Name: Visualisation des Twitching motilité et caractérisation du rôle de la Pilg in Xylella fastidiosa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez la caractérisation fonctionnelle de la motilité par secousses chez Xylella fastidiosa à l'aide d'une chambre d'écoulement nano-microfluidique. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes pathogènes de cette bactérie responsable de la maladie de Pierce.

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Cette étude a été soutenue par United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Les noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cette publication sont mentionnés uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et ne signifie pas qu&#39;ils sont approuvés par le ministère de l&#39;Agriculture des États-Unis. L&#39;USDA est un fournisseur d&#39;égalité des chances et de l&#39;employeur.

1. Le périphérique de Fringe bactérienne Colony <ol><li> Cultivez X. fastidiosa (Xf) Temecula de type sauvage 22, Pilg suppression mutant Xf ΔpliG ( en utilisant la stratégie de suppression décrit précédemment 23), et son complémentaire XfΔpliG -C ( en utilisant précédemment décrit sur ​​la base du chromosome stratégie de complémentation génétique 24) sur PD2 moyen des plaques de gélose 25 à 28 ° C pendant 5-7 jours. </li><li> Cellophane autoclave (1 x 1 cm 2) dans l&#39; eau à 121 ° C (249 ° F) pendant 15 minutes. Ramassez un morceau de cellophane, drainer l&#39;eau en touchant un coin de cellophane sur une boîte de Pétri vide, soigneusement jeter les cellophane plus de 15% de la surface de la gélose et l&#39;air sec. </li><li> Pick - up individuel X. colonies fastidiosa avec des cure - dents stériles arrondies et des cellules d&#39;accompagnement aseptique sur une feuille de cellophane stérilisée superposée sur les 15% de la surface de la gélose dans les plaques d&#39; agar. Incuber la plaques à 28 ° C pendant 2-3 jours. </li><li> Examiner la morphologie de bord des colonies en utilisant un microscope à dissection avec une lentille d&#39;objectif 2X et une lentille oculaire 10X. Photographier la frange périphérique autour des colonies. </li></ol> 2. Microscopie et microfluidiques débit Chambers <ol><li> Fabriquer des dispositifs microfluidiques en utilisant des procédures de photo-lithographique similaires à celles décrites précédemment 5,18. Concevoir quatre canaux parallèles avec le logiciel de conception assistée par ordinateur sur maître plaquette de silicium en utilisant des méthodes lithographiques standards 26. </li><li> Créer les chambres microfluidiques du maître de la plaquette de silicium avec polydiméthylsiloxane (PDMS). Verser PDMS polymérisés sur le maître de la plaquette de silicium et guérir à 60 ° C pendant 1 heure. Décoller la réplique PDMS du maître de plaquette et de l&#39;assiette de la réplique PDMS avec une lame en un 22 mm x 40 mm que la même taille d&#39;une lamelle de verre. </li><li> Exposer la réplique PDMS, une lamelle de verre (22 x 40 mm 2), et une Microsctoboggan ope (51 x 76 mm 2) à un plasma d&#39;air à 30 W pendant 2 min 27. Prendre en sandwich le corps PDMS entre la lamelle de verre et le microscope en verre pour la construction de la chambre de micro fl uidique. </li><li> Percer un trou (diamètre 5,5 mm) à travers le PDMS à chaque extrémité du canal à motifs. Couper le tube en caoutchouc de silicone dans 12-20 cm de long. Insérez une extrémité du tube de caoutchouc de silicone (5,1 mm de diamètre extérieur, 2,1 mm de diamètre intérieur, 0,8 mm mur) dans chaque extrémité d&#39;ouverture des canaux de la réplique de PDMS, et le sceller avec PDMS polymérisés à 60 ° C pendant 1 heure. </li><li> Branchez l&#39;autre extrémité du tube à l&#39;extrémité cannelée de connecteurs luer plastique. Envelopper les chambres microfluidiques assemblées avec la feuille d&#39;aluminium et autoclaver pendant 20 min. </li><li> Collecter bactéries cellules de X. fastidiosa type sauvage, mutant Xf ΔpliG, et complémentaire XfΔpliG C par raclage, en utilisant inoculant jetables boucles à partir de plaques moyennes PD2. Ajuster la densité cellulaireà une densité optique de 0,05 à 600 nm dans un bouillon PD2 23 comme décrit précédemment. Recueillir la solution de cellules bactériennes dans un 1 ml Gastight seringue. </li><li> Monter le dispositif microfluidique sur un étage de microscope inversé. Connecter un tube d&#39;entrée à la seringue de 5 ml de bouillon Gastight contenant PD2. Monter le 5 ml Gastight seringue avec les pompes à seringue. </li><li> Connectez le tube de sortie à un réservoir de déchets. Maintenir un débit moyen de 0,2 ul min -1 pendant 30 min pour stabiliser le système. </li><li> Raccorder des tubes latéraux d&#39;entrée à une seringue de 1 ml contenant la solution étanche au gaz de la cellule bactérienne. Rincer la solution de la cellule bactérienne à travers le tube en caoutchouc jusqu&#39;à ce que la chaîne soit atteinte. Maintenir un débit moyen de 0,2 pi min -1 pendant 30 minutes afin de vider les cellules non liées de la chambre avant la capture d&#39; image. </li><li> Monter l&#39;obturateur de microscope sous la partie de terrain ajusté du microscope pour contrôler la lumière. Connecter le déclencheur pour la coopération de l&#39;obturateursystème ntrol et connecter le système de contrôle de l&#39;obturateur à l&#39;ordinateur. </li><li> Monter un appareil photo numérique au port vidéo du microscope et le connecter à l&#39;ordinateur. Exécutez le logiciel d&#39;enregistrement time-lapse, sélectionnez la fonction &quot;de l&#39;obturateur&quot; dans le menu, et reconnaître automatiquement l&#39;obturateur installé par défaut dans le logiciel pour établir des connexions à l&#39;obturateur avec le logiciel. </li><li> Sélectionnez la fonction &quot;appareil photo numérique&quot; dans le menu du logiciel d&#39;enregistrement time-lapse pour reconnaître automatiquement l&#39;appareil photo numérique comme périphérique de capture par défaut dans le logiciel et établir la communication avec l&#39;appareil photo numérique avec le logiciel. </li><li> Repérez les cellules bactériennes dans un des canaux en utilisant 20X optique à contraste de phase, puis passer à l&#39;objectif 40X avant la capture d&#39;image. </li><li> Exécutez le logiciel d&#39;enregistrement time-lapse, sélectionnez la fonction «d&#39;acquisition d&#39;image&quot; en utilisant les paramètres par défaut dans le menu pour acquérir les images du microscope.Ensuite, ouvrez la fonction &quot;Acquérir time-lapse» et définir l&#39;intervalle de temps de 30 sec 5,18,28 pour une durée de 6-24 heures en fonction de l&#39; expérience nécessaire pour observer la motilité tics de X. fastidiosa 5,18,28. Cliquez sur &quot;OK&quot; pour démarrer l&#39;enregistrement time-lapse. Cliquez sur &quot;fonction Stack&quot; à partir du menu, sélectionnez &quot;enregistrer sous&quot; pour empiler les images dans le dossier de destination sur l&#39;ordinateur après avoir terminé l&#39;enregistrement. </li><li> Pour de multiples canaux, capturer des images en accéléré du premier canal toutes les 30 secondes pendant 6 heures. Déplacer la lentille de l&#39;objectif du microscope sur le canal suivant pour localiser les cellules cibles. Répéter la fonction du temps écoulé tel que décrit ci-dessus pour capturer des images dans chacun des quatre canaux de manière séquentielle si l&#39;expérience est configuré pour utiliser quatre canaux. Poursuivre le time-lapse capture d&#39;image pour aussi longtemps que trois jours consécutifs. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante (23 ± 2 ° C). </li><li> Compiler les images time-lapse dans unfichier vidéo en utilisant le logiciel d&#39;imagerie d&#39;enregistrement time-lapse. logiciel d&#39;enregistrement Run time-lapse, cliquez sur &quot;fonction Stack&quot; dans le menu, et sélectionnez la fonction &quot;pile ouverte&quot; pour ouvrir les fichiers empilés de l&#39;ordinateur. </li><li> Démarrer la fonction &quot;Faire un film&quot; à partir du module de pile, sélectionner toutes les images et en choisissant le format &quot;AVI&quot; de sortie. Cliquez sur &quot;Enregistrer sous&quot; pour enregistrer le fichier vidéo dans le dossier de destination sur l&#39;ordinateur. </li><li> Sélectionnez les films compilés à partir du dossier de destination sur l&#39;ordinateur et les lire. Ensuite, observer la motilité des cellules individuelles par la visualisation résultant de l&#39;activité des contractions motilité des cellules bactériennes dans les fichiers vidéo générés. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans cette étude, nous avons caractérisé le comportement de mouvement de X. fastidiosa Pilg mutant Xf ΔpilG et ses souches complémentaires XfΔpilG- C dans nouvellement conçu-nano-canaux parallèles micro multiples chambres fl uidique. Les nouvellement conçu micro fl uidique chambres peuvent avoir jusqu&#39;à quatre chambres parallèles avec 100 um nano-canal dans la largeur par rapport aux modèles antérieurs avec un seul 50 m de large canal 18. Le canal nano plus lar...

Xylella fastidiosa est une bactérie pathogène Gram-négatif non flagellé, qui provoque un certain nombre de maladies des cultures économiquement importantes, y compris la maladie de Pierce de la vigne (Vitis vinifera) 1,2, 3. Cette bactérie est limitée à la xylème conduite d&#39;eau navires. Infection de la vigne provoque le blocage des vaisseaux du xylème et des résultats dans le stress hydrique et les carences nutritionnelles 3. Colonisation réussie dépend de l&#39;aptitude de la bactérie à se déplacer à partir du site initial d&#39;infection pour le reste de la plante 3. Secousses motilité est un moyen de mouvement bactérienne flagellaire indépendante à travers l&#39;extension, l&#39; attachement et la rétraction de type polaire IV pili 4 qui a été caractérisé en X. fastidiosa 5,6,7. La motilité des secousses a été observé par des pinces laser et microscopie à force atomique (AFM) 8,9,10. En utilisant ces techniques, tmotilités witching générés par type IV pili de N. gonorrhoeae et P. aeruginosa ont été caractérisées par fl pili d&#39;étiquetage uorescently et capturer leurs mouvements microscopiques. Bien que les deux méthodes ont détaillé la force adhésive de bactéries individuelles, les procédures sont compliquées et prennent du temps 9,10. Les micro fl uidique chambres ont été utilisés pour observer la migration à longue distance des cellules individuelles, ainsi que de petits agrégats de cellules bactériennes 5,6. Ces chambres ont été conçues comme un nano-canal microfabriqué dans une plaque intégrée avec un time-lapse système d&#39;enregistrement d&#39;image 11,12,13,14. Micro fl dispositifs de chambre uidique offrent plusieurs avantages pour étudier le comportement de mouvement et cellule-cellule interactions de bactéries: (i) il fournit une plate-forme intégrée avec de multiples capacités de canal; (Ii) il peut examiner les motions et agrégations de cellules individuelles dans les caractéristiques à l&#39;échelle nanométrique de bactéries; (Iii) elle permet m directeicroscopic enregistrement d&#39;images de cellules bactériennes et l&#39;analyse time-lapse, (iv) il fournit des observations spatiales et temporelles à long terme des populations individuelles et / ou de bactéries dans un micro-environnement; (V) le débit du milieu de culture dans un canal peut être contrôlée avec précision et (vi) seulement un très petit volume (1 ml) de milieu de culture est nécessaire pour chaque expérience. Récemment, le fl uidique fl ow système micro a été utilisé pour étudier les comportements des cellules bactériennes dans diverses microenvironnements 14,15,16. L&#39;adhérence et la fixation de surface de E. coli 15 X. fastidiosa 16 et Acidovorax citrulli 14 aux surfaces de verre ont été évaluées à l&#39; aide de micro fl uidique chambres. La formation et l&#39; agrégation bio fi lm médiée par pili de type IV de Acidovorax citrulli ont été analysées 14. En outre, le mouvement de A. citrulli observée sous fl ux conditions ont démontré que le pili de type IV peut jouer un rôle important dans la colonisation et la propagation de A. citrulli dans les vaisseaux du xylème sous aubier fl ow conditions. Les motilités de secousses de Pseudomonas aeruginosa et X. fastidiosa cellules ont été observées avec succès contre un courant de fluide dans une chambre d&#39;écoulement microfabriqué 5,6,17. Pili de type IV deficient mutants et PilB pilQ de X. fastidiosa ont été trouvés pour modifier profondément la vitesse de secousses motilité dans les conditions de fl ux dans les micro - dispositifs fl uidique 5,6,18. Les études menées sur l&#39; adhésion des bactéries et de la mobilité dans des dispositifs micro fl uidique indiquent que les micro fl uidique chambres sont particulièrement appropriés pour l&#39; analyse de la motilité des tics et de la migration des bactéries médiée par pili in vitro. Ces résultats expliquent le mécanisme de migration des contractions médiée qui facilite la fixation cellule-cellule, l&#39;agrégation et de la colonisation dans lesl&#39;hôte, éventuellement conduire à une infection systémique. Pil-Chp opéron de X. fastidiosa contient Pilg, Pili, pilJ, Pill, CHPB et epa signal qui encode la transduction pathways 20. Les chémorécepteurs transmembranaires lient des stimuli chimiques dans le domaine périplasmique et activent une cascade de signalisation dans leur partie cytoplasmique de contrôler finalement bactérienne tics motilité. Dans l&#39;opéron Pil-Chp de X. fastidiosa, une protéine phospho-Pilg de navette est un homologue de CheY. Dans E. coli et P. aeruginosa, CheY est le régulateur de réponse dans les systèmes de chimiotaxie qui interagissent avec les protéines motrices de flagelles 19, 21. Bien que les contributions de l&#39;opéron Pil-Chp vers la virulence dans X. fastidiosa a été examinée récemment 20, le rôle de la chimiotaxie Pilg dans opéron en réponse aux signaux de l&#39; environnement régulé et / moteur pili de type IV de X. fastidiosa est unclear. Pour élucider la compréhension du régulateur de chimiotaxie Pilg dans l&#39;activité de motilité des tics X. fastidiosa, une chambre fl uidique micro est utilisé pour évaluer la motilité des secousses de X. fastidiosa. Le Pilg de X. fastidiosa se ​​caractérise en comparant les phénotypes d&#39;un mutant de délétion Xf ΔpliG, souche complémentaire XfΔpliG C et son type sauvage in vitro. Les résultats mettent en évidence le rôle de Pilg dans la motilité des secousses de X. fastidiosa.

<table><tbody><tr><td>Biology materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., et al., 2004 22</td></tr><tr><td>pilG mutant de délétion Xf&Delta ; pliG</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., et al., 2007 26</td></tr><tr><td>pilG souche complémentaire Xf&Delta ; pliG-C&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Davis, M. J., et al. 1998 23</sup</td></tr><tr><td>>Matériaux et équipements physiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation jetables</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>procédures quantitatives telles que la collecte bactérienne</td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 silicone Kits élastomères</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 appareil photo numérique</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>Image, enregistrement vidéo et mesure&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ligne de tubes</td><td>Edgewood, NY</td>#T4300 <td></td><td>Connecté à la seringue et à la chambre microfluidique</td></tr><tr><td>Connecteurs Luer en plastique</td><td>Edgewood, NY</td><td></td><td>Connecté à la seringue et à la chambre microfluidique Pompes à</td></tr><tr><td>seringue</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td><td>#702209</td><td>Le débit peut être ajusté pendant que la pompe fonctionne.</td></tr><tr><td>Seringues</td><td>Gastight, Hemilton Company, Reno, NV#</td><td>1005</td><td>Fournir le bouillon qui coule</td></tr><tr><td>Microscope inversé Olympus IMT-2 Olympus</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>Observation et enregistrement d’images</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique SPOT-RT</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>Image, enregistrement et mesure</td></tr> vidéo <tr><td>Obturateur de microscope</td><td>The UNIBLITZ, US</td><td>#LS2T2</td><td>Caméra de contrôle » s temps d’exposition</td></tr><tr><td>Système de contrôle de l’obturateur du microscope</td><td>The UNIBLITZ, US</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 Pilote d’obturateur monocanal approuvé CE/UL/CSA</td></tr><tr><td>Logiciel d’image MetaMorph Logiciel</td><td>d’image Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Traitement d’image super-résolution en temps réel&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

visualisation des twitching motilité et caractérisation du rôle de la<em&gt; pilg</em&gt; in<em&gt; xylella fastidiosa</em

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa est une bactérie non flagellée Gram négatif qui provoque un certain nombre de maladies économiquement importantes de plantes. La motilité des secousses fournit X. fastidiosa un moyen de déplacement à longue distance intra-plante et de la colonisation, contribuant à la pathogénicité dans X. fastidiosa. La motilité tics de X. fastidiosa est exploité par pili de type IV. Pili de type IV de Xylella fastidiosa sont réglementés par Pilg, un régulateur de chimiotactisme dans Pil-Chp codant pour des protéines de l&#39; opéron qui sont impliqués avec des voies de transduction du signal. Pour élucider le rôle des Pilg dans la motilité des secousses de X. fastidiosa, un Pilg mutant déficient Xf ΔpilG et sa souche complémentaire XfΔpilG- C contenant native Pilg ont été développés. A chambres microfluidiques intégrés avec un système d&#39;enregistrement d&#39;image time-lapse a été utilisé pour observer la motilité des contractions dans XfΔpIlg, XfΔpilG- C et sa souche de type sauvage. Grâce à ce système d&#39;enregistrement, il permet des observations spatiales et temporelles à long terme de l&#39; agrégation, la migration des cellules et des populations de bactéries via des tics motilité individuels. X. fastidiosa type sauvage et complémentaire souche XfΔpilG- C ont montré des caractéristiques typiques des secousses de la motilité directement observées dans les chambres d&#39;écoulement microfluidiques, alors que le mutant XfΔpliG présentait le phénotype déficient secousses. Cette étude démontre que Pilg contribue à la motilité des secousses de X. fastidiosa. La chambre d&#39;écoulement microfluidique est utilisé comme un moyen pour l&#39; observation des tics motilité.

La présence d&#39;une colonie frange périphérique indicative de pili de type IV à médiation par secousses motilité a été observée dans les colonies de X. fastidiosa type sauvage et complémentaire souche Xf ΔpliG -C (Figure 1). Mutant XfΔpliG, cependant, ne présentent pas une frange autour de la périphérie des colonies (figure 1). Imagerie time-lapse de cellules bactériennes dans des chambres d&#39;écoulement nano-micro...

Dans cette étude, une chambre d&#39;écoulement nano-microfluidique a été utilisé pour visualiser et caractériser fonctionnellement la motilité des secousses de Xylella fastidiosa, une bactérie qui cause la maladie de Pierce de la vigne.

Visualisation des Twitching motilité et caractérisation du rôle de la<em&gt; Pilg</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

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