CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la délétion médiée par CRISPR/Cas9 spécifique de l’allèle pour étudier la régulation de la transcription des gènes dans les cellules souches embryonnaires de souris. Le principal avantage de cette technique, qui utilise un génome hybride pour générer et analyser les délétions monoalléliques. Au lieu de cela, il élimine le besoin d’analyser les délétions améliorées monoalléliques qui peuvent ne pas être viables.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique fonctionnelle. Par exemple, quel gène un amplificateur spécifique régule-t-il et dans quelle mesure ce gène dépend-il d’un amplificateur pour son activité. Si cette méthode peut donner un aperçu de la pluripotence des cellules souches, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes.

Par exemple, cela peut nous aider à comprendre comment les cellules souches changent leur destin pour devenir des neurones, des cellules sanguines ou des muscles. Après avoir conçu, construit et confirmé la séquence de l’ARN guide, ou ARNg, à utiliser, préparez-vous à transfecter les plasmides exempts d’endotoxines dans des cellules ES. À l’aide d’une centrifugeuse, granulez une fois dix à la sixième cellules souches embryonnaires F1 générées en croisant Mus musculus 129 avec Mus castaneus dans un tube de 1,5 millilitre à 300 fois g' pendant cinq minutes.

Après l’essorage, jetez le surnageant et ajoutez 100 microlitres du tampon de remise en suspension fourni par le fabricant du kit. Pour la délétion de la région cible de l’ADN, ajoutez cinq microgrammes chacun de plasmides d’ARNg P Cas9 GFP 5-prime et 3-prime. À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement.

Évitez d’introduire des bulles. Ensuite, utilisez la pointe de pipette électronique du microporateur pour aspirer 100 microlitres du mélange d’électroporation, en prenant soin d’éviter d’introduire de l’air dans la pointe. Ensuite, branchez la pipette dans le dispositif de transfection.

Sélectionnez le protocole approprié et appuyez sur Démarrer. Pendant que l’électroporation est en marche, observez la pointe. Avec la bonne configuration, de minuscules bulles devraient émerger de l’électrode du tube.

Une étincelle indique la présence d’une bulle d’air et interférera avec la transfection. Si cela se produit, l’électroporation doit être répétée avec un nouveau lot de cellules. Après l’électroporation, éjectez les cellules transfectées dans une boîte recouverte de gélatine de dix centimètres contenant dix millilitres de milieu cellulaire ES.

Incuber les cellules transfectées à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Après 48 heures, utilisez un cytomètre en flux pour trier et isoler les neuf cellules ES GFP positives coulées. Ensuite, donnez à 1 à 1,5 fois 10 cellules positives à la GFP dans une boîte de 10 centimètres, recouverte de gélatine contenant 10 millilitres de milieu cellulaire ES.

Le placage à cette faible densité facilitera la capture des colonies individuelles de cellules ES. Quatre à cinq jours plus tard, utilisez un microscope pour identifier des colonies individuelles de cellules ES en forme de boule. À l’aide d’une pipette, transférez chaque colonie dans un puits d’une plaque de 96 puits prétraitée à la gélatine et contenant 30 microlitres de tripsom.

Une fois que toutes les colonies ont été cueillies et dissociées en milieu, faites pousser les cellules à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la plupart des puits soient confluents à plus de 70 %. Cela prend généralement environ deux jours. Lorsque les cellules sont prêtes à être divisées, retirez le milieu et ajoutez 30 microlitres de tripsom.

Incuber les cellules pendant cinq minutes. Ensuite, dans chaque puits, ajoutez 180 microlitres de milieu cellulaire ES pour neutraliser le tripsom. Pipette de haut en bas pour obtenir une suspension à cellule unique.

De chaque puits, transférez 70 microlitres dans chacune des trois plaques de 96 puits recouvertes de gélatine contenant 130 microlitres de milieu cellulaire ES dans chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius. Lorsque les plaques atteignent 70 à 85 % de confluence, utilisez-les pour effectuer le génotypage et l’analyse de l’expression de chaque clone, comme décrit dans les sections qui suivent.

Congelez les stocks de cellules comme décrit dans le document d’accompagnement. Ici, quatre ensembles d’amorces seront conçus pour cribler les clones en vue de la suppression souhaitée. Il s’agit notamment des amorces intérieures, des amorces extérieures et des amorces flanquantes d’ARNg pour les sites cibles d’ARNg à 5 et à 3 priorités.

Commencez par visiter le site Web présenté ici pour obtenir le polymorphisme nucléotidique unique ou la piste de coupe correspondant aux génotypes 129 et Cas. Cela mène à la page Web CRISPR du Mitchell Lab. Là, cliquez sur le lien indiqué.

Le site redirigera vers le navigateur génomique de l’UCSC contenant la piste affichant des coupures entre les génomes 129 et Cas dans l’assemblage du génome de la souris MM-9. Entrez ensuite les coordonnées de la région à supprimer. et cliquez sur go"Zoom avant sur une région d’environ 500 paires de bases au milieu de la suppression souhaitée contenant plus de trois snips.

La conception d’amorces spécifiques à l’allèle peut être compliquée si les cisailles sont rares. S’il n’est pas possible de concevoir des amorces absolues spécifiques à l’allèle, des amorces modérées spécifiques à l’allèle peuvent être utilisées. N’oubliez pas de comparer les valeurs CT entre les clones supprimés et non supprimés lors de l’analyse des résultats de la qPCR.

Maintenant, cliquez sur Afficher" dans le panneau supérieur. Dans le menu déroulant, sélectionnez ADN. La page « Obtenir l’ADN dans la fenêtre » apparaîtra.

Dans les options de formatage de la séquence, choisissez tout en majuscules, puis cliquez sur Obtenir l’ADN pour afficher la séquence cible en majuscules. Copiez cette séquence et collez-la dans un fichier de document Word. Ensuite, comparez la séquence avec la piste d’extraction 129 et mettez en surbrillance les positions d’extraction et marquez les 129 séquences avec les minuscules.

Lorsque vous avez terminé avec la séquence 129, copiez-la pour créer deux séquences formatées en journée rapide. Un pour 129 et un pour Cas. Dans la séquence d’incantation, remplacez la base correcte à chaque position de coupe, en marquant la coupe avec une minuscule

Ensuite, étiquetez la séquence avec son génome correspondant, 129 ou Cas. Ensuite, dans le navigateur, tapez l’adresse de Primer3Plus. Dans la zone appropriée, collez la séquence 129 substituée par capture.

Utilisez les paramètres par défaut pour concevoir les amorces. Pour concevoir les amorces spécifiques à l’allèle intérieur, cliquez sur le menu déroulant à droite de Tâche » et sélectionnez Liste des amorces », puis cliquez sur Choisir les amorces. Une nouvelle page s’ouvrira et affichera une liste d’amorces avant et arrière.

Cochez la case de sélection pour choisir une amorce avant ou arrière dont la coupe est marquée par une minuscule, soit à l’extrémité 3 primes, soit à moins de quatre bases de l’extrémité 3 primes. Notez que les amorces qui ont une coupure à l’extrémité 3-prime affichent une spécificité allélique accrue pendant la qPCR. Cliquez sur Envoyer au gestionnaire Primer3 en bas de l’écran.

Une nouvelle page s’ouvrira et affichera l’amorce sélectionnée. Pour sélectionner la deuxième amorce, retournez à la page de liste des amorces, puis cliquez sur le bouton Précédent pour revenir à la page principale. Dans le menu déroulant de la tâche, sélectionnez Détection.

La page principale sera actualisée et une boîte de séquence d’amorce gauche et droite apparaîtra en bas. Collez la première séquence d’amorçage dans la case appropriée. Ensuite, accédez à l’onglet Paramètres généraux situé à côté de l’onglet Principal et modifiez le paramètre de la plage de tailles de produit à 80 à 200 paires de base.

Cliquez sur Choisir les amorces"Une page s’ouvrira affichant cinq paires d’amorces possibles pour la première séquence d’amorces. Choisissez un jeu d’amorces dans la liste des paires d’amorces en cochant les cases à gauche des amorces et cliquez sur Envoyer au gestionnaire d’amorces3 en bas de l’écran. Il s’agira des 129 amorces spécifiques de l’allèle intérieur.

Répétez ces étapes pour concevoir des amorces pour l’allèle coulé. Ensuite, appliquez cette technique à la conception d’amorces spécifiques à l’allèle extérieur et d’amorces non spécifiques à l’allèle. Enfin, testez la spécificité de l’allèle des amorces à l’aide de la qPCR, comme décrit dans le document d’accompagnement.

Extrayez l’ADN génomique de la plaque de 96 puits préparée précédemment. Centrifugez brièvement la plaque pour déposer toute condensation au fond du puits. Cet ADN servira de modèle pour le dépistage de la délétion.

Ensuite, sur une plaque de 384 puits, préformez la qPCR et dupliquez-la pour chaque clone. Utilisez une PCR en deux étapes suivie d’une analyse de la courbe de fusion avec détection. Après l’analyse, vérifiez d’abord l’amplification de chaque allèle avec les amorces spécifiques de l’allèle intérieur.

L’absence d’amplification d’un allèle ou de différences de valeur CT de plus de cinq cycles entre les allèles suggère que ces clones portent une délétion hétérozygote. Aucune amplification des deux allèles ne suggère qu’ils portent une délétion homozygote. Ensuite, vérifiez l’amplification de chaque allèle avec les amorces spécifiques de l’allèle extérieur.

Si la suppression cible est supérieure à un Ko, l’amplification avec des amorces extérieures ne se produira que si une suppression est présente. Une valeur CT de 22 à 28 confirme la suppression. Pour les suppressions cibles inférieures à un Ko, confirmez la taille de l’amplicon par élétrophorèse.

Une plaque de 96 puits de clones de délétion a été criblée par qPCR à l’aide d’amorces internes spécifiques à l’allèle. Les barres grises représentent les amorces spécifiques à Cas et les barres noires représentent l’amplification des amorces spécifiques à 129. Une faible valeur CT ou l’absence d’amplification avec les amorces intérieures indique la suppression de la cible.

Les clones avec une délétion sur l’un ou les deux allèles sont ensuite criblés avec les amorces externes. Avec des amorces externes, l’amplification confirme la délétion. Les clones avec une délétion monoallélique sont criblés à l’aide d’amorces flanquant les régions cibles de l’ARNg pour confirmer l’absence d’insertions ou de délétions, appelées indels, sur l’allèle non supprimé.

Seuls les clones monoalléliques sans grands indels aux sites cibles de l’allèle non supprimé sont utilisés dans l’analyse d’expression ultérieure. Vous trouverez ci-dessous les résultats représentatifs de clones supprimés 129 ou Cas SCR. Le SCR est un activateur spécifique de Sox2 récemment décrit dans les cellules ES.

Les barres rouges représentent l’expression de l’allèle Sox2 Cas, et les barres bleues représentent l’amplification de l’allèle Sox2 129. Comme on peut le voir sur cette figure, la délétion de la SCR sur l’allèle 129 ou Cas a réduit l’expression de Sox2 dans le CIS. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer une grande délétion à l’aide de la technologie CRISPR et d’utiliser des amorces spécifiques à l’allèle pour génotyper vos clones supprimés.