Name: Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez l'optogénétique ex vivo pour disséquer les circuits neuronaux de la peur dans des tranches cérébrales. Cette méthode combine l'expression de channelrhodopsine et l'enregistrement patch-clamp pour analyser les propriétés synaptiques avec précision.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions Cora Hübner et Andrea Gall pour leur aide dans l’acquisition de certains des résultats représentatifs. Ces travaux ont été soutenus par le Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) de l’Université de Tübingen, une initiative d’excellence financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre de l’initiative d’excellence (EXC 307), et par des fonds de la Charitable Hertie Foundation.

déclaration éthique: Toutes les procédures expérimentales étaient conformes à la directive européenne sur l&#39;utilisation des animaux dans la recherche et ont été approuvés par le soin des animaux locaux et utilisation Comité (Regierungspräsidium Tübingen, état de Baden-Württemberg, Allemagne) responsable de l&#39;Université de Tübingen. 1. Procédure d&#39;injection stéréotaxique <ol><li> Préparer des outils stériles (ciseaux, scalpel, pinces, forage, aiguilles, matériel de suture) en utilisant un stérilisateur. Disposer des outils stériles et d&#39; autres solutions nécessaires et les fournitures de chirurgie tels que les swaps stériles de coton, désinfectant, stérile tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4), et H 2 O 2 sur un champ opératoire stérile. </li><li> Pull micropipettes de verre pour les injections (figure 1A, encart) en utilisant une largeur de 3 mm boîte filament sur ​​un microélectrodes horizontal extracteur selon les instructions du fabricant. Remarque: Pour les injections profondes, le cône de l&#39;électrode doit être suffisammentlong pour atteindre les ventrales la plupart des coordonnées (environ 5 mm;. pour les coordonnées, voir 1.10). </li><li> Premix 1 pl de solution de virus et 0,2 pi de solution vert rapide de 0,1% dans du PBS stérile (pour une meilleure visibilité de la solution dans la pipette en verre). Remplissez pipettes en verre avec un mélange de solution de virus et vert rapide à l&#39; aide d&#39; une pipette microlitre avec une pointe fine (figure 1A, encart). Remarque: Travailler avec des vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) est considéré comme le niveau de biosécurité 1 (BSL 1) travail et doit être exécuté dans un BSL 1 laboratoire. rAAV utilisés dans cette étude (figure 1C) étaient les suivants : 1) CPFm: rAAV-Hsyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sérotype 2/9) 16; 2) MGm / PIN: rAAV-CAGH-ChR2 (H134R) -mCherry (sérotype 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) YFP (sérotype 2/1) 23 </li><li> Anesthésier une souris à l&#39;aide d&#39;une petite machine d&#39;anesthésie des animaux (isoflurane: 3% dans de l&#39;oxygène pour l&#39;induction). Remarque: Les souris utilisées dans cette étude étaient 4 -7 semaines et des souches suivantes et génotypes: C57BL6 / J de type sauvage (expérience sur les figures 2A et 3A-D); GAD67-GFP 24 (expérience dans les figures 2B et 3E-H); TAC2-Cre 25 (expérience dans les figures 2C et 3I-J). </li><li> Raser la tête entre les oreilles et les yeux. Appliquer un désinfectant (providone-à base d&#39;iode) à la tête rasée en utilisant des cotons-tiges. </li><li> Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement des yeux pendant l&#39;anesthésie. Injecter par voie sous- cutanée à la souris avec analgésique (0,1 ml d&#39;une solution de 5 mg à base de méloxicam-/ ml). </li><li> Placer la souris dans le cadre stéréotaxique (figure 1A) et maintenir une anesthésie par l&#39; intermédiaire d&#39; un masque d&#39;anesthésie au gaz (isoflurane: 2% dans de l&#39; oxygène pour la maintenance). Contrôler la profondeur d&#39;anesthésie en utilisant le retrait du membre réflexe avant de continuer. Remarque: Maintenir des conditions stériles aussi bien que possible pendant toute la procédure chirurgicale; porter un masque facial jetable, go chirurgicalewn, et des gants. </li><li> Faire incision de la peau sur le dessus de la tête avec des ciseaux. Tirez doucement sur ​​la peau sur le côté en utilisant des pinces émoussées, fixer avec des pinces pour exposer la surface du crâne, et le crâne propre avec H 2 O 2. </li><li> Sites d&#39;injection Marquer sur le crâne à l&#39; aide d&#39; un marqueur fines et percer des trous permanents pointe pour les deux hémisphères (figure 1B). Coordonnées pour les injections dans cette étude sont (de bregma (mm)): CPFm: antérieure 1.9, latérale ± 0,3, 2,1 ventrale; MGm / PIN: 3.0 postérieure, latérale ± 1,8, 3,8 ventrale; mpITC / BLA: 1,45 postérieure, latérale ± 3,35, et 4,75 ventrale. </li><li> Monter rempli pipette en verre sur le cadre stéréotaxique relié à un dispositif d&#39;injection de pression et amener la pipette en position bregma. </li><li> Casser la pointe de la pipette de verre en utilisant pince fine pointe droite. Pour ce faire, doucement pour éviter la production d&#39;aérosols de solution de virus. Assurez-vous que la pointe de la pipette est ouverte en appliquant quelques impulsions de pression et en observant l&#39;extrusion de gouttes de virus solution. </li><li> Aller aux coordonnées d&#39;injection désirées et injecter la moitié du contenu de la pipette (~ 0,5 pi) en utilisant les paramètres suivants sur le dispositif d&#39;injection de pression: Pression: 20 psi, longueur d&#39;impulsion moyenne: 30 ms, le nombre moyen d&#39;impulsions: 50. </li><li> Laissez pipette en place pour ~ 1 min avant de lentement (1 mm / min) rétracter. Remarque: Assurez-vous que la pipette ne soit pas bloqué avant de répéter la procédure avec la même pipette sur un autre hémisphère. En cas de pointe bloquée, propre ou rompre la pointe et la position zéro de la pipette à bregma à nouveau. </li><li> Nettoyer le crâne avec du PBS (pH 7,4), retirer des pinces, tirez doucement la peau ensemble, et suturer l&#39;incision avec bouton individuel suture (3 - 4 nœuds). Appliquer un désinfectant (providone-à base d&#39;iode) autour de la plaie. </li><li> Arrêtez l&#39;anesthésie et ne pas laisser la souris sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement réveillé. Gardez seule loge ou retourner à la compagnie d&#39;autres animaux que lorsqu&#39;il est complètement récupéré. Après l&#39;opération, continuer à surveiller l&#39;état de santé, et administer analgésique si nécessaire. Suivez les procédures selon les règles formulées par le Comité des soins et l&#39;utilisation des animaux local. </li></ol> 2. Préparation des tranches aiguës <ol><li> Préparer ACSF, solution de coupe, outils (ciseaux, scalpel, pince, spatule, pipette Pasteur), et des blocs de gélose. Note: 1 litre de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) est requise par l&#39; expérience, et elle est préparée par dissolution de produits chimiques dans bidistillée H 2 O comme précédemment publiée 16,23. Solution de coupe est préparée en complétant 200 ml de ACSF avec 0,87 ml de M MgSO4 solution mère 2. </li><li> ACSF et oxygéner la solution de découpe tout au long de l&#39;expérience avec 95% O 2 et 5% de CO 2. </li><li> Profondément anesthésier souris à l&#39;aide d&#39;une petite machine d&#39;anesthésie de l&#39;animal en utilisant l&#39;isoflurane (3% en oxygène). Contrôler la profondeur d&#39;anesthésie en utilisant le retrait du membre réflexe avant de continuer. </li><li> Décapitez souris à l&#39;aide de ciseaux et de grandes refroidir immédiatementla tête dans une solution de coupe glacée. </li><li> Ouvrir le crâne par une seule incision médiane de caudale à rostre et pousser délicatement des morceaux de crâne sur les côtés à l&#39;aide de forceps. retirer rapidement le cerveau en soulevant doucement hors du crâne à l&#39;aide d&#39;une petite spatule arrondie. Coupez le cervelet avec scalpel. Placez le cerveau dans une solution de coupe glacée. </li><li> Pour les sites d&#39;injection MPFC: couper une partie antérieure du cerveau (contenant CPFm) à l&#39;aide d&#39;un scalpel et mis en solution de coupe glacée jusqu&#39;à ce que le tranchage. </li><li> Retirer la solution de coupe excédent avec un papier filtre et coller la partie postérieure du cerveau sur la scène vibratome. </li><li> Pour les tranches de amygdale inclinées, coller le cerveau sur un bloc de gélose (4%) coupé à un angle de 35 ° (figure 1D, milieu). Pour les tranches de amygdale coronales, sites d&#39;injection MGm / PIN et des sites d&#39;injection MPFC, coller directement le cerveau sur scène (figure 1D, à gauche et à droite). Placez un bloc de gélose supplémentaire derrière le cerveau pour la stabilité tout en tranchage. </li><li> Placstade e dans la chambre de coupe avec une solution de coupe oxygénées glacée qui est maintenue à 4 ° C en utilisant une unité de refroidissement. Préparer des tranches aiguës de l&#39;amygdale (320 pm) en utilisant une lame de saphir. Placer les tranches dans une chambre d&#39;interface fourni avec ACSF oxygénée à la température ambiante. </li><li> Après la préparation de tranches de amygdale aiguës, placer la chambre d&#39;interface dans un bain-marie à 36 ° C pour récupérer des tranches pour les 35 - 45 min. Par la suite, le retour de la chambre d&#39;interface à RT. Pour l&#39;enregistrement de ces tranches, passez à l&#39;étape 3.2. </li><li> Pendant le début de l&#39;étape 2.10, des tranches de sites d&#39;injection coupé comme décrit précédemment pour les tranches de amygdale aiguës (étapes 02/08 à 02/09). Recouvrement des tranches dans le bain d&#39;eau ne soit pas nécessaire ici. Facultatif: Pour estimer rapidement l&#39;emplacement du site d&#39;injection, observer les tranches sur un stéréoscope équipé d&#39;une lampe fluorescente et des filtres appropriés. </li><li> Fixer des tranches contenant des sites d&#39;injection pour l&#39;analyse post-hoc en les intercalant entre deux papiers filtres et submerles ging dans 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS solution O / N. Pour l&#39;analyse des sites d&#39;injection passez à l&#39;étape 4.1. </li></ol> 3. Visualisation et stimulation des fibres présynaptiques <ol><li> Préparer Patch microscope pour l&#39;activation optogenetic de fibres et de cellules: <ol><li> Centre de la diode montée électroluminescente (DEL) sur la voie de livraison lumière. </li><li> Mesurer l&#39;intensité de la lumière LED dans le plan focal arrière et à la sortie de chaque objectif avec un compteur de puissance en choisissant la longueur d&#39;onde appropriée de 470 nm. </li><li> Calculer l&#39;intensité lumineuse en mW / mm 2 et de créer une courbe d&#39;étalonnage (intensité LED (%) en fonction de la sortie de lumière (mW / mm 2)) pour chaque objectif pour les valeurs mesurées pour 470 nm de longueur d&#39; onde. </li></ol></li><li> Récupérez une amygdale tranche aiguë de la chambre d&#39;interface et dans la chambre de coupe monté sur le microscope droit équipé d&#39;une lampe fluorescente. Prenez soin de positionner la tranche telle que la slicsurface e vers le haut dans la chambre d&#39;interface est également orientée vers le haut dans la chambre d&#39;enregistrement. Perfuser tranche avec des produits frais, FCSA oxygénée à un taux de 1 - 2 ml / min à une température de ~ 31 ° C. </li><li> Observer les fibres présynaptiques dans la tranche à l&#39;aide de la lampe fluorescente en combinaison avec des filtres appropriés pour la protéine fluorescente spécifique exprimée. Utilisez objectif 5x pour obtenir une vue d&#39; ensemble (figure 1E) et 60x objective pour l&#39; évaluation de la densité des fibres dans la zone cible. Remarque: Pour la GFP et YFP, l&#39;utilisation du filtre réglé &quot;vert&quot; (Excitation 472/20, Beamsplitter 495, émission 490 LP) pour mCherry utiliser le filtre mis en &quot;rouge&quot; (Excitation 560/40, Beamsplitter 585, Emission 630/70) comme spécifié dans la table des matières / équipement. </li><li> Ouvrir ou restreindre l&#39;ouverture dans la voie optique du microscope comme on le souhaite pour l&#39;expérience (figure 2D). </li><li> Pour obtenir un enregistrement de patch, remplir une pipette de patch avec une solution interne et monte in support d&#39;électrode. Appliquer une pression positive à la pipette de patch et lentement abaisser d&#39;abord dans la solution de bain et sous contrôle visuel dans la tranche à l&#39;aide du micromanipulateur. <ol><li> Approchez le neurone d&#39;intérêt avec la pipette de patch sur le côté et le dessus. Relâcher la pression positive lorsque la pipette se trouve sur la surface de la cellule (fossette visible sur la surface cellulaire) et d&#39;obtenir un &quot;gigaseal&quot; en appliquant une pression négative. </li><li> Appliquer davantage aspiration à la rupture de la pièce de membrane pour obtenir l&#39;enregistrement de cellules entières. Ensuite, à stimuler les fibres marquées avec la LED connectée en utilisant la longueur d&#39;onde appropriée pour activer chr (470 nm) lors de l&#39;enregistrement des réponses électriques provenant de la cellule. </li><li> Pour la stimulation synaptique commencer avec une faible intensité LED et augmenter jusqu&#39;à ce que l&#39;amplitude synaptique courant désirée est atteinte. Déclencher la LED en configurant sorties numériques dans le logiciel d&#39;acquisition de données pour contrôler la synchronisation et l&#39; impulsion de longueur (exemples de la figure3). Remarque: les appareils d&#39;autres logiciels et / ou TTL génératrices peuvent être utilisées pour déclencher LED. </li></ol></li><li> stimulation de répétition avec l&#39;ouverture ouverte ou restreinte (étape 3.4) dans la voie optique du microscope que désiré pour la cellule suivante enregistrée et / ou en présence de médicaments spécifiques. </li><li> Après l&#39;enregistrement, fixer des tranches pour l&#39;analyse post-hoc en les intercalant entre deux papiers filtres et les submergeant dans 4% PFA O / N. </li><li> Analyser les données électrophysiologiques. Remarque: Utilisez un logiciel approprié pour visualiser les données de balayage enregistrées pour chaque mode hors connexion de stimulation individuelle. Lors de l&#39;analyse des effets de la drogue, utiliser des routines de détection de pointe pour obtenir cours du temps de l&#39;effet du médicament sur les amplitudes de courant synaptiques pour tous les balayages individuels. Déterminer le moment où l&#39;effet du médicament atteint l&#39;état d&#39;équilibre. Pour préparer les réponses moyennes représentatives pour les chiffres, utiliser un logiciel pour la moyenne ≥10 balayages individuels par condition expérimentale (cf Figure 3B-D, FH, J panneau de droite). Remarque: plusieurs logiciels alternatifs peuvent être utilisés pour l&#39;analyse des données. </li></ol> 4. Post-hoc Analyse des sites d&#39;injection <ol><li> Laver des tranches de sites d&#39;injection (étape 2.12) et les sites d&#39;enregistrement (si ré-imagerie est souhaitée, à l&#39;étape 3.7), trois fois dans du PBS. Ceci est réalisé en remplaçant à plusieurs reprises avec la solution PBS frais sur un agitateur rotatif à trois reprises pendant 10 min. </li><li> Préparer la solution d&#39;agar-agar 2% dans du PBS, et laissez-le refroidir à ~ 65 ° C. Placer les tranches à plat sur le fond d&#39;un petit 30 mm de diamètre plat de Pétri, incorporer des tranches dans l&#39;agar-agar et laissez-le refroidir jusqu&#39;à ce que solide. </li><li> Coller un bloc de gélose avec une tranche ou des tranches intégré à la scène d&#39;un vibratome et placer étape dans la chambre de coupe avec du PBS. </li><li> Relèvement des tranches à 70 um d&#39;épaisseur intégré. Facultatif: Après résection, les tranches peuvent être colorées, à savoir, avec Neurotrace pour révéler cytoarchitecture (figure 3A, C), et / ou by coloration par immunofluorescence pour YFP ou mCherry pour booster le signal de la protéine de fusion ChR. </li><li> tranches de montage sur des lames et lamelle avec un milieu de montage. Les sites d&#39;injection de l&#39; image et, si on le souhaite, également des tranches d&#39;image contenant des fibres dans les zones de projection en utilisant un microscope à fluorescence ou un microscope confocal à balayage laser microscope (Figure 2A-C). </li></ol>

<ol><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li>
<li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li>
<li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li>
<li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices%2C+ventral+hippocampus%2C+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li>
<li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li>
<li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li>
<li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala%3A+implications+for+fear+and+emotional+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64(2014).</li>
<li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li>
<li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin%2C+parvalbumin%2C+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li>
<li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li>
<li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li>
<li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8%2C+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li>
<li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li>
<li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li>
<li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li>
<li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+channelrhodopsin-2+%28ChR2%29+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole décrit une méthode ex vivo enquête optogenetic des circuits neuronaux et la connectivité locale qui peuvent être facilement mises en œuvre sur la plupart, sinon tous, debout tranche enregistrement patch-clamp configurations en les dotant d&#39;une ~ 470 LED au port de lumière épifluorescence nm. Un avantage majeur de la stimulation optogenetic des projections axonales en tranches est qu&#39;il permet l&#39;activation et l&#39;investigation des propriétés des connexions qui ne sont pas accessibles a...

des outils précis pour la visualisation et l&#39;activation simultanée de connexions spécifiques entre les zones du cerveau et des types spécifiques de neurones sont de plus en plus important dans la compréhension des fonctions cérébrales et des maladies connectivité fonctionnelle états sains sous-jacents. Idéalement, cela implique une enquête physiologique des propriétés synaptiques précises avec lesquelles identifiés neurones communiquent. Cela est particulièrement vrai pour les connexions entre les zones du cerveau qui ne peuvent être conservés dans une seule tranche de cerveau aiguë. Dans le passé, cela a été réalisé en grande partie dans des expériences séparées. D&#39;une part, les traceurs neuronaux injectés in vivo ont été employés combinée à la lumière ultérieure ou de l&#39; analyse au microscope électronique des partenaires pré- et post - synaptiques. D&#39;autre part, lorsque des faisceaux de fibres à partir de la région d&#39;origine sont conservées et accessibles dans la préparation de tranches, la stimulation électrique a été utilisé pour évaluer les mécanismes de communication synaptiques avec des cellules dans la région cible,. Avec l&#39;avènement de l&#39; optogénétique, l&#39;expression ciblée de cations-canaux de lumière-gated, comme Channelrhodopsins (CHRS) fusionnée à des protéines fluorescentes, permet désormais l&#39; activation des neurones et de leurs trajectoires axonales tout en permettant leur visualisation et l&#39; analyse post-hoc anatomique 1- 4. Parce que les axones ChR exprimant peuvent être stimulés même quand il est coupé du parent somata 5, il est possible dans le cerveau des tranches à: 1) évaluer les contributions des régions du cerveau qui ne sont pas accessibles avec une stimulation électrique classique parce que des faisceaux de fibres ne sont pas séparables ou la trajectoire spécifique On ne sait pas; 2) d&#39;identifier sans équivoque la région d&#39;origine pour les entrées spécifiques qui ont été postulées mais incomplètement comprises; et 3) étudier la connectivité fonctionnelle entre les types cellulaires définis, à la fois localement et dans les projections à long terme. En raison d&#39;un certain nombre d&#39;avantages, cette cartographie optogenetic de circuits dans des tranches de cerveau est devenu largely utilisé dans les dernières années, et une variété de vecteurs viraux pour l&#39;expression de CHRS fluorescence marqués sont facilement disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Quelques avantages clés d&#39;activation optogenetic sur la stimulation électrique conventionnelle ne sont pas des dommages aux tissus en raison de placement des électrodes de stimulation, la spécificité de la stimulation de la fibre parce que la stimulation électrique peut également recruter des fibres de passage ou d&#39;autres cellules voisines, et une stimulation aussi rapide et temporellement précis. En outre, l&#39; injection stéréotaxique de vecteurs viraux peut facilement être ciblée sur des zones spécifiques du cerveau 6 et une expression spécifique conditionnelle ou de type cellulaire peuvent être réalisés en utilisant l&#39; expression Cre dépendant et / ou des promoteurs spécifiques 7. Ici, cette technique est appliquée pour la cartographie de longue portée et de circuits locaux dans le système de la peur. L&#39;amygdale est une région clé pour l&#39; acquisition et l&#39; expression de la peur, et le stockage de la peur et de souvenirs émotionnels 8,9. Outre from l&#39;amygdale, le cortex médial préfrontal (CPFm) et de l&#39; hippocampe (HC), des structures qui sont réciproquement connectés à l&#39;amygdale, sont impliqués dans les aspects de l&#39; acquisition, la consolidation et la récupération de la peur et d&#39; extinction des souvenirs 10,11. L&#39; activité dans les subdivisions de la CPFm semble jouer un double rôle dans le contrôle de la peur à la fois haute et basse déclare 12,13. Cela pourrait être en partie médiée par des liaisons directes de CPFm à l&#39;amygdale qui permettrait de contrôler l&#39;activité de l&#39;amygdale et de sortie. Par conséquent, au cours des dernières années, plusieurs études ont commencé en ex vivo des expériences de tranche pour étudier les interactions synaptiques entre afférences MPFC et les cellules cibles spécifiques dans l&#39;amygdale 14-17. Au cours de l&#39;apprentissage de la peur, l&#39;information sensorielle au sujet conditionné et inconditionné stimuli atteint l&#39;amygdale via des projections des régions thalamiques et corticales spécifiques. Plasticité de ces entrées pour les neurones dans la partie latérale (LA) du BASOLamygdale ateral (BLA) est un mécanisme important qui sous - tend la peur conditionné 9,18. Des preuves croissantes suggèrent que les processus de plastique parallèles dans l&#39;amygdale impliquent des éléments inhibiteurs pour contrôler la peur mémoire 19. Un groupe de neurones inhibiteurs en cluster sont les GABAergiques paracapsular intercalés cellules médiales (de mpITCs), mais leur connectivité et la fonction précise est incomplètement compris 20-22. Ici, la cartographie du circuit optogenetic est utilisé pour évaluer afférentes et efférentes la connectivité de ces cellules et leur impact sur ​​les neurones cibles dans l&#39;amygdale, ce qui démontre que mpITCs reçoivent l&#39; entrée sensorielle directe des stations de relais thalamiques et corticales 23. expression spécifique de ChR en mpITCs ou neurones BLA permet la cartographie des interactions locales, révélant que mpITCs inhibent, mais sont également mutuellement activé par, BLA principaux neurones, les plaçant dans des circuits inhibiteurs feed-forward et de rétroaction nouvelles qui contrôlent efficacement l&#39;activité de BLA23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>peut être remplacé par un autre cadre stéréotaxique pour souris</td></tr><tr><td>Steretoxic frame</td><td>mouse adaptor Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>peut être remplacé par un autre cadre stéréotaxique pour souris</td></tr><tr><td>Masque d’anesthésie au gaz pour souris</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>n’est plus disponible, remplacé par le n° d’article 51609M</td></tr><tr><td>Dispositif d’injection sous pression, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, États-Unis</td><td>T25-2-900</td><td>d’autres dispositifs d’injection sous pression (par ex. Picospritzer) peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Kwik Fill capillaires en verre</td><td>World Precision Instruments, Allemagne</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’anesthésie, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Allemagne</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Thermocontroler and heating</td><td>pad FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette horizontal Modèle P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>Stérilisateur d’outils chirurgicaux P-1000</td><td></td></tr><tr><td>, Stérilisateur 75</td><td>Melag, Allemagne</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (sérotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, États-Unis</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (sérotype 2/9)&nbsp ;</td><td>Penn Vector Core, États-Unis</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (sérotype 2/1)&nbsp ;</td><td>Penn Vector Core, États-Unis</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>vert rapide</td><td>Roth, Allemagne</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Anesthésique isoflurane, Isofurane CP (1ml/ml)</td><td>CP Pharma, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptique, Bétadine (providone iodée)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>peut être remplacé par d’autres désinfectants</td></tr><tr><td>Analgésique, Solution Metacam (5mg/ml méloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Allemagne</td><td></td><td>peut être remplacé par d’autres analgésiques</td></tr><tr><td>Bepanthen pommade oculaire</td><td>Bayer, Allemagne</td><td>0191</td><td>peut être remplacé par d’autres pommade oculaire</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 et SNIH1681)</td><td>Nouvag, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture</td><td>Needle Fine Science Tools, Allemagne</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Tressed Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Allemagne</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Enregistrements, stimulation lumineuse et analyse</td></tr><tr><td>artificial céphalo-rachidien (ACSF)</td><td>pour la composition, voir les références #16 et #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solutions de patch interne</td><td>pour la composition, voir les références #16 et #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td><td>Roth, Allemagne</td><td>P027.1</td><td>préparer une solution mère de 2M dans purifiée Trancheuse à eau</td></tr><tr><td>, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Allemagne</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Unité de refroidissement pour trancheuse à tissus, CU65</td><td>Fisher Scientific, Allemagne</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Lame saphir</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>commande personnalisée, renseignez-vous auprès de la société</td></tr><tr><td>Stéréoscope, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampe fluorescente Xcite (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Microscope patch, BX51WI</td><td>Olympus, Japon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur patch Multiclamp 700B&nbsp ;</td><td>Dispositifs moléculaires, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Dispositifs moléculaires, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel PClamp, Version 10</td><td>Dispositifs moléculaires, États-Unis</td><td></td><td>utilisés pour contrôler l’acquisition et la stimulation</td></tr><tr><td>de données Régulateur de température de bain, TC05</td><td>Luigs & Neumann, Allemagne</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur à trois axes Mini 25</td><td>Luigs & Neumann, Allemagne</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de micromanipulateur SM7</td><td>Luigs & Neumann, Allemagne</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>capillaires en verre pour pipettes patch</td><td>World Precision Instruments, Allemagne</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre en nitrate de cellulose pour chambre d’interface&nbsp ;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Allemagne</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>Unité LED, CoolLED pE</td><td>CoolLED, UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLED ou USL 70/470 et les adaptateurs appropriés sont deux choix alternatifs pour la stimulation LED</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED ou USL 70/470 et les adaptateurs appropriés sont deux choix alternatifs pour</td></tr><tr><td>l’unité LED de stimulation LED, USL 70/470</td><td>Rapp Optoélectronique</td><td>L70-000</td><td>CoolLED ou USL 70/470 et les adaptateurs appropriés sont deux choix alternatifs pour la stimulation LED</td></tr><tr><td>Adaptateur à double port</td><td>Rapp Optoélectronique</td><td>renseignez-vous auprès de la société</td><td>CoolLED ou USL 70/470 et les adaptateurs appropriés sont deux choix alternatifs pour la stimulation LED</td></tr><tr><td>Jeu de filtres rouge (excitation)</td><td>AHF, Allemagne</td><td>F49-560</td><td>Les filtres peuvent être achetés en kit F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (séparateur de faisceau)</td><td>AHF, Allemagne</td><td>F48-585</td><td>Les filtres peuvent être achetés en kit F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (émissions)</td><td>AHF, Allemagne</td><td>F47-630</td><td>Les filtres peuvent être achetés en kit F46-008</td></tr><tr><td>Jeu de filtres vert (excitation)</td><td>AHF, Allemagne</td><td>F39-472</td><td>Alternatives : jeu de filtres F36-149 ou F46-002 (avec émission passe-bande)</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (séparateur de faisceau)</td><td>AHF, Allemagne</td><td>F43-495W</td><td>Alternatives : jeu de filtres F36-149 ou F46-002 (avec émission passe-bande)</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (émissions)</td><td>AHF, Allemagne</td><td>F76-490</td><td>Alternatives : jeu de filtres F36-149 ou F46-002 (avec émission passe-bande)</td></tr><tr><td>LaserCheck, wattmètre portable</td><td>Coherent, États-Unis</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, Version 6</td><td>Wavemetrics, USA</td><td></td><td>pour l’analyse des données électrophysiologiques, d’autres progiciels alternatifs peuvent également être utilisés&nbsp ;</td></tr><tr><td>Suite neuromatique de macros pour IgorPro</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>pour l’analyse de données électrophysiologiques, d’autres progiciels alternatifs peuvent également être utilisés.</td></tr><tr><td colspan="4">Analyse post hoc des injections et des projections</td></tr><tr><td>Poudre de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Roth, Allemagne</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 colorant Nissl fluorescent bleu</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar pour l’enrobage et la résection</td><td>Roth, Allemagne</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 30 x 10 mm pour l’enrobage</td><td>SPL Life Des alternatives scientifiques</td><td></td><td>peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Slides, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Allemagne</td><td>61303802</td><td>alternatives peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>des lamelles de recouvrement</td><td>R. Langenbrinck, Allemagne</td><td>3000302</td><td>alternatives peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Milieu de montage Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories, USA</td><td>H-1000</td><td>média de montage alternatif peut être utilisé</td></tr><tr><td>Filtre en nitrate de cellulose pour l’aplatissement coupes pour fixation</td><td>Satorius Stedim Biotech, Allemagne</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser LSM 710</td><td>Zeiss, Allemagne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogénétiques dissection de circuits peur en tranches cérébrales

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

approches optogénétiques sont maintenant largement utilisées pour étudier la fonction des populations de neurones et les circuits en combinant l&#39;expression ciblée des protéines activées par la lumière et la manipulation ultérieure de l&#39;activité neuronale par la lumière. Channelrhodopsins (CHRS) sont de cations canaux de lumière-dépendants et quand fusionné à une protéine fluorescente permet leur expression pour la visualisation et l&#39;activation simultanée de types cellulaires spécifiques et leurs projections axonales dans les zones définies du cerveau. Par injection stéréotaxique de vecteurs viraux, des protéines de fusion peuvent être constitutivement Chr ou sous certaines conditions exprimées dans des cellules spécifiques d&#39;une région du cerveau définie, et leurs projections axonales peuvent ensuite être étudiées anatomiquement et fonctionnellement par l&#39; intermédiaire de l&#39; activation ex vivo optogenetic dans des tranches de cerveau. Ceci est d&#39;une importance particulière lorsque l&#39;on cherche à comprendre les propriétés synaptiques des connexions qui ne pouvaient pas être traitées avec des approches classiques de stimulation électrique, ou dans l&#39;identification roman affele loyer et la connectivité efférente qui a déjà été mal comprise. Ici, quelques exemples illustrent comment cette technique peut être utilisée pour étudier ces questions à élucider les circuits liés à la peur dans l&#39;amygdale. L&#39;amygdale est une région clé pour l&#39;acquisition et l&#39;expression de la peur, et le stockage de la peur et de souvenirs émotionnels. De nombreuses preuves suggèrent que le cortex préfrontal médian (CPFm) participe à différents aspects de l&#39;acquisition de la peur et de l&#39;extinction, mais sa connectivité précise avec l&#39;amygdale commence à peine à être compris. Tout d&#39; abord, il est montré comment ex vivo activation optogenetic peut être utilisée pour étudier les aspects de la communication synaptique entre les afférences MPFC et les cellules cibles dans l&#39;amygdale basolatérale (BLA). En outre, il est illustré comment cette approche ex vivo optogenetic peut être utilisé pour évaluer les nouveaux modèles de connectivité à l&#39; aide d&#39; un groupe de neurones GABAergiques dans l&#39;amygdale, le pôle paracapsular intercalation de cellules (mpITC), à titre d&#39;exemple.

Cette section présente le flux de travail d&#39;une approche optogenetic ex vivo et des résultats représentatifs de différentes stratégies expérimentales pour étudier les propriétés physiologiques des projections sensorielles et modulateurs de longue portée à BLA et les neurones mpITC ainsi que les propriétés de connectivité locale entre mpITC et BLA. Après l&#39; injection stéréotactique du vecteur viral sélectionné ...

approches optogénétiques sont largement utilisés pour manipuler l&#39;activité neuronale et d&#39;évaluer les conséquences pour le fonctionnement du cerveau. Ici, une technique est décrit que , lors de l&#39; expression in vivo de l&#39;activateur optique channelrhodopsin, permet une analyse ex vivo des propriétés synaptiques de longue portée spécifique et les connexions locales dans les circuits neuronaux liés à la peur.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

L'objectif général de cette expérience est d'étudier les propriétés fonctionnelles et synaptiques des projections neuronales et des microcircuits à l'aide de l'optogénétique ex vivo. Cela inclut l'expression de la channelrhodopsine et son activation dans des projections spécifiques, combinée à des enregistrements en configuration patch-clamp. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les propriétés synaptiques de la connectivité locale et à longue distance au sein et entre les régions cérébrales.Ceci est illustré ici par l'étude des circuits neuronaux qui sous-tendent le comportement de peur. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'étudier des circuits et des synapses inaccessibles aux techniques classiques de stimulation électrique. En général, les personnes novices dans cette méthode devront relever le défi de réaliser toutes les étapes requises de manière optimale.Cela inclut le ciblage stéréotaxique des injections virales, l'identification du délai d'expression optimal pour la channelrhodopsine, la préparation de tranches cérébrales de bonne qualité, ainsi qu'une activation lumineuse stable et des enregistrements. Avant de commenc

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

La vidéo montre la génération de tranches d’amygdale inclinées à partir d’un cerveau de souris. Le cerveau est positionné à un angle sur la platine de l’échantillon de vibratome pour obtenir des coupes contenant l’amygdale et les axones du cortex préfrontal médian qui forment des connexions synaptiques avec l’amygdale. Les tranches de cerveau sont maintenues à la température physiologique afin de préserver le tissu pour d’autres expériences.

Génération de tranches d’amygdale inclinées à partir d’un cerveau de souris

Cette vidéo montre la préparation de fines tranches de cerveau coronal à partir d’un cerveau murin, exposant les régions amygdales riches en connexions synaptiques du cortex préfrontal médian. Les tranches sont ensuite récupérées dans du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné pour maintenir la viabilité neuronale.

Génération d’une tranche de cerveau coronaire exposant les régions de l’amygdale à partir d’un cerveau de souris

Cette vidéo décrit une méthode permettant d’imager et d’enregistrer simultanément l’activité électrique à partir de tranches de cerveau transgéniques contenant des protéines fluorescentes spécifiques aux neurones. La procédure consiste à maintenir la tranche de cerveau dans une chambre de perfusion avec du liquide céphalo-rachidien artificiel aéré, à utiliser une source lumineuse pour exciter des cellules marquées par fluorescence et à enregistrer les signaux électriques avec une sonde...

Surveillance optique et électrophysiologique simultanée de cellules neuronales dans des coupes de cerveau

Cette vidéo présente une procédure d’analyse de la connectivité synaptique entre le cortex préfrontal médian (mPFC) et les neurones de l’amygdale à l’aide de tranches de cerveau aiguës de l’amygdale de souris. Les neurones mPFC de ces souris expriment la channelrhodopsine fusionnée à une protéine fluorescente. Les channelrhodopsines facilitent l’afflux d’ions et la génération de potentiel d’action dans les neurones mPFC lors de l’activation de la lumière. Par conséquent, les neurones mPFC...

Visualisation et cartographie des voies neuronales dans une tranche de cerveau d’amygdale

Nous décrivons une méthode pour caractériser la topographie fonctionnelle et les propriétés synaptiques des circuits du cerveau antérieur en utilisant une approche optogénétique pour photostimuler les populations neuronales in vitro.

Photostimulation par balayage laser de circuits du cerveau antérieur ciblés optogénétiquement

Ce protocole décrit un ensemble de méthodes pour identifier la connectivité fonctionnelle spécifique de type cellulaire des entrées à longue portée des régions éloignées de cerveau utilisant des stimulations optogénétiques dans des tranches de cerveau ex vivo.

Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris

Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions du cerveau, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées chroniquement, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectuées.

Manipulation optogénétique de l’activité neuronale pour moduler le comportement chez les souris en mouvement libre

Les tranches de cerveau ex vivo peuvent être utilisées pour étudier les effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées aux entrées afférentes. L’optogénétique est utilisée pour activer indépendamment les afférences thalamocorticales et corticocorticales au néocortex non primaire, et les réponses synaptiques et réseau sont modulées avec l’isoflurane.

Activation optogénétique des voies afférentes dans les tranches de cerveau et modulation des réponses par des anesthésiques volatils

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

Le paradigme de la peur observationnelle évalue la congélation par procuration chez les rongeurs comme un modèle d’empathie affective. Cette procédure consiste à exposer des rongeurs observateurs à des démonstrateurs conspécifiques recevant des chocs de pied aversifs pour susciter des réponses de gel empathiques. En utilisant des tests de peur observationnels, les chercheurs peuvent étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents à l’empathie affective.

La peur observationnelle comme modèle d’empathie affective chez la souris

Découvrez l'optogénétique ex vivo pour disséquer les circuits neuronaux de la peur dans des tranches cérébrales. Cette méthode combine l'expression de channelrhodopsine et l'enregistrement patch-clamp pour analyser les propriétés synaptiques avec précision.

Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales

Explorer plus de vidéos