Réalisé Evolution Méthode Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Création et dépistage

L’objectif général de ce protocole est de montrer comment construire et cribler des banques de mutants chez Saccharomyces Cerevisiae pour des expériences d’évolution dirigée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la création en laboratoire, l’utilisation pour des expériences d’évolution dirigée ciblées, telles que l’attribution de zones de chevauchement dans l’assemblage et le clonage. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité et sa robustesse puisqu’en une seule étape de transformation, il est possible d’attribuer des niveaux de bonne qualité.

Ce protocole de création et de criblage de banques mutantes sera démontré pour une aryl-alcool oxydase fongique ou AAO. Les régions pour l’évolution dirigée ciblée sont d’abord choisies à l’aide d’algorithmes de calcul basés sur la structure cristalline disponible ou les modèles d’homologie de l’enzyme. Deux régions d’AAO seront ciblées pour la mutagenèse et la recombinaison aléatoires : la région M1 et la région M2.

Une PCR mutagène sera réalisée pour amplifier les zones ciblées. Pour favoriser l’épissage in vivo chez la levure, des zones de chevauchement entre des segments d’environ 50 paires de bases chacun seront créées en superposant des réactions PCR des régions définies. Préparez des PCR mutagènes d’un volume de 50 microlitres, chacune contenant 46 nanogrammes de matrice d’ADN, 90 nanomolaires chacune d’amorces sensorielles et antisens, 0,3 millimolaire de DNTP, 3 % de DMSO, 1,5 millimolaire de chlorure de magnésium, 05 millimolaire de chlorure de manganèse et 05 unités par microlitre d’ADN polymérase tack.

Utilisez le programme PCR suivant : 95 degrés Celsius pendant deux minutes, 95 degrés Celsius pendant 45 secondes, 50 degrés Celsius pendant 45 secondes, 74 degrés Celsius pendant 45 secondes pendant 28 cycles et 74 degrés Celsius pendant 10 minutes. Le reste du gène AAO, la région HF, sera amplifié par PCR haute fidélité, les zones correspondantes chevauchant les segments mutagènes, et / ou les surplombs de vecteurs linéarisés inclus.

Préparez la PCR haute fidélité dans un volume final de 50 microlitres contenant 10 nanogrammes de matrice d’ADN, 250 nanomolaires d’amorces sensorielles et antisens, 0,8 millimolaire de DNTP, 3 % de DMSO et 02 unités par microlitre d’ADN polymérase ultra haute fidélité iProof. Utilisez le programme PCR suivant. 98 degrés Celsius pendant 30 secondes, 98 degrés Celsius pendant 10 secondes, 55 degrés Celsius pendant 25 secondes, 72 degrés Celsius pendant 45 secondes pendant 28 cycles et 72 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Tous les fragments de PCR sont ensuite purifiés à l’aide d’un kit commercial d’extraction de gel selon le protocole du fabricant. L’étape suivante consiste à linéariser le vecteur pour créer des régions flanquantes d’environ 50 paires de bases homologues aux cinq extrémités premières et aux trois extrémités premières du gène cible. Préparez un mélange de réaction de linéarisation de 20 micolitres contenant 2 microgrammes d’ADN, 7,5 unités de BamH-one, 7,5 unités de XHO-one, 20 microgrammes de BSA et deux microlitres de 10x tampon BamH-one.

Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant deux heures et 40 minutes. Après cela, inactivez la réaction à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour purifier le vecteur linéarisé afin d’éviter la contamination par le plasmide circulaire résiduel, chargez le mélange de réaction de digestion dans le méga-puits d’un gel d’agarose semi-préparatif à bas point de fusion.

Chargez cinq microlitres du mélange réactionnel dans le puits adjacent en tant que rapporteur. Effectuez une électrophorèse de l’ADN à quatre degrés Celsius et cinq volts par centimètre entre les électrodes. Ensuite, séparez le gel d’agarose correspondant au méga-puits et stockez-le à quatre degrés Celsius dans un XTAE.

Teindre la voie avec l’échelle de poids moléculaire et le reporter. Visualisez les bandes sous la lumière UV et marquez la position où le vecteur linéarisé se place. En l’absence de lumière UV et en utilisant le guidage des entailles dans la voie rapporteure colorée, identifiez le vecteur linéarisé dans le fragment de méga-puits et excisez-le.

Extrayez le vecteur linéarisé de l’agarose et purifiez-le à l’aide d’un kit d’extraction de gel commercial selon le protocole du fabricant. Par la suite, le vecteur linéarisé purifié est mélangé aux fragments de PCR et ce mélange d’ADN est utilisé pour transformer des cellules de levure compétentes à l’aide d’un kit commercial selon les instructions du fabricant. Plaquez les cellules transformées sur des plaques de chute SC et incuberez-les à 30 degrés Celsius pendant trois jours.

Pour vous préparer à cet essai, choisissez des colonies individuelles dans les plaques de chute SC et transférez-les dans 96 plaques de puits contenant 50 microlitres de milieu minimal par puits. Dans chaque plaque, inoculez la colonne numéro six avec le type parental comme étalon interne. En tant que contrôle négatif, inoculez bien H-one rempli de milieux SC complétés par de l’uracile avec des cellules viscérales ESI négatives URA3 sans plasmide.

Couvrez les assiettes avec leurs couvercles, enveloppez-les dans du film para et incubez à 30 degrés Celsius dans un agitateur humide pendant 48 heures. Après 48 heures, ajoutez 160 microlitres de milieu d’expression dans chaque puits et refermez les plaques. Incuber pendant 24 heures supplémentaires.

Après la centrifugation des plaques, utilisez une multi-station robotisée de manipulation de liquides pour transférer 20 microlitres de surnageant des puits de chaque plaque vers une réplique de plaque. Ajoutez 20 microlitres de deux alcool P-méthoxybenzylique millimolaire et 100 tampons de phosphate de sodium millimolaires ph 6,0 dans chaque puits. Remuez brièvement les plaques avec un mélangeur à plaques de 96 puits et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 160 microlitres de FOX reagant dans chaque réplique de plaque et remuez brièvement avec le mélangeur. Lire les plaques à 560 nanomètres sur un lecteur de plaques. Incuber les plaques à température ambiante jusqu’à ce que la couleur se développe.

Mesurez à nouveau l’absorption. L’activité relative est calculée à partir de la différence entre la valeur d’absorption après incubation et celle de la mesure initiale normalisée au type parental pour chaque plaque. Cette image de gel représentative montre le vecteur linéarisé dans le couloir deux, le segment PCR M1 dans le couloir trois, le segment PCR M2 dans le couloir quatre, le segment PCR HF dans le couloir cinq et le vecteur réassemblé in vivo linéarisé avec NHE un dans le couloir six.

Ce gel suivant montre la mini-préparation plasmidique du vecteur réassemblé dans le couloir deux, le plasmide linéarisé avec NHE un dans le couloir trois, le plasmide linéarisé avec BamH un et XHO un dans le couloir quatre, et le plasmide linéarisé obtenu par extraction de gel et nettoyage dans le couloir cinq. Les charges mutationnelles ont été ajustées en échantillonnant des banques de mutants avec des paysages différents, en calculant le nombre de clones avec moins de 10 % de l’activité enzymatique parentale et en vérifiant davantage par le séquençage d’un échantillon aléatoire de variants actifs et non actifs. Une évaluation de la limite de détection de ce test a montré que le test était linéaire en présence de sorbitol représenté par des cercles noirs.

En l’absence de sorbitol représenté par les carrés blancs, la linéarité était plus persistante mais la réponse était plus faible. Une corrélation linéaire a été observée entre la concentration d’AAO et l’absorbance. Une bibliothèque de mutants de 2 000 clones a été construite et criblée avec ce test.

Le carré ombragé indique les mutants AAO avec une sécrétion et une activité nettement améliorées contre l’alcool P-méthoxybenzylique. Une fois maîtrisées, les banques de mutants peuvent être créées en environ quatre heures si elles sont exécutées correctement. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’attribuer des zones de chevauchement appropriées pour chaque famille de PCR et vecteur linéarisé pour l’épissage et le clonage in vivo en une seule étape de transformation.

En suivant une approche similaire, d’autres méthodes telles que l’échantillonnage d’ADN in vivo, la bibliothèque de mutagénèse par saturation ou l’assemblage d’ADN peuvent être effectuées afin de construire des banques de mutants et/ou des voies métaboliques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la bio-ingénierie pour explorer des activités, des stabilités, voire inventer une infinité de types d’interactions. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exploiter ce dispositif Saccharomyces Cerevisiae pour la construction et le criblage de bibliothèques