Name: Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Apprenez à visualiser le transport des acides biliaires dans les cellules vivantes à l'aide d'un capteur FRET codé génétiquement. Cette technique offre une résolution spatiale et temporelle élevée pour l'étude du métabolisme cellulaire.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l&#39;utilisation d&#39;un capteur d&#39;acide biliaire selon l&#39;invention génétiquement codé capable de contrôler la dynamique spatio-temporelles de transport de l&#39;acide biliaire dans des cellules vivantes. Ce biocapteur est constitué de protéines fluorescentes et céruléens citrine qui sont fusionnées à FXR LBD, en formant ainsi un capteur d&#39;acide biliaire à base de FRET (BAS). Le capteur acides biliaires est relativement simple et ...

Transfert Förster Resonance Energy (FRET) est largement utilisé pour acquérir une meilleure compréhension des fonctions cellulaires dans des cellules vivantes avec une résolution temporelle et spatiale 1. Dans FRET, de l&#39;énergie à partir d&#39;un fluorophore donneur excité est transférée à un fluorophore accepteur. L&#39;efficacité de FRET dépend fortement de la distance entre le fluorophore donneur et l&#39;accepteur et leur orientation et est donc une lecture sensible de changements conformationnels qui influent sur les deux fluorophores. Ce phénomène est exploité pour générer les biocapteurs à base de FRET pour l&#39;imagerie de petites molécules. Des changements dans la concentration peuvent être contrôlées comme des augmentations / diminutions dans le rapport de l&#39;intensité d&#39;émission de l&#39;accepteur par rapport au fluorophore donneur 2. Par exemple, les biocapteurs de calcium à base de FRET permettent pour la détection rapide et stable des concentrations de calcium libres dans les cellules 3 vivre. Autres avantages de biocapteurs basés-FRET sont l&#39;imagerie dans les cellules de vie simples, théritier non-invasivité, leur capacité à être ciblée sur différents types de cellules et compartiments cellulaires 4. De nombreux aspects de la dynamique des acides biliaires intracellulaire sont encore mal compris. Par exemple, on sait peu sur le mécanisme sous-jacent de la réglementation du transport des acides biliaires conjuguée et non conjuguée. Les techniques existantes pour surveiller ce transport font principalement l&#39;utilisation de journalistes basée luciférase, les acides biliaires, radiomarqués ou fluorescentes analogues des acides biliaires. Ce dernier nécessite une modification des acides biliaires, qui pourrait affecter leurs propriétés. Reporters luciférase ont une mauvaise résolution temporelle. En outre, ces techniques se traduisent par une perte de l&#39;échantillon et ne sont pas applicables pour l&#39;imagerie dans des cellules individuelles. Par conséquent, il serait avantageux d&#39;utiliser des méthodes qui permettent l&#39;imagerie cellulaire unique en direct de l&#39;activité de transport utilisant les biocapteurs FRET, d&#39;autant qu&#39;il comprend l&#39;avantage de la détection ratiométrique 5, 6. Bien que des variantes de CFP / YFP forme la plus fréquemment utilisée paires FRET, de nouvelles stratégies en utilisant Morange et mCherry portant des mutations auto-association-induisant ont conduit à une expansion de la boîte à outils FRET avec de nouveaux capteurs, y compris un capteur d&#39;acide biliaire décalée vers le rouge 7. Nous avons déjà créé un FRET capteur génétiquement codé bile acide (BAS), qui se compose d&#39;un fluorophore donneur (cerulean) et un fluorophore accepteur (citrine) qui sont fusionnés avec le récepteur de farnésoïde X (FXR) un domaine de liaison de ligand (FXR LBD) et un peptide contenant un motif LXXLL 8. Ce peptide associe à la FXR LBD d&#39;une manière dépendante de l&#39;acide biliaire. Lors de l&#39;activation de FXR, la distance entre citrine et céruléen va modifier en raison d&#39;un changement de conformation. Dans les lignées cellulaires de mammifères, des résultats d&#39;activation de FXR à une augmentation clairement détectable dans la citrine / rapport céruléen, tandis que le capteur purifiée travaille dans la direction opposée et conduit à un ratio de FRET diminué lors de l&#39;activation de FXR. Ce capteur (CytoBAS)permet la surveillance de la dynamique cytosoliques de l&#39;acide biliaire. Par addition carboxy-terminale de motifs de ciblage subcellulaire, la construction d&#39;BAS peut être ciblé vers le noyau (NucleoBAS) et les peroxysomes (PeroxiBAS), ce qui permet des mesures de concentrations d&#39;acides biliaires dans différents compartiments cellulaires. Bien que l&#39;ajout du motif de ciblage des peroxysomes ne porte pas atteinte à sa réactivité aux acides biliaires, cellules perméables FXR-ligands n&#39;a pas induit de changements de FRET PeroxiBAS intérieur peroxysomes 8. Comme la nature de cette différence est inconnue, le protocole ci-dessous se concentre sur CytoBAS et NucleoBAS. L&#39;utilisation de ce capteur de FRET codées génétiquement a été récemment démontrée dans des cellules contenant les transporteurs hépatique des acides biliaires Na + polypeptide / taurocholate co-transport (PNT) et de soluté organique transporteur alpha / bêta (8) OSTαβ. NTCP est l&#39;importateur hépatique de l&#39;acide biliaire principale et OSTαβ est une bile intestinale basolatéraletransporteur d&#39;acide qui peuvent fonctionner à la fois comme un importateur et exportateur dépend de la concentration gradient de l&#39;acide biliaire électrochimique 9, 10. Des données récentes ont montré que, lors du transport des acides biliaires par PNAT et / ou OSTαβ, les réponses robustes et rapides dans FRET rapport à la suite de l&#39;interaction ligand-FXR-LBD peuvent être observées. Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour les méthodes pour mesurer FRET telles que l&#39;analyse microscopique confocale de fluorescence et de tri des cellules activées (FACS), soulignons étapes critiques, résoudre les problèmes potentiels et de discuter des méthodes alternatives. L&#39;utilisation de ce capteur de FRET génétiquement codé, l&#39;interaction de l&#39;acide biliaire avec FXR-LBD peut être quantifié et surveillé directement dans les cellules vivantes et fournit un procédé simple et rapide de visualiser la dynamique et le transport de l&#39;acide biliaire en temps réel. Des plasmides d&#39;expression de mammifères codant pour CytoBAS NucleoBAS et sont disponibles commercialement. Par conséquent, ce biocapteur peut en outre contribuer à lacompréhension des transporteurs d&#39;acides biliaires ou des composés qui activent FXR et fournissent une connaissance plus approfondie de la biologie de l&#39;acide biliaire et de signalisation.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s modified Eagles media (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Glycémie élevée sans L-glutamine</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (pen/streptomycine)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (10x)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T-25</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T-175</td> revêtue de laminine <td>VWR international</td><td>392-0238</td> Plaque 6 puits <td>revêtue de laminine</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>734-0229</td> Boîte de 10 cm <td>recouverte de poly-L-lysine et de laminine</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Revêtue de laminine</td></tr><tr><td>Diéthylaminoéthyl (DEAE) - Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (PEI)&nbsp ;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (génétique) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre de clonage (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Milieu de culture Leibovitz</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td> Tube à fond rond en polystyrène <td>sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>(5 ml) Tube Facs</td><td>Falcon BD 352008</td><td></td><td>Sans bouchon, non stérile</td></tr><tr><td>Falcon 2 063 tubes (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Bouchon à pression, stérile</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 puits Coverglass</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Filtré au charbon de bois FBS</td><td>Life</td><td>technologies 12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Autres produits chimiques</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-fret codées génétiquement

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est devenu un outil puissant pour surveiller le repliement, l’interaction et la localisation des protéines dans les cellules uniques. Les biocapteurs reposant sur le principe de la FRET ont permis de visualiser en temps réel les événements de signalisation subcellulaire dans des cellules vivantes avec une haute résolution temporelle et spatiale. Ici, nous décrivons l’application d’un capteur d’acides biliaires (BAS) génétiquement codé qui se compose de deux fluorophores fusionnés au domaine de liaison du ligand du récepteur X FARNÉSOÏDE (FSTR-LBD), formant ainsi un capteur d’acides biliaires qui peut être activé par un grand nombre d’espèces d’acides biliaires et d’autres ligands FXR (synthétiques). Ce capteur peut être ciblé sur différents compartiments cellulaires, y compris le noyau (NucleoBAS) et le cytosol (CytoBAS) pour mesurer localement les concentrations d’acides biliaires. Il permet une quantification rapide et simple de l’afflux et de l’efflux d’acides biliaires cellulaires et de la distribution subcellulaire des acides biliaires endogènes sans qu’il soit nécessaire de les marquer avec des marqueurs fluorescents ou des radionoyaux. De plus, les capteurs FRET BAS peuvent être utiles pour surveiller la liaison du ligand FXR. Enfin, nous montrons que ce biocapteur FRET peut être combiné avec l’imagerie d’autres fluorophores spectralement distincts. Cela permet une analyse combinée de la dynamique des acides biliaires intracellulaires et i) de la localisation et/ou de l’abondance des protéines d’intérêt, ou ii) de la signalisation intracellulaire dans une seule cellule.

Le capteur FRET-BAS présenté est basé sur le domaine de FXR (LBD-FXR) de liaison de ligand attaché à deux fluorophores citrine et bleu azur) et un motif LXXLL. Ce capteur permet les enquêtes sur le transport des acides biliaires dans les cellules avec une résolution spatiale et temporelle (figure 1 A) vivre. Des mutations dans cerulean citrin et ont été appliquées à promouvoir la formation du complexe intramoléculaire (fi...

Nous fournissons un protocole détaillé pour étudier la dynamique des acides biliaires dans les cellules vivantes à l’aide d’un capteur BAS FRET génétiquement codé. Ce capteur d’acides biliaires représente un outil unique pour étudier (la régulation du) transport des acides biliaires et l’activation du FXR dans un large éventail de types de cellules.

Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser un capteur d’acide biliaire FRET génétiquement codé pour visualiser facilement le transport et la dynamique des acides biliaires avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Ce capteur peut répondre à des questions métaboliques clés, telles que la relation entre les biles et la dynamique du glucose, des lipides et du métabolisme énergétique. Le principal avantage de cette technique est que le transport des acides biliaires peut désormais être directement surveillé vers des cellules vivantes uniques sans qu’il soit nécessaire de marquer les acides biliaires.Cette méthode peut donner un aperçu du transport et de la dynamique des cellules et des acides biliaires. Il peut également être utilisé pour visualiser les effets ou l’activation et des cellules vivantes uniques, ou pour combiner l’imagerie de la localisation des protéines et du transport des acides biliaires. Le capteur d’acide biliaire génétiquement codé, ci-après, le capteur, se compose d’un fluorophore céruléen donneur et d’un fluorophore citrine excepteur.Les deux fluorophores sont liés par le domaine de liaison du ligand du récepteur des acides biliaires nucléaires FXR, fusionné à un cofacteur FXR, le peptide. Deux changements d’acides aminés modifiés dans les deux fluorophores favorisent les interactions intermoléculaires entre le céruléen et la citrine. Deux constructions différentes portant le capteur sont utilisées.Dans une construction, le capteur contient le signal de localisation nucléaire c-terminal et, par conséquent, s’accumule dans le noyau. Dans l’autre construction, le capteur n’a aucune séquence de ciblage et se localise donc dans le cytoplasme. Le protocole vidéo suivant se concentre sur la façon d’imager le capteur dans des cellules vivantes.Le protocole textuel couvre comment concevoir des cellules qui expriment le capteur et comment les analyser davantage par des faits. En préparation de l’imagerie des cellules, plaquez les cellules qui expriment le capteur à la densité souhaitée dans une lame stérile à huit puits, dans un milieu de culture complet. Lorsque les cellules ont atteint une confluence de 60 à 70 %, procédez à l’expérience.Lavez une fois les cellules qui adhèrent à la lame de chambre avec 200 microlitres de 1x PBS ou Leibovitz L-15 Culture Medium. Ensuite, aspirez la solution et remplacez-la par 300 microlitres de milieu de culture Leibovitz L-15 afin qu’aucun contrôle de CO2 ne soit nécessaire. Si l’on utilise du DMEM avec du rouge phénolique, au lieu du Leibovitz L-15, prévoyez de garder une trace du PH pendant la collecte des données, car le capteur est sensible au PH. Ensuite, préparez des dilutions des composés à utiliser dans l’expérience à des concentrations de 3x à 5x, y compris GW4064 et TCDCA.Préparez-vous à ajouter des aliquotes de 50 à 100 microlitres pendant l’imagerie, afin que les solutions soient rapidement mélangées dans la chambre à lames. Maintenant, démarrez le logiciel d’imagerie d’un microscope confocal et allumez le laser. Le microscope doit être équipé d’un objectif à huile 63x, d’une chambre d’incubation à 37 degrés Celsius et d’un laser violet de 405 nanomètres.Ensuite, ajustez les paramètres du microscope. Réglez le mode d’acquisition sur XYT pour l’imagerie en accéléré d’un seul plan focal. Réglez le taux d’acquisition d’image sur des intervalles de 20 secondes, afin que des composés puissent être ajoutés pendant les pauses.Assurez-vous également de définir la plage spectrale pour une détection de mission. Concentrez-vous sur les cellules à l’aide de la transillumination. Ensuite, dans la commande logicielle, dessinez des cercles pour définir les régions d’intérêt.Sélectionnez des cellules avec des intensités de floraison similaires et une taille et une forme normales. Ne tracez pas trop près du périmètre de la cellule. Ensuite, commencez à prendre des mesures.Prenez note de leur valeur et continuez à prendre des mesures jusqu’à ce que la florescence céruléenne et citrine se soit stabilisée. Une fois la stabilité de la fluorescence atteinte, ajoutez 50 à 100 microlitres d’acides biliaires ou d’autres composés à des moments choisis pendant la mesure. Évitez le bord de la chambre lors du pipetage et ajoutez le liquide lentement.L’exécution correcte de cette étape est essentielle à l’expérience. Encore une fois, laissez la fluorescence se stabiliser avant de continuer. Terminez l’expérience en ajoutant soigneusement 100 microlitres de GW4064 pour une concentration de cinq à 10 micromolaires.Continuez à enregistrer jusqu’à ce que la floraison se soit stabilisée à nouveau. Ensuite, enregistrez l’expérience et exportez les données sous forme de fichier avi. Ouvrez les fichiers avi enregistrés dans l’image J en sélectionnant plugins, stacks, stack interleaver.Ensuite, cliquez sur modifier, sélectionner et ajouter au gestionnaire pour ouvrir la fenêtre du gestionnaire RLI. Ensuite, basculez l’option Afficher tout. Avec l’outil de sélection ovale, dessinez quelques zones d’intérêt qui couvrent des cellules spécifiques.Ne vous approchez pas du périmètre des cellules, car celles-ci subiront probablement une dérive focale ou une migration. Dessinez également un cercle dans une zone à l’extérieur des cellules pour déterminer le signal d’arrière-plan. Une zone à l’intérieur d’une cellule qui n’exprime pas le capteur peut également être utilisée.Maintenant, sélectionnez un retour sur investissement, puis cliquez sur plugins, puis sur ratio profiler. Trois écrans apparaîtront. RAW, ratio et profil de rapport.La fenêtre RAW montre l’augmentation de l’intensité de la citrine sous la forme d’une ligne bleue, et une diminution du céruléen sous la forme d’une ligne rouge, s’il y a FRET. La fenêtre du rapport affiche des informations sur le rapport citrine/céruléen, qui augmentera avec une augmentation du FRET. La fenêtre du profil de rapport affiche les valeurs des mesures d’intensité fluorescente dans les deux canaux.Si des fichiers de configuration spécifiques au microscope sont utilisés, l’ordre des canaux peut apparaître inversé. Maintenant, copiez les données de la fenêtre du profil de ratio dans une feuille de calcul pour l’analyse statistique. Ensuite, procédez à la même chose pour tous les autres retours sur investissement sélectionnés ainsi que pour le retour sur investissement en arrière-plan.Une expérience FRET quantitative basée sur l’intensité quantitative de cellules vivantes a été réalisée sur des cellules U2OS exprimant le capteur et dépourvues de transporteurs endogènes d’acides biliaires. Les cellules ont été traitées avec de la TCDCA. Cela n’a entraîné aucun changement dans le FRET.Lorsque les cellules ont été traitées avec GW4064, le rapport citrine/céruléen moyen a considérablement augmenté. Pour démontrer que le capteur peut être combiné avec d’autres protéines, des cellules U2OS co-exprimant le capteur avec NTCP et OST alpha-bêta ont été conçues. Ils ont montré une nette augmentation du rapport citrine/céruléen lors de l’ajout à TCDCA et GW4064.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser la dynamique des acides biliaires à l’aide du capteur d’acides biliaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure. Cette procédure peut facilement être étendue pour inclure plus d’informations d’imagerie, telles que la localisation subcellulaire de votre protéine d’intérêt.Tant que la longueur d’onde de cette protéine est différente de celle du capteur. Pour éviter le photoblanchiment, il est important de garder le capteur exprimant les cellules dans l’obscurité autant que possible.

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Dans ce protocole vidéo, nous suivons - à grande vitesse et en trois dimensions - des lysosomes marqués par fluorescence dans des cellules vivantes, en utilisant la méthode de suivi orbital dans un microscope à deux photons modifié.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

Cet article décrit la surveillance en temps réel de l’ablation HIFU dans le foie canin avec une imagerie par ultrasons à fréquence d’images élevée utilisant l’imagerie divergente et l’imagerie à ondes planes. L’imagerie du mouvement harmonique pour les ultrasons focalisés est utilisée pour imager la diminution du déplacement induit par la force de rayonnement acoustique dans la région ablatée.

Suivi en temps réel de haute intensité ultrasons focalisés (HIFU) Ablation de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Livers Utilisation mouvement harmonique Imaging pour ultrasons focalisés (HMIFU)

Apprenez à visualiser le transport des acides biliaires dans les cellules vivantes à l'aide d'un capteur FRET codé génétiquement. Cette technique offre une résolution spatiale et temporelle élevée pour l'étude du métabolisme cellulaire.

Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement (Vidéo) | JoVE Journal

Surveillance en temps réel des intracellulaire des acides biliaires Dynamics en utilisant un capteur acides biliaires base-FRET codées génétiquement

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