésothéliales et des fibroblastes primaires ont ét...

Le cancer de l’ovaire est la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle1. La majorité des patients sont diagnostiqués après que le cancer se soit disséminé dans toute la cavité péritonéale. Une fois que le cancer s’est propagé dans toute la cavité péritonéale, la chirurgie cytoréductrice et la chimiothérapie ne sont souvent pas un traitement suffisant pour prévenir la récidive du cancer et la chimiorésistance, ce qui entraîne un taux de survie à 5 ans inférieur à 30 %. Les métastases du cancer de l’ovaire sont principalement limitées à la cavité péritonéale, et plusieurs autres types de cancer, y compris les cancers gastriques, pancréatiques et du côlon, métastasent aux mêmes sites anatomiques dans la cavité péritonéale. En général, les cellules cancéreuses de l’ovaire se détachent du carcinome in situ dans la trompe de Fallope ou la tumeur ovarienne primitive, se déplacent dans le liquide péritonéal sous forme de cellules uniques ou de sphéroïdes et se fixent aux surfaces tapissées de mésothélium de l’épiploon, de l’intestin et de la paroi abdominale2. 
Le microenvironnement tumoral joue un rôle important dans la progression de la maladie et la chimiorésistance dans de nombreux cancers3-6. La cavité péritonéale est un microenvironnement unique, avec une monocouche de cellules mésothéliales couvrant la majorité des surfaces (Figure 1A)7. La muqueuse mésothéliale agit comme une barrière qui crée une surface à faible frottement, qui a tendance à protéger contre l’adhésion des cellules cancéreuses8. Immédiatement sous cette surface tapissée de mésothéliale se trouve une couche composée principalement de fibroblastes et de matrice extracellulaire (MEC), qui favorisent l’adhésion et l’invasion des cellules cancéreuses8. Les cellules cancéreuses de l’ovaire sécrètent des facteurs qui induisent des changements dans la muqueuse cellulaire mésothéliale qui améliorent l’adhésion, l’invasion et les métastases des cellules cancéreuses de l’ovaire9,10. Les cellules cancéreuses de l’ovaire adhèrent à la surface mésothéliale par l’intermédiaire de mécanismes médiés par l’intégrine et le CD44 (Figure 1B)11-16. 
Historiquement, plusieurs modèles 3D ont été développés pour étudier les interactions du cancer de l’ovaire avec le microenvironnement. Certains des premiers modèles ont étudié l’interface cancer de l’ovaire-ECM17-21, la communication cancer-cellules mésothéliales13, 14, 21-24, ou les deux25 (examiné par nous 26). Niedbala et al. découvert que les cellules cancéreuses de l’ovaire présentent une adhérence plus rapide et plus ferme à la MEC qu’aux cellules mésothéliales ou au plastique seul25. Cependant, ces modèles ne ressemblaient pas histologiquement au microenvironnement péritonéal. Par conséquent, nous avons établi un modèle organotypique 3D pour reproduire plus précisément le microenvironnement du cancer de l’ovaire. Afin de mieux comprendre le rôle du microenvironnement et l’interaction entre le cancer et les cellules péritonéales dans la dissémination péritonéale du cancer de l’ovaire, nous avons développé un modèle de culture organotypique in vitro 3D de la muqueuse de la cavité péritonéale (schéma de la Figure 1C). Le modèle proposé est composé de fibroblastes humains primaires et d’ECM, recouverts d’une couche de cellules mésothéliales humaines primaires - chaque type de cellule est isolé de l’épiploon humain. Histologiquement, ce modèle ressemble à la muqueuse péritonéale ou omentale normale, et fournit une surface sur laquelle nous pouvons étudier le microenvironnement tumoral, l’interaction entre les cellules cancéreuses et les tissus normaux, et les processus d’adhésion, d’invasion et de prolifération des cellules cancéreuses8.

<table><tbody><tr><td><fort>1. Isolement et culture de cellules primaires</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001304</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir à simple tranchant</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture de 15 cm</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Flacon en verre</td><td> ?</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000044_3616914956</td><td></td></tr><tr><td>DMEM avec L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamines</td><td>Corning</td><td>25-020-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Acides aminés non essentiels</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Shaker&nbsp ;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Incubateur Thermo-Fisher</td><td>Forma Series II Incubateur CO2 à enveloppe d’eau Modèle 3100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA, 1x (0,25 %)</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Flasks</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>353136</tr><tr><td>Fioles T-175</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>P2, P10, P20, P200 et P1000</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>Corning</td><td>Pointes filtrées P2, P10, P20, P200 et P1000</td><td></td></tr><tr><td>Nom du réactif/ de l’équipement</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>2. Placage Compteur de cellules 3D </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>Countess Countess</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage de cellules</td><td>Invitrogen</td><td>C10313</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type I (queue de rat)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>96 plaque de puits, fond transparent, noir</td><td>BD Biosciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Nom du réactif/de l’équipement</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>3. Dosage d’adhérence </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>Xplorer 300</td><td></td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde 4 % dans PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Molecular Devices</td><td>Minimax</td><td></td></tr><tr><td>Nom du réactif/ Équipement</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments/Description</strong</td></tr><tr><td>>5. Essai d’invasion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Inserts (8um, 24 puits)</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>cotons-tiges</td><td>cotons-tiges cotons-tiges</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200m</td><td></td></tr><tr><td>Cell Profiler</td><td>domaine</td><td></td><td></td>public</tr><tr><td>24 puits</td><td>plaque BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Nom du réactif/de l’équipement</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments/Description</td></tr><tr><td>6. Anticorps </forts></td>Anti-intégrine &alpha <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>; V&bêta ; 3 Anticorps, clone LM609</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1976</td><td></td></tr><tr><td>Beta 1&nbsp ;</td><td>Oncosynergy</td><td>OS2966</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 5 [CD49e]</td><td>ID Pharmingen</td><td>555615</td><td></td></tr><tr><td>Beta 4 [CD104]</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB 2058</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation des étapes précoces de cancer de l&#39;ovaire diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

Le schéma des métastases du cancer de l’ovaire est nettement différent de celui de la plupart des autres tumeurs épithéliales, car il se propage rarement par hématogène. Au lieu de cela, les cellules cancéreuses de l’ovaire exfoliées de la tumeur primaire sont transportées par le liquide péritonéal vers des sites métastatiques dans la cavité péritonéale. Ces sites, plus particulièrement le péritoine abdominal et l’épiploon, sont des organes recouverts d’une surface tapissée de mésothélium. Pour étudier les processus de dissémination du cancer de l’ovaire, nous avons assemblé un système de culture tridimensionnel complexe qui reconstruit la muqueuse de la cavité péritonéale in vitro. Des fibroblastes humains primaires et des cellules mésothéliales ont été isolés de l’épiploon humain. Les fibroblastes ont ensuite été mélangés à de la matrice extracellulaire et recouverts d’une couche de cellules mésothéliales humaines primaires pour imiter les surfaces péritonéales et omentales rencontrées par les cellules cancéreuses de l’ovaire métastasées. Le modèle organotypique qui en résulte est, comme on le voit, utilisé pour examiner les premières étapes de la dissémination du cancer de l’ovaire, y compris l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses. Ce modèle a été utilisé dans un certain nombre d’études pour étudier le rôle du microenvironnement (cellulaire et acellulaire) dans la dissémination précoce du cancer de l’ovaire. Il a également été adapté avec succès au dépistage à haut débit et utilisé pour identifier et tester les inhibiteurs des métastases du cancer de l’ovaire.

La culture organotypique a été assemblé en mélangeant d&#39;abord des fibroblastes humains primaires avec collagène de type I et recouvrant cette culture avec 5 fois le nombre de cellules mésothéliales. La culture a été incubée pendant au moins 18 heures avant que les cellules cancéreuses de l&#39;ovaire ont été ajoutés pour étudier l&#39;adhérence, l&#39;invasion ou la prolifération. Chaque essai a été répété avec de multiples (n = 3-5) cultures 3D obtenues à partir de différents patients et de nombreux puits ont été t...

Ici, nous présentons un protocole pour construire un modèle in vitro tridimensionnel de la muqueuse de la cavité péritonéale, composé de cellules mésothéliales humaines primaires et de fibroblastes superposés avec une matrice extracellulaire, comme outil pour étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des étapes précoces de cancer de l&#39;ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Le but général de cette expérience est de créer un modèle organotypique qui imite le microenvironnement péritonéal afin d'améliorer notre compréhension de la biologie du cancer de l'ovaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de l'ovaire, telles que la manière dont les interactions entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement contribuent à la pathogenèse de la maladie, et comment des inhibiteurs potentiels de ces interactions peuvent être testés. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de cellules humaines primaires réelles qui forment l'épithélium mésothélial tapissant les surfaces de la cavité péritonéale, dans la co-culture avec les cellules cancéreuses de l'ovaire.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le cancer de l'ovaire, elle peut également être appliquée à l'étude d'autres cancers qui se disséminent dans la cavité péritonéale, tels que les cancers gastriques, pancréatiques et du côlon. Dès l'obtention d'un échantillon chirurgical humain d'omentum, immerger immédiatement l'échantillon dans du PBS à température ambiante. Dans les deux heures suivant l'immersion, transfére

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Le dosage jeu mésothéliales décrite ici prend avantage des cellules marquées par fluorescence et la microscopie vidéo time-lapse de visualiser et de mesurer quantitativement les interactions de sphéroïdes multicellulaires cancer de l'ovaire et les monocouches de cellules mésothéliales. Ce test modélise les étapes précoces de métastases du cancer de l'ovaire.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

Hétérotypique tridimensionnelle<em&gt; In Vitro</em&gt; Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l&#39;initiation et la progression du cancer des ovaires

Dans cette vidéo, nous montrons le développement d’un modèle tridimensionnel in vitro de la muqueuse de la cavité péritonéale. Cette culture organotypique peut aider à étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des métastases du cancer de l’ovaire dans la muqueuse de la cavité péritonéale : une méthode pour établir un modèle 3D in vitro de la muqueuse péritonéale

Dans cette vidéo, nous établissons une culture d’organe omental ex vivo superposée à des cellules cancéreuses de l’ovaire exprimant la GFP pour étudier la colonisation du cancer de l’ovaire au sein de l’explant omental. Ce protocole analyse les structures cellulaires immunitaires de l’épiploon appelées taches laiteuses qui favorisent les métastases.

Modélisation de la colonisation de l’épiploon par des cellules cancéreuses de l’ovaire : une méthode ex vivo pour établir la colonisation par tache laiteuse de cellules cancéreuses de l’ovaire marquées par fluorescence dans des explants d’épiploon murin

L'invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.

Évaluation de Cancer de l&#39;ovaire Spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

Nous décrivons un protocole qui met en œuvre des approches in vivo et ex vivo pour étudier la colonisation par le cancer de l’ovaire des tissus adipeux péritonéaux, en particulier de l’épiploon. De plus, nous présentons un protocole pour quantifier et analyser les structures cellulaires immunitaires de l’épiploon connues sous le nom de taches laiteuses, qui favorisent les métastases du tissu adipeux péritonéal.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

Afin de clarifier le processus en plusieurs étapes de la dissémination peritoneale d'un carcinome de l'ovaire, l'étude actuelle présente un modèle expérimental murin du développement de la tumeur d'origine et métastases péritonéales par inoculation orthotopique avec ces cellules tumorales.

Murin modèle expérimental de tumeur de développement original et péritonéale Métastase<em&gt; via</em&gt; Orthotopique Inoculation avec des cellules de l&#39;ovaire Carcinome

Pour étudier la progression de la tumeur ovarienne dans un modèle physiologiquement pertinente, sphéroïdes multicellulaires ont été cultivées dans un microdispositif dans l'écoulement de fluide simulé. Ce modèle 3D dynamique émule l'environnement intrapéritonéale avec les composants cellulaires et mécaniques où les métastases du cancer de l'ovaire se produit.

Modélisation Comportement cancer de l&#39;ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale

Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle tridimensionnel (3D) ex vivo de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. Le modèle fournit une plate-forme pour élucider les mécanismes pro-tumoraux dans la niche adipeuse et pour tester de nouvelles thérapies.

Un modèle ex vivo de métastases péritonéales du cancer de l’ovaire à l’aide d’un épiploon humain

Ce protocole détaille le développement de modèles murins de carcinome séreux de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC) in vitro et in vivo. De la dérivation d’organoïdes murins de trompes de Fallope, leur modification génétique pour récapituler la génétique HGSOC humaine, et leur introduction dans la bourse ovarienne de souris syngéniques pour le développement in vivo de tumeurs.

Développement de lignées organoïdes dérivées de souris à partir de cellules épithéliales de trompes de Fallope pour la modélisation du carcinome de l’ovaire séreux de haut grade

Découvrez comment construire un modèle organotypique 3D de la cavité péritonéale humaine utilisant des cellules mésothéliales et des fibroblastes primaires. Cette méthode permet d'étudier l'adhésion, l'invasion et la prolifération des cellules cancéreuses ovariennes.

Modélisation des étapes précoces de cancer de l'ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

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