Name: Réalisé Evolution Méthode Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Création et dépistage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Découvrez la construction et le criblage de bibliothèques mutantes chez Saccharomyces cerevisiae pour l'évolution dirigée. Cette méthode simple permet de cibler des régions spécifiques de protéines comme l'aryl-alcool oxydase.

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Ce travail a été soutenu par le projet de la Commission européenne Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549 ; une biocatalyse Cost-Action CM1303-Systems ; et les projets nationaux Dewry [BIO201343407-R] et Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Mutant Library Construction <ol><li> Choisissez les régions à soumettre à MORPHING avec l&#39;aide d&#39;algorithmes de calcul sur la base des modèles disponibles sur la structure cristalline ou homologie 18. <ol><li> Ici, cibler deux régions de AAO de Pleurote du panicaut pour la mutagenèse aléatoire et la recombinaison (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), tout en amplifiant le reste du gène (844 pb) par PCR haute fidélité (Figure 1). Note: Plusieurs segments peuvent être étudiés par MORPHING de manière indépendante ou combinée 16. </li></ol></li><li> Amplifier les zones ciblées par PCR mutagène. Créer des zones de chevauchement entre des segments (~ 50 pb chacun) en superposant des réactions PCR des régions définies. <ol><li> Préparer une PCR mutagene des segments ciblés dans un volume final de 50 ul contenant une matrice d&#39;ADN (0,92 ng / ul), 90 nM de détection de l&#39;oligo (pour le segment de RMLN IM et AAO-BP pour le segment M-II), 90 nM d&#39;unntisense amorce (AAO-92C pour le segment IM et RMLC pour le segment M-II), mM dNTP 0,3 (0,075 mM chacun), 3% (v / v) de diméthylsulfoxyde (DMSO), 1,5 mM de MgCl2, 0,05 mM de MnCl2 et 0,05 U / pl de Taq ADN polymerase. Amorces séquences sont décrites en détail dans la figure 1. </li><li> Utilisez le programme de PCR suivant: 95 ° C pendant 2 min (1 cycle); 95 ° C pendant 45 s, 50 ° C pendant 45 s, 74 ° C pendant 45 s (28 cycles); et 74 ° C pendant 10 min (1 cycle). </li></ol></li><li> Amplifier les régions non-mutagène avec ultra-haute polymérase fidélité et inclure les zones correspondantes se chevauchent les segments mutagènes et / ou des surplombs de vecteur linéarisé. <ol><li> Préparer des mélanges réactionnels dans un volume final de 50 ul contenant: modèle d&#39;ADN (0,2 ng / pl), 250 nM d&#39;oligonucleotide sens HFF, 250 nM d&#39;oligo antisens HFR, 0,8 mM de dNTP (0,2 mM chacun), 3% (v / v) de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) et 0,02 U / pl d&#39; ADN polymerase iProof. Amorces séquences sont détaillées dans &lt;strong&gt; Figure 1. </li><li> Utilisez le programme de PCR suivant: 98 ° C pendant 30 secondes (1 cycle); 98 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 25 s, 72 ° C pendant 45 s (28 cycles); et 72 ° C pendant 10 min (1 cycle). Remarque: Avec les conditions décrites en 1.2 et 1.3 chevauchements de 43 pb (région plasmidique-M1); 46 pb (M1 region-HF); 47 pb (HF région M2 région) et 61 pb (M2 plasmidique de région) sont conçus (Figure 1) pour favoriser dans l&#39; épissage in vivo dans la levure. </li><li> On purifie tous les fragments de PCR (mutagènes et non mutagènes) avec un kit d&#39;extraction de gel du commerce, selon le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Linéariser le vecteur de telle sorte que les régions d&#39;environ 50 pb adjacentes sont créées, qui sont homologues aux extrémités 5 &#39;et 3&#39; extrémités du gène cible. <ol><li> Préparer un mélange réactionnel contenant de linéarisation 2 pg d&#39; ADN, 7,5 U Bam HI Xho I 7,5 U, 20 ug de BSA et 2 pi de tampon de Bam HI 10x dans un volume final de 20 ul. </li><li> Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 2 h et 40 min. Ensuite, procéder à l&#39;inactivation à 80 ° C pendant 20 min. </li></ol></li><li> Purifier le vecteur linéarisé par extraction sur gel d&#39; agarose afin d&#39; éviter toute contamination avec le plasmide circulaire résiduel (figure 2). <ol><li> Charger le mélange de réaction de digestion dans le méga-puits d&#39;un gel semi-préparative bas point de fusion d&#39;agarose (0,75%, w: v), ainsi que d&#39;une partie aliquote (5 pi) du mélange de réaction dans le puits adjacent en tant que journaliste. </li><li> Run ADN électrophorèse (5 V / cm entre les électrodes, 4 ᵒC) et séparer le gel d&#39;agarose correspondant à la méga-puits et le stocker à 4 ᵒC dans 1x TAE. </li><li> Colorer la voie avec l&#39;échelle de poids moléculaire et le journaliste. Visualisez les bandes sous lumière UV. Nick la position où les places de vecteurs linéarisés. Remarque: Comme la qualité du vecteur linéarisé purifié est un critifacteur cal pour la recombinaison avec succès et de l&#39;assemblage dans la levure, éviter la coloration de gel d&#39;électrophorèse d&#39;ADN semi-préparative. L&#39;utilisation de colorants et de l&#39; exposition aux UV pour l&#39; extraction de gel peut affecter la stabilité du vecteur d&#39;ADN, ce qui compromet l&#39;efficacité in vivo de recombinaison. Comme alternative aux colorants de EtBr toxiques gel rouge et des colorants SYBR sont couramment utilisés pour la coloration du gel. </li><li> En l&#39;absence de lumière UV, d&#39;identifier le vecteur linéarisé dans le fragment méga-puits en utilisant la direction des entailles dans la voie indicatrice colorée de manière à pouvoir être isolée. </li><li> Extraire le vecteur linéarisé à partir d&#39;agarose et on purifie avec un kit d&#39;extraction de gel du commerce, selon le protocole du fabricant. Remarque: Utilisez haute copie vecteurs navettes épisomique avec des marqueurs antibiotiques et auxotrophie: Dans cet exemple , nous avons utilisé l&#39;uracile indépendant et résistance à l&#39; ampicilline pJRoC30 vecteur, sous le contrôle du promoteur de levure GAL1. </li></ol></li><li> Préparer une mi équimolairexture des fragments de PCR et le mélanger avec le vecteur linéarisé à un ratio de 2: 1, avec pas moins de 100 ng du plasmide linéarisé (essai différents rapports de bibliothèque équimolaire / vecteur ouvert à obtenir de bons rendements de transformation). <ol><li> Mesurer l&#39;absorbance des fragments de PCR et le vecteur linéarisé à 260 nm et 280 nm afin de déterminer leur concentration et leur pureté. </li></ol></li><li> Transformer des cellules compétentes de levure avec le mélange d&#39;ADN en utilisant un kit de transformation de levure commerciale (voir le tableau pour les fournitures) selon les instructions du fabricant. <ol><li> Ici, utiliser une protéase déficiente et URA3 - dépendante S. cerevisiae, BJ5465. Transformer les cellules avec le vecteur circularise parental comme standard interne durant la sélection (voir ci-dessous). En outre, vérifier les antécédents en transformant le vecteur linéarisé en l&#39;absence de fragments de PCR. Remarque: En cas de détection de niveaux initiaux de sécrétion faible, utilisez S.cerevisiae souches déficientes en protease comme BJ5465 pour favoriser l&#39;accumulation de protéine active dans les surnageants de culture. Si l&#39;enzyme cible est soumis à une hyperglycosylation, l&#39;utilisation de souches de glycosylation déficiente (par exemple Δ kre2 qui est seulement capable de se fixer oligomères plus petits mannose) pourrait être une option appropriée. </li></ol></li><li> Plaque les cellules transformées sur SC plaques d&#39;abandon et les incuber à 30 ° C pendant trois jours. Plate (sur SC plaques d&#39; abandon complété par l&#39; uracile) URA3 - S. cellules cerevisiae dépourvues du plasmide comme témoin négatif pour le dépistage (voir ci - dessous). </li></ol> 2. Haut-Throughput Screening Assay (Figure 3) <ol><li> Remplir un nombre approprié de plaques à 96 puits stériles (23 plaques pour analyser une banque de 2.000 clones) avec 50 ul par puits de milieu minimal à l&#39;aide d&#39;un robot de pipetage. </li><li> Prélever des colonies individuelles de la SC-goutte sur les plaques et les transférer sur les plaques à 96 puits. <ol><li> Dans chaque assiette, inoculer le numéro de la colonne 6 avec le type parental comme étalon interne et bien H1 avec URA3 - S. cerevisiae (cellules dans du milieu SC complété avec de l&#39; uracile) sans plasmide en tant que témoin négatif. Remarque: Eh bien H1 est rempli spécifiquement avec les médias d&#39;abandon complété par l&#39; uracile. Un média vierge puits contenant sans cellules peut également être préparé comme un contrôle de stérilité supplémentaire. </li></ol></li><li> Couvrir les plaques avec leurs couvercles et les envelopper dans Parafilm. Incuber les plaques pendant 48 heures à 30 ° C, 225 tpm et 80% d&#39;humidité relative dans un shaker humide. </li><li> Retirer le parafilm, ajouter 160 ul de milieu d&#39;expression dans chaque puits à l&#39;aide du robot de pipetage, et de reboucher les plaques incuber pendant encore 24 heures. Note: moyenne minimale et moyenne d&#39;expression sont préparés comme rapporté ailleurs 19. Les taux de sécrétion peuvent varier selon le gène à l&#39;étude et, par conséquent, le til l&#39;incubation fois doivent être optimisées dans chaque cas pour synchroniser la croissance des cellules dans tous les puits. </li><li> Centrifuger les plaques (plaques de base) à 2800 x g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transférer 20 pl du surnageant des puits de la plaque maîtresse à la plaque de réplique à l&#39;aide d&#39;un robot de manipulation multiposte liquide. Remarque: Pour favoriser la sécrétion de l&#39; enzyme , il est conseillé de remplacer le peptide signal natif de la protéine cible par des peptides de signal couramment utilisés pour l&#39; expression hétérologue dans la levure (par exemple, le facteur α prépro-chef, le chef de la K 1 tueur toxine de S. cerevisiae, ou même des versions chimères de deux peptides 13). En variante, le peptide signal natif peut être évolué exclusivement pour la sécrétion dans la levure. </li><li> Ajouter 20 pi de 2 mM de p -methoxybenzylalcohol dans 100 mM de tampon phosphate de sodium à pH 6,0 à l&#39;aide du robot de pipetage. Incorporer les plaques brièvement avec un nous 96ll mélangeur de plaque et les incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Avec le robot de pipetage, ajouter 160 ul du réactif FOX à chaque plaque de réplique et remuer brièvement avec le mélangeur (concentration finale de mélange FOX dans le puits: 100 uM xylénol orange, 250 uM Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 et 25 mM de H 2 SO 4). <ol><li> Ajouter plusieurs additifs au réactif pour améliorer la sensibilité, tels que des co-solvants organiques (DMSO, l&#39; éthanol, le méthanol ou le sorbitol) 17. Ici, amplifier la réaction par addition de sorbitol à une concentration finale de 100 mM (figure 4). </li></ol></li><li> Lire les plaques (mode point final, t 0) à 560 nm sur un lecteur de plaque. </li><li> Incuber les plaques à température ambiante jusqu&#39;à ce que la couleur se développe et mesurer l&#39;absorption à nouveau (t 1). <ol><li> Calculer l&#39;activité relative de la différence entre la valeur d&#39;ABS après incubation et celui de la mesure initiale normalisée à la éplucherType ntal pour chaque plaque (1 At - t 0). </li></ol></li><li> Soumettre les meilleurs tubes mutants à deux re-projections consécutives pour exclure les faux positifs. Remarque: En général, re-projections comprennent l&#39; isolement du plasmide à partir de levure, d&#39; amplification et de purification dans Escherichia coli, suivie d&#39; une transformation de cellules de levure fraîche avec le plasmide 19. Chaque clone sélectionné est re-projeté en pentaplicate. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Dans cet article, nous avons résumé la plupart des trucs et astuces employées dans notre laboratoire pour concevoir des enzymes par l&#39; évolution dirigée dans S. cerevisiae ( en utilisant AAO comme exemple) afin qu&#39;ils puissent être adaptés pour une utilisation avec de nombreux autres systèmes enzymatiques eucaryote en suivant simplement l&#39;approche commune décrite ici. En termes de création de la bibliothèque, MORPHING est une méthode en un seul pot rapide à introduire et...

Évolution moléculaire dirigée est une méthode robuste, rapide et fiable pour concevoir des enzymes 1, 2. Par séries itératives de mutation aléatoire, recombinaison et de criblage, des versions améliorées des enzymes peuvent être générés qui agissent sur ​​de nouveaux substrats, dans de nouvelles réactions, dans la non-naturelle environnements, ou même pour aider la cellule à atteindre de nouveaux objectifs métaboliques 3-5. Parmi les hôtes utilisés dans l&#39; évolution dirigée, la levure Saccharomyces cerevisiae du brasseur propose un répertoire de solutions pour l&#39;expression fonctionnelle des protéines eucaryotes complexes qui ne sont pas autrement disponibles dans homologues procaryotes 6,7. Utilisé de façon exhaustive dans les études de biologie cellulaire, ce petit modèle eucaryote présente de nombreux avantages en termes de modifications post-traductionnelles, la facilité de manipulation et de transformation d&#39; efficacité, sont tous les traits qui importants à l&#39; ingénieur enzymes par évolution dirigée 8. En outre, la haute fréquencede recombinaison homologue de l&#39; ADN dans S. cerevisiae couplé à son appareil de relecture efficace ouvre un large éventail de possibilités de création de la bibliothèque et de l&#39; assemblage de gènes in vivo, de favoriser l&#39;évolution des différents systèmes d&#39; enzymes uniques aux voies artificielles complexes 9-12. Notre laboratoire a passé la dernière décennie la conception d&#39; outils et de stratégies pour l&#39;évolution moléculaire des différentes ligninases dans la levure (des oxydoréductases impliquées dans la dégradation de la lignine lors de la pourriture du bois naturel) 13-14. Dans cette communication, nous présentons un protocole détaillé pour préparer et bibliothèques de mutants d&#39;écran dans S. cerevisiae pour un modèle flavooxidase, -aryl-alcool oxydase (AAO 15) -, qui peut être facilement traduits à de nombreuses autres enzymes. Le protocole implique une méthode d&#39;évolution ciblée dirigée (MORPHING: Mutagène organisée par recombinaison homologue Process in vivo Regroupement) assistée par l&#39;appareil de cellule de levure 16,da test de criblage très sensible basé sur la réaction de Fenton, afin de détecter l&#39; activité AAO sécrété dans le bouillon de culture 17.

<table><tbody><tr><td><fort>1. Milieux de culture </fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sel sodique d’ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&ordm ; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&ordm ; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&ordm ; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>N&ordm CAS ; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>N&ordm CAS ; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>N&ordm CAS ; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Base azotée de levure sans acides aminés</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Levure synthétique Drop-out Medium Suppléments sans uracile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>2. Réactions PCR </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM chacun</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymérase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse(II) tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&ordm ; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymérase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>Pour erreur prone PCR</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>3. Linéarisation plasmidique </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction Not I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Rouge</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Pour la coloration de l’ADN</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4. Dosages FOX </fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de fer(II) d’ammonium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&ordm ; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&ordm ; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&ordm ; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène 30 %</td> <td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX courbe standard</td></tr><tr><td>Xylenol Sel disodique d’orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&ordm ; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Société</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>5. Agarose gel stuff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&ordm ; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Colorant d’analyse de l’ADN</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>ADN M.W. standard</td></tr><tr><td>Colorant de chargement 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à basse température de fusion</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>N° CAS 39346-81-1</td></tr><tr><td><Nom>fort</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>6. Kits et cellules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae souche BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Souche déficiente en protéase avec génotype : MAT&alpha ; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4 ::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue cellules compétentes</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>Pour la purification et l’amplification des plasmides</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et PCR Kit</td> <td>de nettoyageMacherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>Extraction de gel d’ADN</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr>de<td>transformation de levure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Inclus Support d’ADN (testicules de saumon)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Extraction de plasmides à partir de yeast</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>7. Plaques</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Polystyrène transparent, non stérile (pour les mesures d’activité)</td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Polystyrène transparent, stérile (pour les microfermentations)</td></tr><tr><td>Couvercle à plaques à 96 puits</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Polystyrène transparent, stérile (pour les microfermentations)</td></tr></tbody></table>

réalisé evolution méthode<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt;: mutant library création et dépistage

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

L&#39; évolution dirigée dans Saccharomyces cerevisiae offre de nombreux avantages attrayants lors de la conception d&#39; enzymes pour des applications biotechnologiques, un processus qui implique la construction, le clonage et l&#39; expression de bibliothèques de mutants, couplé à haute fréquence recombinaison homologue de l&#39; ADN in vivo. Ici, nous présentons un protocole pour créer et bibliothèques de mutants d&#39;écran dans la levure basé sur l&#39;exemple d&#39;un champignon aryl-alcool oxydase (AAO) pour renforcer son activité totale. Deux segments de protéines ont été soumis à l&#39; évolution concentrée dirigée par mutagenèse aléatoire et in vivo la recombinaison de l&#39; ADN. Surplombs de ~ 50 pb flanquant chaque segment a permis au réassemblage correcte du gène AAO-fusion dans un vecteur linéarisé donnant naissance à un plasmide à réplication autonome complète. Bibliothèques de mutants fonctionnels enrichis avec des variantes AAO ont été criblés dans S. Les surnageants cerevisiae avec un dosage à haut débit sensible à la base de la réaction de Fenton. Le processus général deconstruction d&#39;une banque de S. cerevisiae décrit ici peut être facilement appliquée à évoluer beaucoup d&#39; autres gènes eucaryotes, en évitant des réactions PCR supplémentaires, in vitro recombinaison de l&#39; ADN et ligature étapes.

AAO de P. eryngii est un flavooxidase extracellulaire qui fournit des peroxydases fongiques par H 2 O 2 pour commencer à attaquer la lignine. Deux segments de AAO ont été soumis à l&#39; évolution centrée dirigée par MORPHING afin d&#39;améliorer son activité et son expression dans S. cerevisiae 19. Indépendamment des enzymes étrangers hébergés par S. cerevisiae, la question la plus critique lors de la construction des bibliothè...

Nous présentons un protocole détaillé pour construire et cribler des banques de mutants pour des campagnes d’évolution dirigée chez Saccharomyces cerevisiae.

Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

L'objectif général de ce protocole est de montrer comment construire et analyser des bibliothèques de mutants chez Saccharomyces cerevisiae pour des expériences d'évolution dirigée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la création en laboratoire utilisée pour des expériences ciblées d'évolution dirigée, telles que la manière d'attribuer des régions chevauchantes lors de l'assemblage et du clonage. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité et sa robustesse, car en une seule étape de transformation, des niveaux de qualité élevée peuvent être obtenus.Ce protocole de création et de criblage de bibliothèques de mutants sera illustré à l’aide d’une aryldéshydrogénase alcoolique fongique, ou AAO. Les régions destinées à l’évolution dirigée ciblée sont tout d’abord choisies à l’aide d’algorithmes informatiques, en se basant sur la structure cristalline disponible ou sur des modèles d’homologie de l’enzyme. Deux régions de l’AAO feront l’objet d’une mutagenèse aléatoire et d’une recombinaison : la région M1 et la région M2.Une PCR mutagène sera réalisée pour amplifier les régions ciblées. Afin de favoriser l'épissage in vivo chez la levure, des régions chevauchantes entre segments d'environ 50 paires de bases chacune seront créées en superposant des réactions de PCR des régions définies. Préparez des PCR mutagènes de volume 50 microlitres, chacune contenant 46 nanogrammes de matrice d'ADN, 90 nanomolaires de chacun des amorces sens et antisens, 0,3 millimolaire de dNTP, 3 % de DMSO, 1,5 millimolaire de chlorure de magnésium, 0,5 millimolaire de chlorure de manganèse et 0,5 unité par microlitre de l'ADN polymérase tack.Utilisez le programme de PCR suivant : 95 degrés Celsius pendant deux minutes, 95 degrés Celsius pendant 45 secondes, 50 degrés Celsius pendant 45 secondes et 74 degrés Celsius pendant 45 secondes, répété 28 cycles, puis 74 degrés Celsius pendant 10 minutes. Le reste du gène AAO, la région HF, sera amplifié par PCR haute fidélité en utilisant des régions correspondantes chevauchant les segments mutagènes et/ou les extrémités en surplomb du vecteur linéarisé.Préparer la PCR haute fidélité dans un volume final de 50 microlitres contenant 10 nanogrammes de matrice d'ADN, 250 nanomolaires de chacun des amorces sens et antisens, 0,8 millimolaire de dNTP, 3 % de DMSO et 0,2 unité par microlitre de polymérase ADN iProof ultra haute fidélité. Utiliser le programme PCR suivant : 98 degrés Celsius pendant 30 secondes, 98 degrés Celsius pendant 10 secondes, 55 degrés Celsius pendant 25 secondes et 72 degrés Celsius pendant 45 secondes pendant 28 cycles, puis 72 degrés Celsius pendant 10 minutes.Tous les fragments d'AMP sont ensuite purifiés à l'aide d'un kit commercial d'extraction sur gel, conformément au protocole du fabricant. L'étape suivante consiste à linéariser le vecteur afin de créer des régions flanquantes d'environ 50 paires de bases homologues aux extrémités 5' et 3' du gène cible. Préparez un mélange de réaction de linéarisation de 20 microlitres contenant 2 microgrammes d'ADN, 7,5 unités de BamH1, 7,5 unités de Xho1, 20 microgrammes d'BSA et deux microlitres de tampon 10x BamH1.Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant deux heures et 40 minutes. Ensuite, inactiver la réaction à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour purifier le vecteur linéarisé et éviter toute contamination par le plasmide circulaire résiduel, charger le mélange de réaction de digestion dans la mega-borne d'un gel d'agarose à point de fusion bas de type semi-préparatif.Chargez cinq microlitres du mélange réactionnel dans le puits adjacent comme témoin. Effectuez l'électrophorèse de l'ADN à quatre degrés Celsius et à cinq volts par centimètre entre les électrodes. Puis séparez le gel d'agarose correspondant au méga-puits et conservez-le à quatre degrés Celsius dans un X TAE.Colorer la piste avec l'échelle de poids moléculaire et le témoin. Visualiser les bandes sous lumière UV et entailler l'emplacement où se situe le vecteur linéarisé. En l'absence de lumière UV et en utilisant les entailles de la piste témoin colorée comme guide, repérer le vecteur linéarisé dans le fragment du mega-puits et l'exciser.Extrayez le vecteur linéarisé de l'agarose et purifiez-le à l'aide d'un kit commercial de purification sur gel, conformément au protocole du fabricant. Ensuite, mélangez le vecteur linéarisé purifié avec les fragments PCR et utilisez ce mélange d'ADN pour transformer des cellules de levure compétentes à l'aide d'un kit commercial, selon les instructions du fabricant. Ensemencez les cellules transformées sur des plaques SC sans complément et incubez-les à 30 degrés Celsius pendant trois jours.Pour préparer ce test, prélevez des colonies individuelles à partir des plaques SC sans nutriment et transférez-les dans des plaques 96 puits contenant 50 microlitres de milieu minimal par puits. Dans chaque plaque, inoculez la colonne numéro six avec le type parental comme témoin interne. En tant que contrôle négatif, inoculez le puits H1, rempli de milieux SC supplémentés en uracile, avec des cellules viscérales ESI URA3 négatives ne contenant aucun plasmide.Couvrez les plaques avec leurs couvercles, enveloppez-les dans du film parafilm et incubez-les à 30 degrés Celsius dans un agitateur humide pendant 48 heures. Après 48 heures, ajoutez 160 microlitres de milieu d'expression dans chaque puits et refermez hermétiquement les plaques. Incubez pendant encore 24 heures.Après centrifugation des plaques, utilisez un robot de manipulation liquide à stations multiples pour transférer 20 microlitres du surnageant des puits de chaque plaque vers une plaque miroir. Ajoutez 20 microlitres d'alcool P-méthoxybenzyle à deux millimolaires et un tampon phosphate de sodium à 100 millimolaires, pH 6,0, dans chaque puits. Mélangez brièvement les plaques à l’aide d’un agitateur pour plaque 96 puits et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez 160 microlitres du réactif FOX dans chaque plaque de réplication et mélangez brièvement à l’aide du mélangeur. Lisez les plaques à 560 nanomètres sur un lecteur de plaques. Incubez les plaques à température ambiante jusqu’à développement de la couleur.Effectuez à nouveau la mesure de l'absorption. L'activité relative est calculée à partir de la différence entre la valeur d'absorption après incubation et celle de la mesure initiale, normalisée par rapport au type parental pour chaque plaque. Cette image représentative de gel montre le vecteur linéarisé dans la piste deux, le fragment PCR M1 dans la piste trois, le fragment PCR M2 dans la piste quatre, le fragment PCR HF dans la piste cinq, et le vecteur réassemblé in vivo, linéarisé avec NHE1, dans la piste six.Ce gel suivant montre la minipréparation du vecteur réassemblé dans la piste deux, le plasmide linéarisé avec NHE un dans la piste trois, le plasmide linéarisé avec BamH un et XHO un dans la piste quatre, et le plasmide linéarisé obtenu par extraction sur gel et purification dans la piste cinq. Les charges mutagéniques ont été ajustées en échantillonnant des bibliothèques de mutants présentant différents paysages, en calculant le nombre de clones possédant moins de 10 % de l'activité enzymatique parentale, puis en confirmant ces résultats par séquençage d'un échantillon aléatoire de variants actifs et inactifs. Une évaluation de la limite de détection de ce dosage a montré que le dosage était linéaire en présence de sorbitol, représenté par des cercles noirs.En l'absence de sorbitol, représentée par les carrés blancs, la linéarité était plus persistante, mais la réponse était plus faible. Une corrélation linéaire a été observée entre la concentration en AAO et l'absorbance. Une bibliothèque de mutants composée de 2 000 clones a été construite et criblée à l'aide de ce dosage.Le carré ombré indique les mutants d'AAO présentant une sécrétion et une activité notablement améliorées contre l'alcool p-méthoxybenzylique. Une fois maîtrisée, la construction de bibliothèques de mutants peut être réalisée en environ quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien attribuer des zones de recouvrement appropriées à chaque famille de PCR et au vecteur linéarisé, afin d'assurer l'épissage et le clonage in vivo en une seule étape de transformation.En suivant une approche similaire, d'autres méthodes telles que l'échantillonnage d'ADN in vivo, la bibliothèque de mutagenèse par saturation ou l'assemblage d'ADN peuvent être réalisées afin de construire des bibliothèques de mutants et/ou des voies métaboliques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du génie biologique pour explorer les activités, les stabilités ou même inventer une infinité de types d'interactions. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser cet outil Saccharomyces Cerevisiae pour la construction et le criblage de bibliothèques.

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