Name: La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Apprenez la culture de cellules souches pluripotentes et neurales dans un système clos garantissant stérilité maximale et conditions atmosphériques contrôlées. Cette méthode conforme aux bonnes pratiques cGMP/cGLP offre reproductibilité optimale.

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Les auteurs tiennent à remercier le personnel de Biospherix pour leur aide à apprendre à utiliser le système de culture cellulaire XVIVO clos, en particulier Matt Freeman; le personnel de Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. pour leur travail dans la mise en place de l&#39;infrastructure de laboratoire, en particulier Russ Hughes; le personnel de l&#39;Hôpital pour enfants du département Orange County des installations et des services de soutien pour leur travail dans la coordination de la rénovation de laboratoire, en particulier Adam Lukhard et Devin Hugie; le personnel de l&#39;Hôpital pour enfants du département Orange County des systèmes d&#39;information pour leur aide dans la mise en place de l&#39;infrastructure de gestion des données et l&#39;accès à distance, en particulier Viet Tran; Hôpital du comté d&#39;Orange équipe de direction de l&#39;enfance pour leur soutien de longue date du projet, en particulier le Dr Maria Minon et Brent Dethlefs. Ce travail a été financé par l&#39;Hôpital pour enfants du comté d&#39;Orange et du California Institute for Regenerative Medicine par subvention TR3-05476 à PHS. Tous les auteurs ont contribué également à ce travail.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les cellules cultivées dans les CPF voient aucune modification des concentrations d&#39;oxygène ou de dioxyde de carbone qui se déplacent d&#39;incubateur pour chambre de traitement au microscope la chambre et le dos. Il est essentiel que les conditions dans chacune des chambres sont adaptées à l&#39;incubateur particulier dans lequel les cellules sont maintenues avant que les cellules sont retirées de l&#39;incubateur. L&#39;atmosphère à l&#39;intérieur de l&#39;appareil est continuellement filtré HEPA et peut être adaptée en ce qui concerne les concentrations d&#39;oxygène et de dioxyde de carbone. Les cellules peuvent être cultivées à des concentrations standard pour PSCs ou NNC, 5% et 9%, respectivement; ou des concentrations différentes peuvent être choisies pour différents types de cellules ou pour des expériences spécifiques. Ainsi, l&#39;appareil est alimenté par des sources constantes d&#39;oxygène de qualité médicale, le dioxyde de carbone et de l&#39; azote (figure 4). Tous les trois de ces gaz sont alimentés par des systèmes multiples spécifiques à gaz qui assurent un approvisionnement constant. L&#39;appareil est également alimenté par un mélange de gaz d&#39;étalonnage constitué par10% (± 0,01%), du dioxyde de carbone en oxygène. Les systèmes multiples sont logés à l&#39;extérieur du centre de production de cellules et les gaz sont acheminés dans l&#39;installation à travers le plafond. Le gaz d&#39;étalonnage est logé dans l&#39;établissement. L&#39;appareil est en outre fourni avec un vide, aussi à travers le plafond. L&#39;utilisation d&#39;un système de surveillance électronique et sans fil unités d&#39;envoi, les pressions de sortie de tous les collecteurs sont constamment surveillés. Dans le cas où aucune pression tombe hors de portée, les exploitants d&#39;installations de production de cellules sont automatiquement téléphonaient et notifiées telles que des mesures appropriées peuvent être prises. Les exigences de puissance de l&#39;appareil sont remplies par six dédiés 120 V circuits descendant du plafond et connectés aux générateurs de secours de l&#39;hôpital pour assurer un approvisionnement constant. Le fonctionnement du dispositif est contrôlé par le logiciel sur un ordinateur basé sur PC alimenté par une alimentation de secours. Ces arrangements d&#39;alimentation électrique et de l&#39;informatiqueveiller à ce que le système fonctionne en continu même en cas de défaillance du système d&#39;alimentation public. Le logiciel de commande de l&#39;appareil dispose d&#39; une interface graphique conviviale (figure 1) qui permet le contrôle des concentrations en oxygène et en dioxyde de carbone, ainsi que les pressions de température, d&#39; humidité et de la chambre. Les valeurs de tous ces paramètres sont enregistrés en continu pour fournir un enregistrement en cours d&#39;exécution de tous les paramètres de l&#39;appareil. Ces données sont sauvegardées sur un serveur distant chaque nuit pour protéger leur intégrité. L&#39;ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance par les utilisateurs administratifs pour évaluer et / ou modifier tout paramètre. En outre, l&#39;ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance, ce qui permet une évaluation interactive des paramètres de l&#39;appareil et le dépannage des utilisateurs locaux. Une alarme unité d&#39;envoi supplémentaire est connecté à l&#39;appareil de telle sorte que les exploitants d&#39;installations de production de cellules sont informés de toute condition hors de portée de l&#39;appareil. L&#39;accès à distance capacités permettent de vous connecter et évaluation des spécificités de la condition hors de portée. L&#39;appareil est réalisé sous la forme d&#39;un système modulaire, aussi bien dans une macro et micro-sens. Les modules de culture de cellules individuelles, telles que des incubateurs et des chambres de traitement, peuvent être adaptés en ce qui concerne leurs dimensions et des exigences, ainsi que dans leur disposition par rapport à l&#39;autre. En outre, la plupart des fonctions de contrôle des modules individuels sont eux-mêmes modulaires tels que les différents contrôleurs de gaz atmosphériques, par exemple, peuvent être facilement remplacés sans interruption importante du système. des chambres de traitement spécialisées, comme une pour la visualisation et la manipulation des cultures de cellules microscopiques, sont facilement adaptés au système. Deux contraste de phase et un microscope de fluorescence sont à l&#39; intérieur du système (figure 6) de sorte que les cellules peuvent être colorées en direct, et les colonies peuvent être disséqués dans les mêmes conditions atmosphériques à l&#39; intérieur de til incubateurs. Acheminement des câbles à travers des oeillets scellés dans les parois latérales de la chambre de traitement permet des équipements tels que des alimentations et des ordinateurs pour être gardés à l&#39; extérieur de l&#39;appareil, le plus souvent sur ​​un chariot (figure 6). Les chambres de traitement dans l&#39;installation de production de cellules ont un modèle de flux d&#39;air différent de GCS classiques. Dans les GCS classiques, le flux d&#39;air circule vers le bas à partir d&#39;un évent d&#39;échappement central et se divise en deux courants séparés qui sont ensuite repris par deux orifices d&#39;entrée différents dans la partie avant et arrière du plancher de l&#39;armoire. En revanche, le PCF a un seul évent dans la partie avant du plafond. L&#39;air circule vers le bas et vers l&#39;arrière de la chambre, où il est ensuite tiré vers le haut dans un conduit d&#39;admission. Bien que le PCF est intrinsèquement très propre, ce modèle de flux d&#39;air unique signifie que les techniciens doivent ajuster légèrement leur technique afin de réduire le risque de contamination. Comme avec un BSC classique, un laboratoire travailleur should éviter de placer leurs mains ouvertes en amont des plaques de culture cellulaire et des bouteilles de médias. Cependant, la direction qui est en amont a été modifié dans le CPF Le laboratoire de l&#39;installation de production de cellule elle-même est assez standard et est équipé d&#39;un -20 ° C congélateur, -80 ° C congélateur, un réfrigérateur C 4 °, une centrifugeuse et un bain d&#39;eau. Le laboratoire dispose également d&#39;un évier avec des commandes de pied pour une utilisation mains-libres pratique. Pour ce laboratoire pour devenir une installation clinique fonctionnelle de production de cellules, cependant, plusieurs modifications supplémentaires doivent encore être apportées. Tout d&#39;abord, l&#39;appareil lui-même doit être mis à niveau pour avoir la capacité de surveiller les composés organiques volatils, les particules et les concentrations de dioxyde de chlore qui est utilisé pour la décontamination. D&#39;autre part, une chambre de traitement contenant une machine FACS peut être logé et connecté au reste de l&#39;appareil par l&#39;intermédiaire d&#39;un module de mémoire tampon. Cela permettra de triage des cellules et la purification de trpopulations de cellules ansplantable dans les conditions environnementales appropriées. Enfin, l&#39;ensemble de l&#39;appareil doit être installé dans un mur souple chambre propre. Ceci fournit une Organisation internationale de normalisation (ISO) classe 8 environnement pour l&#39;appareil 5. La stérilité élevée et la nature contrôlé par ordinateur du PCF en fait un système idéal pour les applications futures avec la thérapie et de bons procédés de fabrication à base de cellules. Le risque de contamination est considérablement atténué, mais plus important encore, les conditions de l&#39;expansion des cellules sont automatiquement enregistrées et archivées par le système informatique. Déviations des concentrations de gaz, la température, l&#39;humidité et tous les événements d&#39;accès dans le système sont rigoureusement documentés. Cela peut grandement aider lors d&#39;enquêtes sur des problèmes de qualité du produit. Cependant, il y a encore des limites. L&#39;utilisation de tout et de tous les réactifs et les fournitures (par exemple, les composants de médias, pipettes, plaques) doit être documenté séparément. Ajouteritionally, il existe une multitude de problèmes potentiels (y compris de nombreuses formes de l&#39;erreur humaine) qui peuvent survenir, qui sont sans aucun rapport avec les variables documentées par le système de surveillance de la CPF. Ainsi, la nécessité d&#39;un personnel hautement qualifié et la documentation manuelle détaillée des tâches reste en place.

Les techniques standard de culture de cellules souches souffrent de plusieurs contraintes environnementales qui exercent des contraintes excessives sur les cellules et les exposent à des risques inacceptables de contamination. Parmi les stress que les cellules peuvent supporter dans des conditions de culture cellulaire standard, on trouve des changements précipités dans les niveaux de concentrations de dioxyde de carbone et d’oxygène3,4. Cela se produit lorsque les cellules sont déplacées de l’incubateur à l’enceinte de biosécurité et/ou au microscope, ce qui peut ne pas être optimal pour les cellules. Des études antérieures ont confirmé les avantages de la culture de cellules souches pluripotentes et neurales dans des conditions hypoxiques4,11, et pour de meilleurs résultats, ces conditions doivent être continues. De plus, les risques de contamination cellulaire sont plus élevés car l’environnement et le personnel du laboratoire empiètent sur les cellules à presque chaque étape de leur culture et de leur manipulation. Les salles blanches traditionnelles constituent une méthode efficace pour réduire considérablement les risques de contamination, mais elles sont coûteuses, ont une empreinte importante et ne parviennent pas à résoudre les facteurs de stress liés aux concentrations de dioxyde de carbone et d’oxygène. 
Une installation de production de cellules capable de gérer à la fois les risques de contamination et les concentrations de gaz et qui peut être qualifiée pour répondre aux critères cGMP9 fournit des cellules de haute qualité pour la recherche scientifique fondamentale ainsi que pour les applications cliniques1,6,7. Une telle installation de production cellulaire se compose, au minimum, des éléments suivants : une chambre de traitement, qui agit comme un espace de travail chauffé pour l’alimentation et la manipulation des cultures cellulaires ; une hotte à flux laminaire, pour la stérilisation initiale des réactifs, des tubes et des outils ; deux chambres de sas tampons entre la hotte et la chambre de traitement ; deux incubateurs de culture cellulaire accessibles depuis la chambre de traitement ; une chambre de microscope adjacente à la chambre de traitement ; et enfin, des logiciels informatiques pour définir et surveiller les conditions à l’intérieur de ces modules. À l’aide de cette infrastructure de base, une grande variété de tâches peuvent être effectuées, telles que l’alimentation et le passage standard de cellules souches pluripotentes et de cellules souches neurales multipotentes, ainsi que des méthodes plus spécialisées telles que la reprogrammation basée sur le virus Sendai, les études de migration in vitro et la différenciation des cellules souches neurales pour la caractérisation électrophysiologique.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>sur</td><td></td> mesure</tr><tr><td>Xvivo Logiciel</td><td>Biospherix</td><td>version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Collecteur</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Collecteur</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope avec caméra DP21 et fluorescence</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td><Réactifs > forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Supplément StemPro hESC</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone de sodium tamponné au phosphate</td><td></td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes 2</td><td>R& D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation cellulaire à base de Hank’s Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Anticorps</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Anticorps Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Anticorps</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Supplément sérique</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td><Société></> </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Supplies Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Pipette sérologique</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipette sérologique</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipette sérologique</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 25 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Pipette sérologique</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Flacon T25</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Flacon T-75</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l pointes de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; l pointes de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1 000 pointes de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

la culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Cet article décrit comment utiliser un système de culture cellulaire fermé fabriqué sur mesure et disponible dans le commerce pour la recherche fondamentale et préclinique. Les enceintes de biosécurité (BSC) et les incubateurs sont depuis longtemps la norme pour la culture et l’expansion des lignées cellulaires pour la recherche fondamentale et préclinique. Cependant, comme de nombreux laboratoires de cellules souches passent de la recherche fondamentale à l’application clinique, des exigences supplémentaires sont nécessaires pour le système de culture cellulaire. Tous les processus doivent être bien documentés et présenter des exigences exceptionnelles en matière de stérilité et de reproductibilité. Dans les incubateurs traditionnels, les concentrations de gaz et les températures fluctuent considérablement chaque fois que les cellules sont retirées pour l’alimentation, le passage ou d’autres manipulations. De telles interruptions contribuent à un environnement qui n’est pas la norme pour les directives cGMP et GLP. Ces interruptions doivent être minimisées, en particulier lorsque les cellules sont utilisées à des fins thérapeutiques. La motivation pour passer du système standard des BSC et des incubateurs à un système fermé est que ces interruptions peuvent être rendues négligeables. Les systèmes fermés offrent un espace de travail pour nourrir et manipuler les cultures cellulaires et les maintenir dans un environnement contrôlé où la température et les concentrations de gaz sont constantes. De cette façon, les cellules souches pluripotentes et multipotentes peuvent être maintenues en bonne santé depuis le moment de leur dérivation jusqu’à leur utilisation éventuelle en thérapie.

Ce manuscrit décrit en détail une installation de production de cellules, et les aspects uniques de la culture de cellules dans un système fermé. La majeure partie de l&#39;installation de production de cellules comprend un, appareil de culture de cellules ci-joint sur ​​mesure qui a un faible encombrement et peut être facilement logé dans un 6 x 7,5 m 2 pièces (Figure 2). A aucun moment, les cellules au sein de l&#39;appareil est exposé à du personnel de laboratoire ou de l&#39;environnement. L&#39;appareil est constitué de plusieurs modules: une chambre de traitement, une hotte à flux laminaire, 2 chambres tampon de sas entre le capot et la chambre de traitement, deux incubateurs de culture de cellules et une chambre de microscope adjacent à la chambre de traitement (figure 3). Le système est commandé par un logiciel permettant à des variables environnementales à être contrôlés et surveillés (figure 1). L&#39;ordinateur exécutant ce logiciel est sur une alimentation de secours. Les gaz sont introduits dans eSystème de courrier par un ensemble de collecteurs pour l&#39; oxygène, l&#39; azote et le dioxyde de carbone (figure 4). Les gaz de l&#39;appareil sont fournis par des systèmes multiples qui ont deux ensembles de réservoirs chacun - un ensemble actif et un ensemble de réserve. Lorsque l&#39;ensemble actif est tiré vers le bas, le collecteur commute automatiquement sur les réservoirs afin de remplacement de réserve fixé et le personnel. La puissance est un système de générateur de secours. Pluripotentes et les cellules souches neurales peuvent être cultivées dans des conditions hypoxiques dans cette installation en utilisant les protocoles précédemment développés 9, avec des complications supplémentaires inhérentes à l&#39;équipement selon l&#39;invention. Les cellules souches pluripotentes peuvent être obtenus en utilisant le virus Sendai, en utilisant des anticorps spécifiques de pluripotence pour identifier les colonies entièrement transfectées, qui sont ensuite isolés et élargis. (Figure 5A et B), A partir de ces CSPi, les cellules et les neurones souches neurales peuvent être obtenus en utilisant SMAD double inhibition, et leur phénotype vérifié usi<html> anticorps NSC-spécifiques ng (Figure 5C et D). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figure 1. Interface graphique pour l&#39;installation de production de cellules. (A) La représentation graphique de la CPF est l&#39;écran par défaut et correspond au dessin CAO montre la figure 3. Un clic de la souris sur le module tampon 1 (2F sur la figure 1) ouvre son écran de contrôle (B) où O 2 valeurs sont définies pour correspondre à la chambre de traitement (3 à la figure 3). De même, en cliquant sur ​​le processus de chambre ou Incubateur 1 apporte leurs écrans de contrôle respectifs (C et D, respectivement), où les valeurs peuvent être modifiés ou contrôlés selon le cas.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figure 2. Le mécanisme de production de cellules. (A) Le système tel que vu à partir d&#39; une vue de face à droite. Notez les connexions électriques et de gaz dans le plafond et le panier avec les accessoires de microscope et l&#39;ordinateur à droite. (B) La hotte à flux laminaire avec les portes d&#39;accès aux modules tampons vus à droite. (C) La chambre de traitement avec les deux incubateurs (portes noires) vu à l&#39;arrière. (D) Une vue à travers le côté droit du système montrant le microscope et surveiller les portes des chambres tampons vus dans la distance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figure 3. Un dessin CAO de l&#39;installation de production de cellules. Tous les éléments entrant dans le dispositif sont d&#39; abord essuyé avec de l&#39; alcool et séché dans la hotte à flux laminaire air (1). Les articles sont ensuite passés à l&#39;atmosphère appropriée dans le module frontal de la mémoire tampon (2F) avant d&#39; être passé dans le module UCPC ou d&#39;un processus de chambre (3). Les cellules sont cultivées dans les deux incubateurs (4, 5). Coloration de cellules vivantes, colonie cueillette, l&#39; évaluation de la morphologie cellulaire générale et une analyse de la migration a lieu dans le module UPC ou Microscope Chambre (6). Enfin, les déchets quitte le système par le biais du module tampon arrière (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figure 4. Sources de gaz et d&#39; énergie. (A) Le CO 2 collecteur est une configuration 4 x 4 car il fournit tous les incubateurs du laboratoire. (B) Le 2 O collecteur est une installation et des produits que l&#39;installation de production de cellules 2 x 2. Azote pour le système est généré dans un évaporateur (C, juste en dessous du signal de sortie) fixé à une tubulure d&#39;azote liquide (vers la droite) qui remplit automatiquement cryofreezers ( en bas à gauche). Le collecteur est une configuration 2 x 2 étant alimenté par deux paires de 160 L réservoirs d&#39;azote liquide. CO 2, O 2 et N 2 sont alimentés à partir du plafond à travers robinets d&#39; arrêt (D). vide House est également fourni à cet endroit. Vu juste derrière les shutoffs de gaz d&#39;alimentation sont une paire de câbles d&#39;alimentation qui alimentent le système.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figure 5. Cellules souches pluripotentes dérivées en hypoxie avec le virus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 CSPi CSPi (nomenclature trouvée dans Stover et al. 9), le contraste de phase 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 CSPi live-tachée de Tra-1-60 AF-594 marqué, dilution 1: 100 dans les médias. Tous les iPSCs ont été transduites dans l&#39;installation de production de cellules dans 5% de O 2 avec le virus Sendai. (C) en contraste de phase de NNC SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC dérivées, augmenté à 5% O 2 dans les diapositives de chambre. Les cellules ont ensuite été fixées dans du paraformaldéhyde 4% et colorées avec un anticorps primaire anti-nestine humaine et un anticorps secondaire Alex-488. Toutes les barres d&#39;échelle sont à 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Voici un protocole pour cultiver des cellules souches pluripotentes (CSP) et des cellules souches neurales (CSN) dans un système de culture cellulaire fermé qui permet une stérilité et une reproductibilité maximales, remplaçant l’enceinte de biosécurité et l’incubateur traditionnels. Cet équipement est conforme aux directives de bonnes pratiques de fabrication clinique (cGMP) et de bonnes pratiques de laboratoire clinique (cGLP).

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

L'objectif général de l'utilisation de cet équipement est de cultiver des cellules souches dans des conditions atmosphériques définies avec une stérilité maximale. Ce que nous allons démontrer aujourd'hui est l'utilisation d'une installation de culture cellulaire fermée qui permet un contrôle précis des paramètres de culture cellulaire. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette installation pour la culture de cellules souches multipotentes et de cellules souches pluripotentes.Le principal avantage de cette méthode est que les cellules sont exposées à un environnement constant, quel que soit leur emplacement pendant le traitement. Que ce soit lors de la manipulation des cellules, dans l’incubateur ou au microscope, leur exposition à l’oxygène, au CO2 et aux températures reste constante tout au long du cycle. La procédure sera démontrée par Alexander Stover, scientifique membre du personnel dans mon laboratoire.Pour commencer cette procédure, cliquez sur un module afin de régler la concentration de gaz. Dans la nouvelle fenêtre affichant les paramètres actuels, cliquez sur la valeur existante du point de consigne en dessous de « Setpoint » et saisissez la concentration d'oxygène requise pour ce module. Ensuite, cliquez sur la coche verte pour confirmer le point de consigne.Répétez cette procédure pour le dioxyde de carbone et saisissez une consigne de 5 % de dioxyde de carbone pour tous les modules, à l'exception des chambres tampons qui sont uniquement réglables pour l'oxygène. Ensuite, surveillez les concentrations actuelles de gaz, désignées comme valeurs de processus, afin de vous assurer qu'elles atteignent les nouvelles consignes. Par la suite, ajustez les consignes de gaz de tous les modules aux valeurs appropriées.Égaliser les niveaux de dioxyde de carbone et d'oxygène des chambres qui seront mises en contact. Par exemple, régler la chambre de traitement à 5 % d'oxygène avant d'ouvrir un incubateur qui cultive des cellules à 5 % d'oxygène. Régler également la chambre tampon utilisée pour introduire des éléments dans la chambre de traitement à 5 % d'oxygène.Ensuite, réglez la température de la chambre de traitement à 37 degrés Celsius à l’aide de l’écran utilisé précédemment pour les réglages des gaz. Réglez ensuite la température du plancher de la chambre de traitement à 37 degrés Celsius. Cliquez sur les blocs du module d’incubation situés sous chaque incubateur et ajustez la température des blocs à 37 degrés Celsius.Dans la hotte laminaire, vaporisez tous les matériaux destinés à entrer dans le système avec de l'éthanol à 70 % et laissez-les sécher. Essuyez délicatement les flacons ou les plaques contenant des cellules avec une compresse stérile saturée en éthanol à 70 %. Ensuite, assurez-vous que les portes extérieure et intérieure de la chambre tampon sont fermées hermétiquement, puis ouvrez la porte extérieure, placez les objets à l'intérieur et refermez-la.À l’aide du logiciel, sélectionnez le module tampon et cliquez sur l’onglet Facteur de dilution. Saisissez un dans la case Facteur logarithmique, puis cliquez sur Démarrer. Une fois que l’interface graphique a cessé de clignoter sur Facteur de dilution, ouvrez la porte intérieure de la chambre tampon et transférez les matériaux dans la chambre de traitement.Pour retirer des éléments de la chambre de traitement, assurez-vous d'abord que la chambre tampon a subi un facteur de dilution. Ensuite, ouvrez la porte intérieure, placez-y les éléments à retirer et refermez-la. Après cela, ouvrez la porte extérieure et retirez les éléments.Placer trois boîtes de Pétri dans le bac à eau à la base de chaque incubateur. Remplir ces boîtes avec de l'eau stérile et maintenir le niveau d'eau dans ces boîtes, car elles sont essentielles pour maintenir le point de consigne d'humidité relative dans l'incubateur. Dans l'interface graphique, cliquer sur l'incubateur.Ensuite, cliquez sur la valeur existante de l'humidité relative dans la consigne et saisissez 85 %. Puis, cliquez sur la coche verte pour valider cette valeur. Ajustez ensuite les chambres tampons, la chambre de traitement et un incubateur aux consignes de gaz requises pour le type de cellules à introduire. Nettoyez la surface de la chambre de traitement avec un pansement stérile et un désinfectant non inflammable, comme un produit à base de chlorure de benzalkonium.Ensuite, nettoyez les gants et les surfaces fréquemment touchées, comme les poignées de porte. Puis, nettoyez la surface de la hotte à flux laminaire et de la chambre tampon avec de l’éthanol à 70 % et laissez sécher. Après cela, placez le flacon ou la plaque de cellules dans la hotte et essuyez brièvement sa surface extérieure avec une compresse stérile imbibée d’éthanol.Ensuite, placez le flacon ou la plaque dans la chambre tampon et effectuez un facteur de dilution. Une fois l'opération terminée, transférez immédiatement le flacon ou la plaque dans l'incubateur approprié. Comme l'incubateur se trouve à l'arrière de la chambre de traitement, sortez un plateau dans la chambre de traitement pour y placer les cellules, et évitez d'ouvrir inutilement les portes de l'incubateur pendant de longues périodes.Dans cette étape, préparez le milieu de culture cellulaire. Laissez le milieu s'équilibrer avec les niveaux de dioxyde de carbone et d'oxygène présents dans le système en laissant le récipient contenant le milieu légèrement débouché pendant 20 minutes. Ensuite, retirez l'ancien milieu des puits.Pour les cellules souches pluripotentes, retirez presque tout l'ancien milieu en laissant une petite quantité d'ancien milieu afin d'éviter la dessiccation pendant le processus de renouvellement. Pour les cellules souches neurales, retirez la moitié de l'ancien milieu. Ensuite, ajoutez du milieu frais aux plaques de culture cellulaire et replacez les plaques dans l'incubateur désigné.Voici une image des CIP. Ci-dessous, les CIP vivantes colorées au colorant AF594 marqué Trial 160 avec une dilution au 1/100 dans le milieu. Toutes les CIP ont été transduites dans l'unité de production cellulaire en présence de 5 % d'oxygène à l'aide d'un virus de Sendai.Voici l'image en contraste de phase de cellules souches neurales dérivées de cellules souches pluripotentes induites, cultivées à 5 % d'oxygène dans des lamelles-chambre. Les cellules ont ensuite été fixées dans du paraformaldéhyde 4 % et marquées avec un anticorps primaire anti-nestine humaine et un anticorps secondaire Alexa Fluor 488. Une fois maîtrisé, cet ensemble de techniques peut être réalisé en deux heures si elles sont effectuées correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de régler correctement les concentrations de gaz avant de commencer. Après la procédure, d'autres méthodes telles que le reprogrammation et la différenciation peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'effet de l'hypoxie sur la pluripotence ou la multipotence. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pour explorer la production clinique de cellules destinées au traitement des troubles neurodégénératifs pédiatriques.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La capacité de manipuler humaine souches neurales / cellules précurseurs (hNSPCs) in vitro permet d'étudier leur utilité comme les greffes de cellules à des fins thérapeutiques et d'explorer le développement humain de neurones. Ce protocole présente une méthode de culture et de hNSPCs repiquage dans l'espoir de reproductibilité croissante de la recherche des cellules souches humaines.

Le repiquage des cellules souches humaines

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Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

La vidéo décrit la procédure de maintien d’un environnement contrôlé dans un poste de travail de culture cellulaire pour la croissance et l’entretien des cellules souches neuronales. Ces procédures impliquent la définition des conditions de la chambre, les protocoles de nettoyage et la préparation des milieux, ce qui permet de maintenir une stérilité et une reproductibilité maximales et de remplacer les méthodes traditionnelles.

Manipulation de cultures de cellules souches neuronales dans une installation de production cellulaire

Ici, nous présentons des protocoles de culture de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), basés sur la croissance de cellules uniques dissociées de type monocouche non colonie (NCM). Cette nouvelle méthode, qui utilise des inhibiteurs de kinases associés à Rho ou l’isoforme 521 de la laminine (LN-521), convient à la production de grandes quantités de hPSC homogènes, à la manipulation génétique et à la découverte de médicaments.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Ce protocole offre un moyen simple et efficace de propager des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain dans une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrats synthétiques spécifiques aux hPSC.

A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

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Apprenez la culture de cellules souches pluripotentes et neurales dans un système clos garantissant stérilité maximale et conditions atmosphériques contrôlées. Cette méthode conforme aux bonnes pratiques cGMP/cGLP offre reproductibilité optimale.

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique (Vidéo) | JoVE Journal

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

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