Dissolution Polarisation Dynamique Nucléaire Instrumentation pour en temps réel la vitesse de réaction enzymatique mesures par RMN

L’objectif global de cette expérience est de suivre les processus enzymatiques en temps réel par polarisation nucléaire dynamique et résonance magnétique nucléaire. La résonance magnétique à l’état liquide renforcée par la polarisation nucléaire dynamique, DNP, peut aider à répondre à des questions clés : comment déterminer, par exemple, les taux de transformation enzymatique d’une paire de molécules dans une cellule ou in vivo sans avoir à modifier cette paire de molécules de quelque manière que ce soit. L’installation de notre équipement de dissolution DNP dans notre laboratoire et l’arrivée ici du Dr.Riccardo Balzan, docteur au Laboratoire Arnaud Comment à Lausanne, est un grand pas en avant pour nos recherches.

Le DNP augmente considérablement la sensibilité des expériences que nous pouvons réaliser sur nos spectromètres RMN de 500 mégahertz. Cet équipement DNP a été le premier à être installé en France et je tiens à mentionner que, pour rendre cet équipement fonctionnel, tous les membres de notre équipe RMN ont été impliqués et je citerais en particulier Gildas Bertho, notre ingénieur de recherche, et Fatiha Kateb, notre maître de conférences. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification directe et en temps réel du substrat et de ses dérivés endogènes avec une résolution temporelle de quelques secondes.

Pour la solution polarisante, préparez deux millilitres d’une solution de pyruvate de sodium de 1,12 molaire, marquée au carbone 13, dopée avec 33 millimolaires de radical TEMPO dans un volume deux pour un d’eau deutérée à de l’éthanol deutéré pour les observations au carbone 13. Abaissez la température du cryostat à polarisation nucléaire dynamique, ou DNP, grâce à la procédure de refroidissement en cliquant sur le bouton de refroidissement de l’interface logicielle du cryostat. Collectez l’hélium liquide dans le cryostat DNP grâce à la procédure de remplissage.

Cliquez sur le bouton de remplissage sur l’interface du logiciel du cryostat. Placez ensuite 300 microlitres de la solution polarisante optimisée dans le récipient d’échantillon fourni avec le polariseur DNP. Congelez le récipient d’échantillon avec l’échantillon à l’intérieur en l’immergeant doucement dans un bain d’azote liquide.

Éliminez l’azote liquide qui peut être présent dans le récipient d’échantillon après la procédure de congélation en extrayant le récipient d’échantillon du bain d’azote liquide et en le tournant à l’envers. Ensuite, insérez l’échantillon dans le cryostat en insérant d’abord le récipient d’échantillon dans le porte-échantillon. Placez ensuite le porte-échantillon dans l’insert principal du cryostat avant d’insérer le guide d’ondes du micro-ondes dans le porte-échantillon.

Abaissez la température du cryostat en démarrant la procédure de refroidissement Kelvin. Cliquez sur le bouton de refroidissement Kelvin sur l’interface du logiciel du cryostat. Allumez la source de micro-ondes et irradiez l’échantillon en cliquant sur le bouton d’activation des micro-ondes sur l’interface du logiciel du cryostat.

Déconnectez le câble coaxial du canal de détection de la console RMN de la bobine du spectromètre en tournant le connecteur de 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et en le tirant. Branchez le câble coaxial du canal de détection sur le connecteur coaxial de la bobine RMN du cryostat. Insérez ensuite le connecteur mâle du câble de la console RMN dans le connecteur femelle de la bobine RMN du cryostat, en faisant attention à la broche d’orientation.

Poussez fermement et tournez le connecteur dans le sens des aiguilles d’une montre de 90 degrés. Mesurez le signal thermique RMN à l’état solide sur le site du cryostat à l’aide d’une simple séquence d’acquisition d’impulsions avec des impulsions non calibrées et à faible angle de retournement répétées à un intervalle de t égale cinq minutes. Après avoir configuré la mesure, écrivez zg dans la ligne de commande du logiciel et appuyez sur Entrée sur le clavier.

Après avoir lancé la procédure de polarisation, mesurez le signal RMN amélioré DNP à l’état solide avec la même procédure et les mêmes conditions que celles utilisées pour la mesure du signal thermique. Déconnectez le câble coaxial du canal de détection de la console RMN de la bobine RMN du cryostat en tournant le connecteur dans le sens inverse des aiguilles d’une montre de 90 degrés et en le tirant. Branchez ensuite le câble coaxial du canal de détection sur le connecteur coaxial de la bobine du spectromètre.

Insérez le connecteur mâle du câble de la console RMN dans le connecteur femelle de la bobine du spectromètre, en faisant attention à la broche d’orientation. Poussez fermement et tournez le connecteur dans le sens des aiguilles d’une montre de 90 degrés. Préparez fraîchement une solution de LDH de muscle de lapin à raison d’une unité par millilitre dans un tampon de réaction avec 20 microgrammes par millilitre d’albumine sérique bovine.

Ensuite, mélangez 478 microlitres de tampon de réaction, 2 microlitres de solution de LDH et 20 microlitres d’eau deutérée pour permettre la stabilisation ou le verrouillage du champ du spectromètre. Placez ensuite le volume de solution de 500 microlitres dans un tube RMN de 5 millimètres. Connectez le tube de transfert à un dispositif d’injection automatisé et sur mesure qui sépare la solution hyperpolarisée de l’hélium gazeux utilisé pour le transfert.

L’appareil délivre automatiquement 500 microlitres de solution hyperpolarisée dans le tube d’échantillon. Avant la dissolution, placez le tube RMN de cinq millimètres contenant 500 microlitres d’échantillon dans l’isocentre du spectromètre RMN de 11,74 tesla. Insérez 5 millilitres d’eau deutérée dans la chaudière à insert de dissolution.

Mettez en pression et chauffez l’eau deutérée à l’aide du fil résistif jusqu’à ce qu’une température d’environ 180 à 200 degrés Celsius soit atteinte en cliquant sur le bouton de préparation du réchauffeur sur l’interface du logiciel du cryostat. Cliquez sur le bouton SS Operations sur l’interface du logiciel du cryostat. Retirez ensuite le guide micro-ondes de l’insert de dissolution.

Faites glisser l’insert de dissolution vers le bas dans le porte-échantillon. L’insert de dissolution doit atteindre le fond du porte-échantillon et doit être poussé fermement pour établir une connexion étanche avec le récipient d’échantillon afin d’éviter les fuites d’eau deutérée dans le cryostat. Appuyez sur la gâchette matérielle pour commencer la séquence de dissolution, une séquence chronométrée prédéterminée d’opérations de vannes pneumatiques.

Juste après la dissolution, le dispositif d’injection mélange 500 microlitres de solution hyperpolarisée avec l’échantillon placé dans le spectromètre RMN. Après la dissolution, mesurer le signal hyperpolarisé RMN de l’échantillon dans le spectromètre par une série de séquences d’acquisition d’impulsions à angle de retournement de 10 degrés espacées de 1,5 seconde pour suivre la progression de l’aimantation du substrat et du produit. Après avoir configuré la mesure, écrivez zg dans la ligne de commande du logiciel et appuyez sur Entrée.

Une fois que l’aimantation est complètement détendue, mesurez le signal thermique RMN par une série de séquences d’acquisition d’impulsions à angle de retournement de 90 degrés espacées d’environ trois minutes, correspondant à environ 3T1. Après avoir configuré la mesure, écrivez zg dans la ligne de commande du logiciel et appuyez sur la touche entrée. Ici, le parcours temporel des spectres obtenus à partir d’impulsions répétées d’angle de retournement de 10 degrés montre la sensibilité et la résolution temporelle de la technique.

Après l’identification des pics du substrat pyruvate et du produit de lactate, la quantification est effectuée par intégration du signal des métabolites. L’activité enzymatique est déterminée à partir de l’évolution temporelle du signal du produit en l’ajustant à l’aide d’un modèle linéaire. Pour valider la mesure, la même quantité est évaluée par la vitesse de réaction initiale, à partir du rapport entre les signaux du produit et du substrat.

Une fois maîtrisée, une mesure complète de l’activité enzymatique peut être effectuée en deux heures environ si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment produire un substrat hautement polarisé pour la RMN, l’injecter dans une solution contenant une enzyme et suivre l’activité enzymatique à l’aide de la RMN améliorée par DNP. Lors de cette procédure, il est important de préparer soigneusement la solution enzymatique avec des enzymes fraîches et des cosubstrats, et d’éviter toute bulle d’air dans le tube d’échantillon.

Avec le développement de la résonance magnétique améliorée par DNP à l’état liquide, les chercheurs peuvent désormais explorer l’absorption du substrat et sa transformation enzymatique à l’intérieur de divers types de cellules en mesurant le taux de formation du produit. N’oubliez pas que travailler avec des équipements cryogéniques et des champs magnétiques élevés peut être extrêmement dangereux. Des précautions, telles que le port de protections individuelles contre les cryogènes et la vérification de l’absence d’objets magnétiques, doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces mesures.

Contrairement à la RMN classique, la RMN à base de DNP par dissolution est limitée à une fenêtre de temps expérimentale de quelques minutes au maximum, en fonction du substrat et de l’état de vie actuel. Cela empêche d’aller au-delà de la spectroscopie D. La RMN DNP de dissolution a besoin d’être développée pour atteindre le niveau de polyvalence de la RMN multidimensionnelle classique.