CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires
2 avril 2016
La meilleure approche de la validation expérimentale de l’activité de l’amplificateur est l’analyse de perte de fonction. Voici un protocole efficace qui utilise la délétion médiée par CRISPR/Cas9 pour étudier la régulation de la transcription des gènes spécifique de l’allèle dans les cellules ES F1 qui contiennent un génome hybride (Mus musculus129 x Mus castaneus).
L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une délétion médiée par CRISPR/Cas9 spécifique à l'allèle afin d'étudier la régulation de la transcription génique dans les cellules souches embryonnaires de souris. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'un génome hybride pour générer et analyser des délétions monoalléliques. Elle élimine ainsi la nécessité d'analyser des délétions améliorées monoalléliques qui pourraient ne pas être viables.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique fonctionnelle. Par exemple, quel gène est régulé par un enhanceur spécifique, et dans quelle mesure ce gène dépend-il d’un enhanceur particulier pour son activité. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la pluripotence des cellules souches, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes.
Par exemple, cela peut nous aider à comprendre comment les cellules souches modifient leur destin pour devenir des neurones, des cellules sanguines ou du tissu musculaire. Après avoir conçu, construit et confirmé la séquence de l'ARN guide, ou gRNA, à utiliser, préparez-vous à transfecter les plasmides exempts d'endotoxines dans les cellules ES. À l'aide d'une centrifugeuse, former un culot de un fois dix puissance six cellules souches embryonnaires F1 produites par croisement de Mus musculus 129 avec Mus castaneus dans un tube de 1,5 millilitre à 300 fois g pendant cinq minutes.
Après la centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter 100 microlitres du tampon de resuspension fourni par le fabricant du kit. Pour la suppression de la région d'ADN cible, ajouter cinq microgrammes de chacun des plasmides P Cas9 GFP 5-prime et 3-prime gRNA. À l’aide d’une pipette, mélanger délicatement.
Évitez d'introduire des bulles. Ensuite, utilisez la pointe de pipette électronique du microporateur pour aspirer 100 microlitres du mélange d'électroporation, en prenant soin d'éviter d'introduire de l'air dans la pointe. Puis, insérez la pipette dans le dispositif de transfection.
Sélectionnez le protocole approprié et appuyez sur démarrer. Pendant que l'électroporation est en cours, observez la pointe. Avec le bon réglage, de petites bulles doivent émerger de l'électrode du tube.
Une étincelle indique la présence d'une bulle d'air et gênera la transfection. Si cela se produit, l'électroporation doit être répétée avec une nouvelle préparation de cellules. Après l'électroporation, expulsez les cellules transfectées dans une boîte de Pétri de dix centimètres revêtue de gélatine contenant dix millilitres de milieu pour cellules ES.
Incuber les cellules transfectées à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Après 48 heures, utiliser un cytomètre en flux pour trier et isoler les cellules ES positives pour la protéine fluorescente verte (GFP) du groupe neuf. Ensuite, alimenter avec 1 à 1,5 fois 10 à la puissance quatre cellules positives pour la GFP dans une boîte de 10 centimètres, revêtue de gélatine et contenant 10 millilitres de milieu pour cellules ES.
La mise en culture à cette faible densité facilitera la récupération de colonies individuelles de cellules ES. Quatre à cinq jours plus tard, utiliser un microscope pour identifier des colonies individuelles de cellules ES ayant une forme sphérique. À l’aide d’une pipette, transférer chaque colonie dans un puits d’une plaque de 96 puits prétraitée avec de la gélatine et contenant 30 microlitres de tripsom.
Une fois toutes les colonies prélevées et dissociées dans le milieu, faire croître les cellules à 37 degrés Celsius dans l'incubateur à dioxyde de carbone jusqu'à ce que la majorité des puits soient confluents à plus de 70 %. Cela prend généralement environ deux jours. Lorsque les cellules sont prêtes à être divisées, retirer le milieu et ajouter 30 microlitres de tripsine.
Incubez les cellules pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez à chaque puits 180 microlitres de milieu pour cellules ES afin de neutraliser la tripsom. Effectuez des pipettages de montée et de descente pour obtenir une suspension unicellulaire.
À partir de chaque puits, transférez 70 microlitres vers chacun des trois plaques de 96 puits revêtues de gélatine contenant 130 microlitres de milieu pour cellules souches embryonnaires dans chaque puits. Incubez à 37 degrés Celsius. Lorsque les plaques atteignent une confluence de 70 à 85 %, utilisez-les pour effectuer le génotypage et l'analyse d'expression de chaque clone, comme décrit dans les sections suivantes.
Congelez les stocks cellulaires comme décrit dans le document joint. Ici, quatre jeux d'amorces seront conçus pour analyser les clones afin de détecter la délétion souhaitée. Ces amorces comprennent : des amorces internes, des amorces externes, et des amorces encadrant la gRNA, pour les sites cibles en 5' et en 3' de la gRNA.
Commencez par visiter le site web indiqué ici afin d'obtenir la piste de polymorphisme nucléotidique simple ou « snip » correspondant aux génotypes 129 et Cas. Cela redirige vers la page web CRISPR du laboratoire Mitchell. Cliquez alors sur le lien fourni.
Le site redirigera vers le navigateur génomique UCSC contenant la piste affichant les polymorphismes entre les génomes 129 et Cas dans l'assemblage génomique de souris MM-9. Ensuite, saisissez les coordonnées de la région à supprimer et cliquez sur « go ». Zoomez sur une région d'environ 500 paires de bases située au milieu de la suppression souhaitée, contenant plus de trois polymorphismes.
La conception d'amorces spécifiques à l'allèle peut être compliquée si les SNP sont rares. S'il est impossible de concevoir des amorces absolument spécifiques à l'allèle, des amorces modérément spécifiques à l'allèle peuvent être utilisées. N'oubliez simplement pas de comparer les valeurs de CT entre les clones supprimés et non supprimés lors de l'analyse des résultats de la qPCR.
Maintenant, cliquez sur Affichage dans le panneau supérieur. Dans le menu déroulant, sélectionnez ADN. La page Obtenir l'ADN dans la fenêtre s'affichera.
Dans les options de formatage de la séquence, choisissez tout en majuscules, puis cliquez sur « Obtenir l'ADN » pour afficher la séquence cible entièrement en majuscules. Copiez cette séquence et collez-la dans un document Word. Ensuite, comparez la séquence avec la piste de polymorphisme 129 cast et surlignez les positions des polymorphismes, en marquant les polymorphismes 129 avec des lettres minuscules.
Lorsque vous avez terminé avec la séquence 129, copiez-la pour créer deux séquences au format fast day. Une pour 129 et une pour Cas. Dans la séquence cast, remplacez la base correcte à chaque position de coupure, en marquant la coupure par une lettre minuscule.
Ensuite, étiquetez la séquence avec son génome correspondant, 129 ou Cas. Puis, dans le navigateur, saisissez l'adresse de Primer3Plus. Dans la zone appropriée, collez la séquence 129 modifiée par le remplacement du fragment.
Utilisez les paramètres par défaut pour concevoir les amorces. Pour concevoir les amorces spécifiques de l'allèle interne, cliquez sur le menu déroulant à droite de « Task » et sélectionnez « Primer List », puis cliquez sur « Pick Primers ». Une nouvelle page s'ouvrira, affichant une liste d'amorces sens et antisens.
Cochez la case pour sélectionner un amorce en sens direct ou inverse présentant un polymorphisme (snip) indiqué par une lettre minuscule située soit à l'extrémité 3', soit dans les quatre bases adjacentes à l'extrémité 3'. Remarquez que les amorces possédant un polymorphisme à l'extrémité 3' affichent une spécificité allélique accrue lors de la qPCR. Cliquez sur Envoyer vers le gestionnaire Primer3 au bas de l'écran.
Une nouvelle page s'ouvrira affichant l'amorce sélectionnée. Pour sélectionner la seconde amorce, revenez à la page de la liste des amorces, puis cliquez sur le bouton de retour pour accéder à la page principale. Dans le menu déroulant des tâches, sélectionnez Détection.
La page principale sera actualisée et des zones pour les séquences des amorces gauche et droite apparaîtront en bas. Collez la séquence de la première amorce dans la zone appropriée. Ensuite, accédez à l'onglet Paramètres généraux situé à côté de l'onglet Principal et modifiez le paramètre de la plage de taille du produit pour qu'elle soit comprise entre 80 et 200 paires de bases.
Cliquez sur Sélectionner les amorces. Une page s'ouvrira, affichant cinq paires d'amorces possibles pour la première séquence d'amorce. Choisissez un jeu d'amorces dans la liste des paires d'amorces en cochant les cases situées à gauche des amorces, puis cliquez sur Envoyer vers le gestionnaire Primer3 en bas de l'écran. Il s'agira des amorces spécifiques de l'allèle 129 à l'intérieur.
Répétez ces étapes pour concevoir des amorces spécifiques à l'allèle « cast ». Appliquez ensuite cette technique à la conception d'amorces externes spécifiques à l'allèle ainsi que d'amorces non spécifiques à l'allèle. Enfin, testez la spécificité allélique des amorces par qPCR, comme décrit dans le document associé.
Extraire l'ADN génomique à partir de la plaque 96 puits préparée précédemment. Centrifuger brièvement la plaque afin de faire redescendre tout condensat au fond des puits. Cet ADN servira de matrice pour le criblage des délétions.
Ensuite, sur une plaque de 384 puits, réalisez la qPCR en double pour chaque clone. Utilisez une PCR en deux étapes suivie d'une analyse de la courbe de fusion avec détection. Après l'analyse, vérifiez d'abord chaque allèle pour l'amplification à l'aide des amorces spécifiques internes aux allèles.
L'absence d'amplification d'un allèle ou des différences de valeurs CT supérieures à cinq cycles entre les allèles indiquent que ces clones portent une délétion hétérozygote. L'absence d'amplification des deux allèles suggère qu'ils portent une délétion homozygote. Ensuite, vérifiez l'amplification de chaque allèle à l'aide des amorces spécifiques aux allèles externes.
Si la délétion ciblée est supérieure à un kb, l'amplification avec des amorces externes ne se produira que si une délétion est présente. Une valeur CT comprise entre 22 et 28 confirme la délétion. Pour les délétions ciblées inférieures à un kb, confirmez la taille de l'amplicon par électrophorèse.
Une plaque de 96 puits contenant des clones de délétion a été analysée par qPCR en utilisant des amorces internes spécifiques aux allèles. Les barres grises représentent l'amplification par les amorces spécifiques à Cas et les barres noires représentent l'amplification par les amorces spécifiques à 129. Une faible valeur de CT ou l'absence d'amplification avec les amorces internes indique une délétion de la cible.
Les clones présentant une délétion sur un ou deux allèles sont ensuite analysés à l'aide des amorces externes. L'amplification avec les amorces externes confirme la délétion. Les clones possédant une délétion monoallélique sont analysés à l'aide d'amorces encadrant les régions cibles de l'ARNg afin de confirmer l'absence d'insertions ou de délétions, appelées indels, sur l'allèle non délété.
Seuls les clones monoalléliques sans grandes insertions/délétions aux sites cibles sur l'allèle non supprimé sont utilisés pour l'analyse d'expression ultérieure. Sont montrés ici des résultats représentatifs provenant de clones délétés pour 129 ou Cas SCR. Le SCR est un enhancer spécifique de Sox2 récemment décrit dans les cellules souches embryonnaires.
Les barres rouges représentent l'expression de l'allèle Sox2 Cas, et les barres bleues représentent l'amplification de l'allèle Sox2 129. Comme on peut le voir sur cette figure, la suppression du SCR sur l'allèle 129 ou Cas a réduit l'expression de Sox2 dans le CIS. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer une grande délétion à l'aide de la technologie CRISPR et d'utiliser des amorces spécifiques à un allèle pour génotyper vos clones supprimés.
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Aperçu
Cet article présente un protocole utilisant une délétion médiée par CRISPR/Cas9 pour étudier la régulation allélique spécifique de la transcription génique dans des cellules souches embryonnaires murines. La technique exploite un génome hybride pour faciliter l'analyse de délétions monoalléliques, offrant ainsi des informations sur la régulation des gènes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génomique fonctionnelle
- Régulation de la transcription des gènes
- Technologie CRISPR/Cas9
Contexte
- Comprendre l'activité des enhancers est essentiel pour la régulation des gènes.
- L'analyse de perte de fonction est une approche clé dans ce domaine.
- Les cellules souches embryonnaires de souris constituent un modèle pour l'étude de la régulation génique.
- Les génomes hybrides peuvent aider à analyser des interactions géniques spécifiques.
Objectif de l'étude
- Étudier le rôle d'enhanceurs spécifiques dans la régulation génique.
- Déterminer la dépendance de gènes vis-à-vis d'enhanceurs particuliers.
- Approfondir la compréhension de la pluripotence des cellules souches et de ses applications.
Méthodes utilisées
- Technique de délétion médiée par CRISPR/Cas9.
- Utilisation de cellules souches F1 possédant un génome hybride (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Analyse de délétions monoalléliques pour l'étude de la transcription génique.
- Validation expérimentale de l'activité d'un enhancer par analyse de perte de fonction.
Résultats principaux
- Mise en œuvre réussie de délétions allèle-spécifiques dans les cellules souches.
- Apports sur la régulation de la transcription des gènes par des enhancers spécifiques.
- Démonstration de l'applicabilité de la méthode à divers systèmes biologiques.
- Contribution à la compréhension de la génomique fonctionnelle.
Conclusions
- La méthode CRISPR/Cas9 est efficace pour étudier l'activité des enhancers.
- Cette approche peut clarifier la relation entre les enhancers et l'expression génique.
- Les résultats pourraient avoir des implications plus larges pour la recherche sur les cellules souches et la génomique fonctionnelle.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet une interrogation précise de la fonction des enhanceurs par délétion allèle-spécifique à l’aide de CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires de souris hybrides, en abordant un défi majeur dans la validation ciblée : établir un lien entre les éléments régulateurs distants et l’expression génique. En exploitant les SNP naturels entre les allèles de Mus musculus 129 et de Mus castaneus, cette approche permet de réduire les risques mécanistiques liés aux régulateurs transcriptionnels sans les complications dues à une létalité homozygote, offrant ainsi une confiance prédictive dans les relations enhanceur-gène dès les premières étapes de la découverte.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en testant la nécessité des enhanceurs pour l'expression génique dans un modèle de cellules souches physiologiquement pertinent.
- Valeur scientifique : Contribue à l'atténuation des risques biologiques grâce à une analyse de perte de fonction monoallélique qui évite les interférences phénotypiques dues à la suppression complète d'éléments régulateurs.
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en fournissant une preuve directe de régulation en cis par criblage de suppression allèle-spécifique utilisant des amorces discriminant les SNP.
Développement de criblages et de tests
- Valeur opérationnelle : Facilite la standardisation des tests grâce à la génotypage par qPCR utilisant des amorces spécifiques des allèles, internes et externes, permettant de distinguer les clones hétérozygotes, homozygotes et de type sauvage.
- Valeur opérationnelle : Permet un flux de travail de criblage évolutif en utilisant le prélèvement de colonies en plaques 96-puits et la qPCR en plaques 384-puits pour une validation à haut débit des délétions.
- Valeur opérationnelle : Favorise la reproductibilité des tests en exigeant la confirmation de l'absence d'indels sur l'allèle non supprimé à l'aide d'amorces flanquant la séquence d'ARNg avant l'analyse d'expression.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Fournit des informations pertinentes sur les systèmes pathologiques en étudiant la régulation médiée par des enhancers des facteurs de pluripotence tels que Sox2 dans les cellules souches embryonnaires de souris.
- Valeur translationnelle : Renforce la confiance prédictive dans les décisions concernant le destin des cellules souches en associant la suppression d'enhancers à des modifications de l'expression génique pertinentes pour les voies de différenciation.
- Valeur translationnelle : Permet une détection mécanistique des risques liés aux cibles d'enhancers grâce à une analyse quantitative de l'expression (qPCR) montrant une réduction allèle-spécifique de la transcription du gène cible.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la continuité allant de la biologie de la découverte à l'identification de candidats thérapeutiques, en apportant une validation fonctionnelle des éléments régulateurs non codants avant toute ciblage thérapeutique, les résultats orientant directement les décisions de priorisation des cibles et de réduction des risques.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les relations entre régulateurs transcriptionnels et gènes par l'analyse d'expressions allèle-spécifiques et de délétions allèle-spécifiques dans un modèle génétiquement modifiable.
- Criblage : Offre une prête-à-l'emploi pour les tests grâce à un protocole standardisé de qPCR utilisant des amorces allèle-spécifiques afin de quantifier l'efficacité et la spécificité de la délétion dans différentes lignées cellulaires.
- Analyse : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (valeurs de CT, courbes de fusion) permettant de comparer l'expression allélique et la zygosité des délétions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en étudiant la fonction des régulateurs transcriptionnels dans un modèle de cellules souches pertinent pour la différenciation et la modélisation des maladies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable de validation des régulateurs transcriptionnels dans différentes régions du génome, en utilisant un même protocole CRISPR et une conception d'amorces basée sur les SNP.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la fonction des activateurs grâce à des preuves directes de perte de fonction, sans mécanismes compensatoires issus d'une délétion homozygote.
- Valeur opérationnelle : Normalisation et reproductibilité par la conception de primers allèle-spécifiques guidée par les SNP et les protocoles de criblage par qPCR.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'avancement ou d'abandon en clarifiant la dépendance aux activateurs et en réduisant l'ambiguïté mécanistique lors de la validation des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque des cibles transcriptionnelles fondée sur des relations gène-activateur validées dans un contexte cellulaire pertinent pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en conception CRISPR/Cas9, en ingénierie d'amorces allèle-spécifiques et en analyse de PCR quantitative pour la discrimination allélique.
- Dépend de l'accès à des cellules souches embryonnaires hybrides F1 possédant une densité suffisante de SNP (environ tous les 125 pb) pour un ciblage allèle-spécifique fiable.
- Implique une standardisation entre les équipes pour les protocoles de conception d'amorces utilisant le navigateur génomique UCSC et Primer3Plus afin d'assurer la spécificité allélique.
- Implique des adaptations pour les modèles non hybrides, où la densité de SNP peut être insuffisante pour une résolution allèle-spécifique.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité de confirmer l'absence d'indels sur l'allèle non supprimé avant d'attribuer des modifications d'expression à la perte de l'enhancer.
