Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

L'objectif général de cette procédure est d'identifier de nouveaux gènes candidats impliqués dans les troubles de la malformation cérébrale et de confirmer directement leur rôle causal in-vivo. Cette stratégie peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la neurobiologie en découvrant les voies moléculaires associées au développement cérébral et aux pathologies corrélées. Le principal avantage de cette stratégie est qu'elle permettra de découvrir de nouveaux gènes associés aux troubles cérébraux et de développer de nouveaux outils diagnostiques.

Grâce à cette approche, nous avons pu révéler la contribution essentielle du gène C6orf70 dans la pathogenèse de l'hétérotopie nodulaire périventriculaire, une malformation cérébrale provoquée par une migration neuronale anormale. La procédure sera démontrée par Fabienne Schaller, ingénieure dans notre laboratoire. Préparez un rat gestant E15 pour l'intervention conformément au protocole écrit et aux directives institutionnelles et nationales.

Veiller à ce que l'animal soit correctement anesthésié, qu'un onguent ophtalmique soit appliqué sur les yeux et que l'abdomen soit correctement rasé et désinfecté. Après avoir utilisé des ciseaux pointus pour pratiquer une incision verticale de deux centimètres dans la peau et le muscle le long de la ligne médiane de l'abdomen caudal, exposer soigneusement une corne utérine à partir de la cavité abdominale. Appliquer goutte à goutte une solution saline normale préalablement chauffée à 37 degrés Celsius pour hydrater les embryons.

Gardez l’utérus humide tout au long de la procédure. Pour injecter l’ADN, maintenez délicatement un embryon d’une main, en laissant la tête facilement accessible. Ensuite, à l’aide de l’autre main, insérez prudemment une pipette en verre raccordée à un microinjecteur dans le ventricule latéral gauche, situé à un millimètre de la ligne médiane et à une profondeur de deux à trois millimètres.

Utilisez le microinjecteur pour injecter environ un microlitre d'ADN contenant du vert rapide afin de permettre la surveillance visuelle de l'injection. Pour électroporer l'ADN dans les cellules, déposez d'abord une solution saline normale sur la surface de l'électrode de trois par sept millimètres. Placez ensuite l'électrode positive du côté injecté et l'électrode négative sur le ventricule droit non injecté.

Utilisez la pédale commandée par le pied pour délivrer cinq impulsions électriques à des intervalles de 950 millisecondes. Après l'électroporation, replacez la corne utérine dans la cavité abdominale et ajoutez du sérum physiologique stérile afin de permettre aux embryons de s'positionner plus naturellement et de compenser la perte de liquide pendant l'intervention. Fermez la paroi musculaire avec des sutures chirurgicales résorbables, puis la peau à l'aide d'un point simple interrompu.

Administrer une analgésie postopératoire pendant 48 heures au maximum, ou selon les directives établies par l'établissement. Replacer le rat dans sa cage propre et le surveiller jusqu'à son réveil de l'anesthésie. Après avoir fixé les cerveaux dans du paraformaldéhyde à 4 %, comme indiqué dans la partie écrite du protocole, rincer dans du PBS pendant 10 minutes.

Pendant le lavage, préparez 50 millilitres d'agar à 4 % dans le PBS en veillant à ce que la température de l'agarose dissous ne dépasse pas 50 degrés Celsius. Versez l'agarose dans des moules d'encapsulation en plastique, puis placez les cerveaux dans l'agarose. Placez les cerveaux encapsulés à quatre degrés Celsius et laissez l'agarose polymériser pendant au moins une heure.

Une fois que l'agarose a polymérisé, retirez l'excès d'agarose autour du cerveau, puis collez le cerveau sur la plaque de base du vibratome de manière à ce que l'axe antéro-postérieur du cerveau soit perpendiculaire à la lame. Après avoir attendu quelques minutes pour que la colle sèche, placez la plaque avec le cerveau collé dans la chambre du vibratome. Remplissez le vibratome avec du PBS et commencez à couper des sections de 100 microns d'épaisseur.

Après la coupe, transférez les sections sur des lames de microscope et éliminez le liquide en excès. Ajoutez ensuite quelques gouttes de milieu de montage et posez une lamelle sur les sections. Laissez sécher toute la nuit.

Imager les sections en utilisant un grossissement de 10x sur un microscope confocal à balayage laser. Pour analyser les images, convertir d'abord l'image en 8 bits à l'aide d'un logiciel approprié pour l'analyse quantitative d'images. Ensuite, sélectionner une cellule fluorescente positive pour la GFP représentative et définir manuellement sa forme en cliquant sur estimer et en utilisant l'outil de sélection libre pour tracer la bordure de la cellule.

Le logiciel conserve automatiquement le diamètre et le seuil d'intensité de la cellule. Cliquez sur « trouver les cellules » pour permettre au logiciel de localiser les cellules transfectées dans toute la couche corticale. Ensuite, si nécessaire, supprimez manuellement les faux positifs.

Divisez l'épaisseur complète du cortex en huit zones d'intérêt, normalisées dans des sections individuelles, en cliquant sur l'outil de région, puis en sélectionnant huit bandes régionales, où les bandes une et huit correspondent respectivement à la zone ventriculaire et au sommet de la plaque corticale. Ensuite, cliquez sur appliquer pour permettre au logiciel de déterminer la position relative des cellules transfectées au GFP dans l'ensemble du cortex. Enfin, cliquez sur enregistrer la quantification pour exporter les données dans un fichier Excel destiné à l'analyse.

Les analyses par CGH en array et par séquençage complet de l'exome ont identifié C6orf70 comme gène candidat impliqué dans les anomalies du développement. La PCR quantitative a révélé que ce gène, ainsi que PHF10 et DLL1, est exprimé dans le cortex cérébral du rat. Les images suivantes montrent des sections coronales néocorticales représentatives de cerveaux de rat à E20, prélevées 5 jours après électroporation avec un vecteur exprimant uniquement la protéine fluorescente verte, ou combiné à un ARNsh ciblant la séquence codante de C6orf70, ou à un construct contrôleur inefficace portant une séquence mésappariée.

L'extinction du filament A a été utilisée comme contrôle d'un déplacement neuronal altéré. L'électroporation in utero avec un ARNh ciblant la C6orf70 ou le filament A a induit un arrêt des cellules positives pour la GFP dans la zone ventriculaire, comme indiqué par les flèches blanches, tandis que les cellules exprimant la GFP seule, ou en combinaison avec la construction non appariée, n'ont pas modifié la migration neuronale. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit le stade de la genèse corticale que l'on souhaite analyser, qu'il s'agisse de la prolifération neuronale, de la migration ou de la maturation.

N'oubliez pas que l'apprentissage de l'électroporation in utero dans le cerveau embryonnaire de rongeur nécessite une longue période de formation, des compétences et une pratique régulière.