Name: Le séquençage de lusine mur hétéroxylanes Utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) Techniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Apprenez le séquençage des hétéroxylanes par marquage enzymatique et analyse par spectrométrie de masse et RMN. Cette méthode intégrée permet de caractériser les séquences glycosyles des parois végétales.

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Ce projet a été soutenu par des fonds du programme phare de recherche collaborative de l’Organisation scientifique et de recherche du Commonwealth, fourni au Cluster des céréales à haute teneur en fibres par l’intermédiaire du Food Futures Flagship. L’AB tient également à souligner le soutien d’une subvention du Conseil australien de la recherche (ARC) au Centre d’excellence de l’ARC sur les parois cellulaires végétales (CE110001007).

1. L&#39;étiquetage de la fin Réduire (RE) de sucre résidus de W-sol avec 2 AX-aminobenzamide (2AB) <ol><li> Incuber W-sol AX avec 2AB (0,2 M) en présence de 1 M de NaBH3CN (de cyanoborohydrure de sodium) (pH 5,5) pendant 2 heures à 65 ° C pour convertir les terminaisons réductrices des chaînes de polysaccharide du squelette de leurs dérivés fluorescents. ATTENTION: L&#39;étape suivante doit être effectuée dans la hotte comme NaBH 3 CN libère le gaz de cyanure toxique quand il est en contact avec l&#39; eau. <ol><li> Peser NaBH3CN (62,8 mg) et dissoudre dans de l&#39; eau (1 ml) dans un tube de microcentrifugation (1,5 ml) pour préparer une solution 1 M de NaBH3CN. Dissoudre le réactif 2AB (27,2 mg) dans 1 M de solution de NaBH3CN (1 ml) par chauffage à 65 &#160; ° C et on ajuste le pH du mélange réactionnel (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) à un pH de 5,5 avec de l&#39; acide acétique à 10%. </li><li> Ajouter 200 ul de mélange réactionnel (0,2 M 2AB, 1 M de NaBH3CN) à W-sol AX (1 mg) dans un tube de verre avec un bouchon et mélanger à l&#39;aide d&#39;un mélangeur à vortex. Incuber pendant 2 heures à 65 &#160; ° C dans une hotte. Refroidir la suspension à température ambiante et ajouter 4 vol. d&#39;éthanol absolu. </li><li> Placer la suspension dans un stockage à froid (4 ° C) O / N pour précipiter les polysaccharides. </li><li> Centrifugeuse (1500 x g, 10 min, température ambiante) pour éliminer le surnageant. Laver le culot abondamment avec de l&#39;éthanol absolu (4x), l&#39;acétone (1x) et de méthanol (1x), centrifuger entre chaque lavage. Aspirateur sec à 40 ° CO / N. Remarque: lavage étendue supprime également 2AB résiduel. </li></ol></li></ol> 2. Génération de Xylo-oligosaccharides de 2 AB labelisée W-sol AX <ol><li> Dissolve 2AB étiquetée W-sol AX (1 mg) dans 500 ul de tampon d&#39;acétate de sodium (100 mM, pH 5) dans un microtube (1,5 ml). Ajouter 4 unités de endoxylanase (GH 11, [M1]) et incuber à 37 &#160; ° C pendant 16 heures. </li><li> Détruisez l&#39;activité enzymatique en chauffant les mixt de réactionure pendant 10 minutes dans un bain d&#39;eau bouillante. Refroidir la suspension à la température ambiante et transfert à tube de verre avec un bouchon. Ajouter 4 vol. d&#39;éthanol absolu et placer la suspension dans un stockage froid (4 ° C) O / N pour précipiter des polysaccharides non digérés. </li><li> Centrifugeuse (1500 x g, 10 min, RT) pour séparer les polysaccharides non digérés (à granulés) et endoxylanase généré xylo-oligosaccharides (surnageant). Décanter le surnageant dans un tube de verre propre et le placer dans un bain d&#39;eau chaude (40 ° C). </li><li> S&#39;évaporer l&#39;éthanol sous un courant d&#39;azote gazeux à un volume de point final (~ 500 ul). Congeler le surnageant à -80 ° C pendant 4 heures et sécher le surnageant congelé dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides. </li></ol> 3. Génération de Xylo-oligosaccharides de KOH-sol AX et d&#39;étiquetage de 2AB <ol><li> Traiter KOH-sol avec endoxylanase AX (GH 11, [M1]) pour générer xylo-oligosaccharides comme décrit ci-dessus (sections 2.1-2.4). </li><li> Traiter endoxeylanase généré xylo-oligosaccharides à partir de KOH-sol avec AX mélange réactionnel 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) tel que décrit ci - dessus (sections 1.1.1-1.1.2). </li><li> Décanter le surnageant dans un tube de verre propre et le placer dans un bain d&#39;eau chaude (40 ° C). S&#39;évaporer l&#39;éthanol sous un courant d&#39;azote gazeux à un volume de point final (~ 500 ul). Congeler le surnageant à -80 ° C pendant 4 heures et sécher le surnageant congelé dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides. </li></ol> 4. MALDI-TOF-MS: <ol><li> Préparation de la solution-matrice MALDI <ol><li> Ajouter une petite boule de 2, l&#39;acide 5-dihydroxbenzoic (DHB) à 50% d&#39;acétonitrile (500 ml) contenant de l&#39;acide formique à 0,1% dans un tube (solution MALDI-matrice). Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex, si elle se dissout rapidement, ajouter une autre petite boule de DHB. Note: la concentration idéale de solution MALDI-matrice est de 10 ug / ul -1. </li></ol></li><li> Préparation de la plaque cible MALDI- <ol><li> Déposer le aqueonous oligosaccharides échantillons (natif) (5-10 ug) (W-sol et / ou KOH-sol) sur une plaque MALDI-cible. Ajouter la solution MALDI-matrice 0,3 ul en utilisant une pointe séparée et mélanger par pipetage de haut en bas. Laisser le mélange sécher à température ambiante. Remarque: les échantillons correctement séchées devraient consister en des cristaux en forme d&#39;aiguilles longues pointant vers le centre de la tache. Si le dépôt est collante et / ou smeary l&#39;échantillon peut être soit trop concentré ou sont constitués de sels, de tels dépôts ne sont pas susceptibles de produire de bons spectres et l&#39;échantillon doivent être purifiés davantage. </li><li> Introduire la plaque cible dans la source MS et fonctionner en (+ ive) le mode d&#39;ions positifs. Régler la tension d&#39;accélération à 19,0 kV à la source d&#39;ions 1 et 16,3 kV à la source d&#39;ions 2. Ajuster la puissance du laser à une valeur supérieure à 70%. Sélectionnez l&#39;endroit de l&#39;échantillon sur la plaque MALDI-cible et cliquez sur Démarrer pour commencer tirs laser. Note: Tous les domaines de la cible ne donneront pas les signaux. Un endroit particulier ne donnera un signal pour quelques coups de laser dues soit àl&#39;appauvrissement du mélange ou de caractéristiques du cristal échantillon / matrice. <ol><li> Déplacer le laser à différentes zones de la cible lors de l&#39;acquisition et de la moyenne d&#39;environ 200 spectres aléatoires pour obtenir le signal à bruit satisfaisant. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. ESI-QTOF-MS <ol><li> Analyser les oligosaccharides endoxylanase généré (natif) à l&#39;aide de nano-HPLC couplée à une ionisation par électronébulisation (ESI) Temps quadripolaire de vol (QTOF) SM instrument avec une séparation chromatographique en ligne en utilisant une RP colonne C-18 (75 pm x 150 mm, 3,5 um perle Taille). <ol><li> Transférer le oligosaccharides aqueux mélange endoxylanase généré dans un flacon et le placer dans l&#39;échantillonneur automatique HPLC. Programmer le gradient d&#39;élution de 5-80% avec les phases mobiles 0,1% (v / v) d&#39;acide formique dans de l&#39;eau et 0,1% (v / v) d&#39;acide formique dans de l&#39;acétonitrile, respectivement, sur 60 min. </li><li> Réglez le taux à 0,2 ul / min. Réglez le mode ions positifs dans la plage de balayagede 300-1,600 m / z et une vitesse de balayage de 0,5 scans / seconde en utilisant les conditions de source ESI comme suit: gaz de rideau 10, GS1 4, température de la source 100 ° C, l&#39; ion tension de pulvérisation 2.300 V, et de-regroupement potentiel 50 V. Exécutez le programme LC chromatographique et oligosaccharides éluées. Le chromatogramme ionique total résultant (TIC) est enregistré automatiquement par le logiciel. </li><li> Ouvrez le TIC enregistré et sélectionnez extrait chromatogramme. Tapez les masses attendues (par exemple, 271, 403, 535, 667, 799 et 931 m / z) à la ligne de commande. chromatogramme scan en cliquant sur Entrée. Traiter les analyses d&#39;ions sélectionnées des données chromatographiques ESI-QTOF MS en utilisant un logiciel selon les instructions du fabricant 14. </li></ol></li></ol> 6. ESI-MS n <ol><li> Insérer 1 à 2 pi de oligosaccharide per-O-méthylé (méthylé comme décrit par Pettolino et al. 1) échantillon dans 50% d&#39; acétonitrile dans une pointe de nanospray à l&#39; aide d&#39; une seringue. Réduirela pointe nano-spray à l&#39;aide d&#39;un coupe-verre pour tenir dans le porte-nano-spray discret attaché à la MS. </li><li> Réglez la masse en fonction de la plage attendue de masse (200-1,500 m / z) et du gaz de rideau à 10, la tension ionspray à 1,900 V et polarité positive. </li><li> Appuyez sur le bouton pour ouvrir la fenêtre acquérir pertinente, entrez le nom du fichier de données pour obtenir un balayage ionique total (ESI-MS 1). Ensuite, appuyez sur la touche STOP. </li><li> Modifier le type de balayage d&#39;ions produit à fragmenter un pic d&#39;intérêt. Indiquer la masse d&#39;intérêt (par exemple, 885 m / z) à fragmenter et d&#39; ajuster la gamme de masse (200-900 m / z). Appuyez sur le bouton d&#39; acquérir et d&#39; ajuster l&#39;énergie de collision (et / ou vers le bas dans l&#39;onglet composé) pour obtenir la fragmentation complète de l&#39; ion parent (885 m / z) et d&#39; acquérir un balayage fragment d&#39;ions (ESI-MS 2). </li><li> Indiquer la masse du fragment ionique d&#39;intérêt (par exemple, 711 m / z) et régler la plage de masse (200-720 m / z). Appuyez sur le bouton acquérir uned ajuster l&#39;énergie de collision pour obtenir la fragmentation complète de précurseur ion (711 m / z) et d&#39; acquérir un balayage fragment d&#39;ions (ESI-MS 3). </li></ol> 7. H 1 Spectroscopie RMN <ol><li> Dissoudre mélange endoxylanase généré des oligosaccharides (forme KOH-sol, native) (~ 500 ug) dans D 2 O (1,0 ml, 99,9%) dans un tube à essai en plastique (15 ml). Congeler la suspension à -80 ° C pendant 4 heures et sécher la suspension congelée dans un lyophilisateur pour récupérer xylo-oligosaccharides. </li><li> Répéter deux fois 7,1 pour échanger complètement le H 2 S avec D2O </li><li> Dissoudre oligosaccharides séchés dans D 2 O (0,6 ml, 99,9%) et d&#39; ajouter 0,5 ul d&#39;acétone (5% en D 2 O) comme standard interne. Transférer les oligosaccharides deutérés dans le tube à échantillon RMN. </li><li> Tenir la RMN tube contenant l&#39;échantillon par le haut et insérer le tube d&#39;échantillon dans un spinner plastique. Placez le spinner dans la jauge de profondeur de l&#39;échantillon. Push ou retirer le tube d&#39;échantillonnage pour régler la profondeur de l&#39;échantillon pour faire en sorte que la ligne médiane de l&#39;échantillon en haut et en bas des jauges de profondeur sont égales. </li><li> Retirer la jauge de profondeur et insérer l&#39;échantillon dans l&#39;échantillonneur automatique relié à un spectromètre de RMN à 600 MHz équipé d&#39;un cryo-sonde. </li><li> Login et logiciels libres de contrôle du spectromètre. Entrez le nom du fichier de l&#39;échantillon. Ouvrez un ensemble de données existant, puis utiliser la commande &quot;edc&quot; pour l&#39;enregistrer sous un nouveau nom. Tapez le numéro de position de l&#39;échantillon dans l&#39;échantillonneur automatique et appuyez sur &quot;ENTRER&quot;. Remarque: En appuyant sur le bouton &quot;ENTRER&quot; va baisser le tube d&#39;échantillon doucement à l&#39;intérieur de l&#39;aimant où il sera placé dans la partie supérieure de la sonde. </li><li> Réglez la température de l&#39;échantillon souhaité en tapant &quot;edte&quot; à la ligne de commande. Attendre que la température de l&#39;échantillon atteigne la valeur désirée avant de procéder à l&#39;étape suivante. Entrez &quot;verrouiller&quot; à la ligne de commande et sélectionnez solvant approprié (D 2 O). Attendez que le &amp; #34; verrouiller un message fini &quot;apparaît au bas de la fenêtre. </li><li> Tapez &quot;ATMM&quot; à la ligne de commande et cliquez sur &quot;optimiser&quot; en haut de la barre de menu ATMM. Choisissez commencer pour le réglage et l&#39; appariement de la sonde pour le canal sélectionné (1 H dans ce cas). </li><li> Tapez &quot;topshim&quot; à la ligne de commande pour le processus de calage dans lequel des ajustements mineurs sont apportés au champ magnétique jusqu&#39;à ce que le champ magnétique uniforme est réalisé autour du sample.Acquire le signal en tapant &quot;zg&quot; à la ligne de commande et entrez. </li><li> Analyser les spectres en utilisant le logiciel 15 selon les instructions du fabricant avec 1 H déplacement chimique référencée à un niveau interne de l&#39; acétone à 2.225 ppm. </li></ol>

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</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

La plupart des ossatures paroi cellulaire des polysaccharides de la phase de matrice ont apparemment au hasard substitué (à la fois glycosyle et des résidus non glycosylés) , qui sont très variables en fonction de l&#39;espèce végétale, le stade de développement et le type de tissu 3. Comme polysaccharides sont des produits de gènes secondaires leur séquence est pas modèle dérivé et il n&#39;y a donc pas d&#39;approche analytique unique, comme il en existe pour les acides nucléiques et les protéines, pour leu...

Hétéroxylanes sont une famille de polysaccharides qui sont des polysaccharides non cellulosiques prédominantes des parois primaires des graminées et les parois secondaires de tous les angiospermes 3-6. Les backbones xylane diffèrent dans leurs types et les modèles de substitution avec glycosyl (acide glucuronique (GlcA), arabinose (Araf)) et non-glycosyl (O-acétyle, l&#39; acide férulique) des résidus en fonction de type de tissu, le stade de développement et les espèces 7. Les murs du blé (Triticum aestivum L.) endosperme se composent principalement de arabinoxylanes (AXS) (70%) et (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glucanes (20%) avec des quantités mineures de cellulose et heteromannans (2% chacun) 8. Le squelette de xylane peut être diversement non substitué et essentiellement mono-substitué (principalement O-2 positions et, dans une moindre mesure, O-3 positions) et disubstitués (O 2 et O 3 positions) avec des α-L-Ara résidus f 9. L&#39;extrémité réductrice (RE) des hétéroxylanes de dicotylédones (par exemple, Arabidopsis thaliana) 10 et gymnospermes (par exemple, Epicéa (Picea abies)) 11 contient une séquence tétrasaccharide glycosyle caractéristique; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A (1 → 4) -D-Xyl p. Pour comprendre la biosynthèse et de la fonction (biologique et industriel) hétéroxylane, il est important pour séquencer complètement le squelette de xylane pour comprendre les types et les modèles de substitution, ainsi que la séquence de l&#39;extrémité réductrice (RE). Des techniques spécifiques utilisées pour la caractérisation structurale de l&#39;extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) de hétéroxylanes sont décrits dans ce manuscrit. Les techniques reposent sur fluorophore de marquage (avec 2 aminobenzamide (2AB)) de l&#39;extrémité réductrice (RE) de la chaîne hétéroxylane avant l&#39;enzymatique (endoxylanase) hydrolyse. Cette approche, en particulier pour le séquençage de RE, étaitd&#39; abord rapporté par le laboratoire York 10,12-13 , mais est maintenant étendu pour inclure la région de séquençage interne et est une combinaison de techniques établies qui est également adaptable à tous les hétéroxylanes indépendamment de leur source d&#39;isolement. Cette approche peut également être appliquée à d&#39;autres classes de polysaccharides en utilisant (le cas échéant) les endo-hydrolases appropriées. Dans la présente étude, endosperme de blé parois de-amidonné cellulaires ont été isolés comme un résidu insoluble dans l&#39; alcool (AIR) et séquentiellement extrait avec de l&#39; eau (W-sol Fr) et KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) comme décrit dans Ratnayake et al. (2014) 2. Les oligosaccharides libérés à la fois W- et Frs KOH-sol sont alors méthylé et l&#39;analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-couplé à HPLC avec le une séparation chromatographique en ligne en utilisant une RP colonne C-18et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX a également été caractérisée par résonance magnétique nucléaire (RMN).

<table><tbody><tr><td>2 aminobenzamide (2AB)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A89804</td><td></td></tr><tr><td>borohydrure de sodium (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>247677</td><td>Dangereux, manipuler avec précaution</td></tr><tr><td>cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>156159</td><td>Dangereux, manipuler avec précaution</td></tr><tr><td>endo-1,4-&beta ;-Xylanase M1 (de Trichoderma viride) (120101a)</td><td>Megazyme (www.megazyme.com)</td><td>E-XYTR1</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium (D2O)</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisateur (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 Zorbax eclipse plus column&nbsp ;</td><td>Agilent&nbsp ;</td><td></td><td>(2.1&fois ; 100 millimètres ; 1,8 et micro ; m taille de la bille)&nbsp ;</td></tr><tr><td>MicroFlex MALDI-TOF MS&nbsp ; &nbsp ; (Modèle - MicroFlex LR)</td><td>(Bruker Daltonics, Allemagne)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ESI) -(QTOF) MS&nbsp ; &nbsp ; (Modèle # 6520)</td><td>(Agilent, Palo Alto, Californie )</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSn &nbsp ;- piège-ionique&nbsp ; (Modèle # 1100 HCT)</td><td>(Agilent, Palo Alto, Californie).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 600 MHz -NMR</td><td>Bruker Daltonics, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topspin (version 3.0)-Biospin- logiciel&nbsp ;</td><td>Bruker&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (Modèle # 7890B)</td><td>Agilent&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

le séquençage de l&#39;usine mur hétéroxylanes utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Ce protocole décrit les techniques particulières utilisées pour la caractérisation de l&#39;extrémité réductrice (RE) et la séquence de glycosyle région interne (s) du hétéroxylanes. Les parois cellulaires endosperme de blé de-amidonnés ont été isolés comme un résidu insoluble dans l&#39; alcool (AIR) 1 et séquentiellement l&#39; extrait avec de l&#39; eau (W-sol Fr) et de KOH 1 M contenant 1% de NaBH4 (KOH-sol Fr) tel que décrit par Ratnayake et al. , (2014) 2. Deux approches différentes (voir le résumé dans la figure 1) sont adoptées. Dans la première, W AX-sol intactes sont traitées avec 2AB pour marquer le résidu initial de sucre dans la chaîne du squelette RE et ensuite traités avec une endoxylanase pour produire un mélange de 2AB marqué RE et la région interne oligosaccharides réducteurs, respectivement. Dans une deuxième approche, le Fr KOH-sol est hydrolyse avec endoxylanase d&#39;abord générer un mélange d&#39;oligosaccharides qui sont ensuite marquées avec 2AB. Les ((dé) marqués) oligosaccharides libérés par voie enzymatique à la foisW- et Frs KOH-sol sont ensuite méthylé et l&#39;analyse structurale détaillée des deux oligosaccharides natifs et méthylés est réalisée en utilisant une combinaison de MALDI-TOF-MS, une RP-HPLC-ESI-QTOF-MS et ESI-MS n. Endoxylanase digéré KOH-sol AX sont également caractérisés par résonance magnétique nucléaire (RMN), qui fournit également des informations sur la configuration anomérique. Ces techniques peuvent être appliquées à d&#39;autres classes de polysaccharides à l&#39;aide des endo-hydrolases appropriées.

La digestion endoxylanase de 2AB marqué W-sol AX génère un mélange d&#39;oligosaccharides RE 2AB marqué et une série d&#39;oligosaccharides non marqué (sans étiquette 2AB) dérivées des régions internes de la chaîne de xylane (figure 1, à partir Ratnayake et al. 2). Une série de méthodes chromatographiques est ensuite utilisé pour fractionner le mélange complexe d&#39;isomères. Enfin, les techniques MS sont utilisés pour identifier les structures isomè...

Ce protocole décrit les techniques spécifiques utilisées pour la caractérisation structurale de l’extrémité réductrice (RE) et de la (les) séquence(s) glycosylique(s) de la région interne des hétéroxylanes en marquant l’ER avec 2 aminobenzamides avant l’hydrolyse enzymatique (endoxylanase), puis en analysant les oligosaccharides résultants à l’aide de la spectrométrie de masse (MS) et de la résonance magnétique nucléaire (RMN).

Le séquençage de l&#39;usine mur hétéroxylanes Utilisation enzymatique, chimique (méthylation) et physiques (spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

L'objectif général est de caractériser les séquences glycosidiques des extrémités réductrices et des régions internes des hétéroxylanes en marquant le résidu sucré de l'extrémité réductrice originale des hétéroxylanes hydrosolubles, puis en traitant avec une endoxylanase afin de générer un mélange d'oligosaccharides marqués. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine glycomique, telles que les modifications de la structure fine des oligosaccharides ou des polysaccharides en réponse au développement végétal planifié, ainsi qu'aux stress abiotiques et biotiques. Le principal avantage de cette méthode réside dans son approche intégrée pour le séquençage à la fois de la séquence de l'extrémité réductrice et de la séquence interne de tout glycan ou polysaccharide.Préparez une solution un molaire de cyanoborohydrure de sodium dans un millilitre d'eau. Ensuite, dissolvez 27,2 milligrammes de réactif 2AB dans la solution de cyanoborohydrure de sodium en chauffant à 65 degrés Celsius et en ajustant le pH du mélange réactionnel à pH 5,5 à l'aide d'acide acétique à 10 %. Ajoutez 200 microlitres du mélange réactionnel à un milligramme d'arabinoxylanes solubles dans l'eau dans un tube en verre avec bouchon, puis mélangez à l'aide d'un vortexeur.Incubez l'échantillon pendant deux heures à 65 degrés Celsius dans une hotte. Après l'incubation, laissez refroidir la suspension à température ambiante et ajoutez quatre volumes d'éthanol absolu. Placez la suspension à froid pendant toute la nuit pour précipiter les polysaccharides.Ensuite, centrifugez l'échantillon et retirez le surnageant. Lavez abondamment le culot avec de l'éthanol absolu, de l'acétone et du méthanol, en centrifugeant entre chaque lavage. Séchez le culot sous vide à 40 degrés Celsius toute la nuit.Dissoudre un milligramme des arabinoxylanes hydrosolubles marqués au 2AB préparés dans 500 microlitres de tampon d'acétate de sodium dans un tube de microcentrifugation. Ajouter quatre unités d'endoxylanase et incuber à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Inactiver l'activité enzymatique en chauffant le mélange réactionnel pendant 10 minutes dans un bain-marie bouillant.Refroidir la suspension à température ambiante et la transférer dans un tube en verre muni d'un bouchon. Après avoir ajouté quatre volumes d'éthanol absolu, placer la suspension au réfrigérateur pendant la nuit afin de précipiter les polysaccharides non digérés. Centrifuger pour former un culot des polysaccharides non digérés, séparés des oligosaccharides générés par l'endoxylanase.Ensuite, versez le surnageant dans un tube en plastique propre et placez-le dans un bain-marie tiède. Évaporez l'éthanol sous un courant d'azote jusqu'au volume final souhaité. Congelez le surnageant à moins 80 degrés Celsius pendant quatre heures avant de sécher le surnageant congelé dans un lyophilisateur afin de récupérer les xylooligosaccharides.Pour générer les xylooligosaccharides à partir des arabinoxylanes solubles de KO8 et pour la marquage par 2AB, consulter le protocole écrit. Pour préparer la solution matricielle MALDI, ajouter une petite quantité de DHB à 500 millilitres d'acétonitrile à 50 pour cent contenant 0,1 pour cent d'acide formique dans un tube. Mélanger à l'aide d'un vortex.S’il se dissout rapidement, ajoutez une autre petite dose de DHB. Déposez les échantillons aqueux d'oligosaccharides natifs sur une plaque cible MALDI. Ajoutez 0,3 microlitre de la solution matricielle MALDI à l’aide d’une pipette munie d’une pointe distincte et mélangez en aspirant et en expulsant plusieurs fois.Laisser sécher le mélange à température ambiante. Introduire la plaque cible dans la source de spectrométrie de masse (MS) et fonctionner en mode ions positifs. Régler la tension d'accélération à 19 kilovolts au niveau de la source d'ions un, et à 16,3 kilovolts au niveau de la source d'ions deux.Réglez la puissance du laser à plus de 70 pour cent. Sélectionnez le point d'échantillonnage sur la plaque cible MALDI et cliquez sur démarrer pour commencer les tirs laser. Analysez les oligosaccharides générés par l'endoxylanase native à l'aide d'une nano-HPLC couplée à un spectromètre de masse à ionisation par électrospray, quadrupôle et temps de vol, avec une séparation chromatographique en ligne utilisant une colonne C18 à phase inverse.Transférez le mélange aqueux d'oligosaccharides produit par l'endoxylanase dans un flacon et placez-le dans l'échantillonneur automatique de la CLHP. Programmez le gradient d'élution de 5 à 80 % avec les phases mobiles composées respectivement d'acide formique 0,1 % dans l'eau et d'acide formique 0,1 % dans l'acétonitrile, sur une durée de 60 minutes. Exécutez le programme de chromatographie liquide et éluerez les oligosaccharides.Appuyez sur Ajouter l'échantillon, saisissez le nom de l'échantillon, puis appuyez sur le bouton OK. Sélectionnez le fichier de méthode de spectrométrie de masse et appuyez sur le bouton Soumettre. Ensuite, démarrez l'échantillon.Le chromatogramme d'ions totaux, ou TIC, est automatiquement enregistré par le logiciel. Ouvrez le TIC enregistré et sélectionnez l'extraction du chromatogramme. Saisissez les masses attendues dans la ligne de commande.Analyser le chromatogramme en cliquant sur Entrée avant de traiter les analyses d'ions sélectionnés à l'aide du logiciel selon les instructions du fabricant. Introduire un à deux microlitres d'échantillon d'oligosaccharide per-O-méthylé dans 50 pour cent d'acétonitrile dans une pointe nanospray à l'aide d'une seringue. Ajuster la pointe nanospray à l'aide d'un coupe-verre afin qu'elle s'insère dans le support nanospray spécifique fixé au spectromètre de masse. Régler la masse selon la plage de masse attendue, le gaz rideau à 10, la tension de pulvérisation ionique à 1900 volts et la polarité en mode positif.Appuyez sur le bouton d'acquisition pour ouvrir la fenêtre correspondante. Ensuite, saisissez le nom du fichier de données pour obtenir un balayage d'ions totaux avant d'appuyer sur le bouton d'arrêt. Modifiez le type de balayage, en passant du balayage d'ions produits à la fragmentation d'un fragment d'intérêt.Saisissez la masse d'intérêt à fragmenter et ajustez la plage de masse. Appuyez sur le bouton d'acquisition et réglez l'énergie de collision afin d'obtenir une fragmentation complète de l'ion parent, puis enregistrez un spectre des ions fragmentés. Dissolvez le mélange d'oligosaccharides généré par l'endoxylanase dans un millilitre d'oxyde de deutérium dans un tube à essai en plastique de dix millilitres.Congelez la suspension à moins 80 degrés Celsius pendant quatre heures avant de sécher la suspension congelée dans un lyophilisateur pour récupérer les xylooligosaccharides. Ensuite, dissolvez les oligosaccharides séchés dans 0,6 millilitre d'oxyde de deutérium et ajoutez 0,5 microlitre d'acétone à cinq pour cent dans l'oxyde de deutérium comme étalon interne. Transférez les oligosaccharides deutérés dans le tube d'échantillon de RMN.Tenez le tube RMN contenant l'échantillon par le haut et insérez le tube dans un support en plastique. Placez le support dans le jaugeur de profondeur d'échantillon. Poussez ou tirez le tube pour ajuster la profondeur de l'échantillon afin que la ligne médiane des jauges de profondeur supérieure et inférieure de l'échantillon soit identique.Retirez le palpeur de profondeur et insérez l'échantillon dans l'auto-échantillonneur fixé à un spectromètre RMN de 600 mégahertz équipé d'une sonde cryogénique. Procédez à l'exécution de l'expérience RMN et analysez les spectres obtenus comme décrit dans le protocole textuel. Les signaux dans le spectre MS TOF MALDI des oligosaccharides dérivés d'arabinoxylanes natifs solubles dans l'eau marqués au 2AB comprennent une série d'oligosaccharides neutres et acides de la région interne non marqués, ainsi que des oligosaccharides initialement marqués au 2AB à leur extrémité réductrice.On voit ici des analyses d'ions sélectionnés issues des chromatogrammes MS avec seuil ESI des oligosaccharides natifs provenant d'oligosaccharides de région interne générés par un traitement à l'endoxylanase des arabinoxylanes solubles dans l'eau marqués au 2AB. Sont également représentées des analyses d'oligosaccharides natifs dérivés d'oligosaccharides extrémité réductrice marqués au 2AB et d'oligosaccharides acides de région produits de la même manière. Les groupes hydroxyle non méthylés générés lors de la fragmentation en phase gazeuse d'oligosaccharides per-O-méthylés en spectrométrie de masse présentent une différence de masse de 14 Dalton, une empreinte utilisée pour identifier le motif de ramification et les séquences glycosidiques.Chaque cicatrice générée par l'événement de fragmentation est indiquée par une ligne continue, car plusieurs structures isomériques sont possibles pour une masse définie. Les ions Y sont étiquetés en rouge, et les ions B sont étiquetés en noir. L'analyse des spectres de masse en tandem par ionisation électrospray de l'alditol glycosal réducteur et neutre, entièrement O-méthylé, composé de quatre résidus de pentose et de xylitol, à un rapport masse/charge de 885, indique que la séquence glycosal de l'extrémité réductrice comprend la chaîne latérale d'arabinose liée au résidu de xylitol de l'extrémité réductrice et/ou à la fois le xylitol de l'extrémité réductrice et le résidu de xylosyle pénultième.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le profilage par chromopriorisanomichro poly et les électropulsations peuvent être réalisées afin de répondre à des questions telles que la spécificité des épitopes des anticorps et le criblage rapide des modifications de la structure fine. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la glycomique pour explorer les caractéristiques structurales des glycanes, notamment le type et le motif de substitutions par des résidus glycaniques ou non glycaniques dans différents types de tissus, stades de développement et espèces. Cette approche peut être appliquée à d'autres classes de polysaccharides en utilisant une endrohydrolase appropriée.N'oubliez pas que le travail avec l'alide métallique et le cyanoborohydrure de sodium peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants appropriés et le travail sous hotte aspirante doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Chemistry

Chimie

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