Un tissu combiné 3D Conçu

Les objectifs globaux de ce modèle combiné de cancer du poumon in vitro et in silico sont d’étudier la sensibilité des thérapies ciblées contre le cancer du poumon non à petites cellules et de prédire l’efficacité de nouvelles substances. Ce système de modèle 3D permet de suivre les réponses spécifiques des cellules à des traitements ciblés ou à des combinaisons directes. Le principal avantage de cette technique est que les prédictions in silico peuvent faciliter les tests précliniques de médicaments dans un environnement plus pertinent sur le plan physiologique.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de différentes entités tumorales, car elle peut être utilisée pour optimiser les prédictions de réponse aux médicaments en fonction de contextes mutationnels spécifiques. La démonstration de la procédure sera faite par Franziska Schmitt, assistante de recherche, de notre laboratoire. Pour mettre en place une culture dynamique, commencez par cultiver le modèle tumoral dans des conditions de culture statiques, dans une couronne cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, dans un incubateur classique.

Après trois jours, assemblez un bioréacteur autoclavé et insérez dans le système un sous-mucoso biologique de l’intestin grêle et un échafaudage de muqueuse ensemencés. Ensuite, ajoutez 45 millilitres de RPMI, complétés par la quantité appropriée de FCS dans un ballon et connectez le dispositif d’échantillonnage sans aiguille au système de tuyauterie entre le bioréacteur et le ballon de milieu. Placez le bioréacteur dans l’incubateur et connectez-le à la pompe pour cultiver le modèle de tumeur, pendant 14 jours supplémentaires, avec un débit constant de trois millilitres par minute.

Pour traiter un modèle de tumeur statique avec, le Gefitinib, au 11e jour de culture dans l’incubateur conventionnel, utilisez d’abord une pipette pasteur pour retirer l’ancien milieu des puits. Ensuite, ajoutez un millilitre de RPMI fraîchement préparé, complété par du FCS et du Gefitinib, à l’intérieur de chaque couronne cellulaire et 1,5 millilitre au fond de chaque puits. Pour prélever les échantillons d’Elisa à partir d’une culture dynamique, les jours 11 à 14 de la culture, fixez la seringue au dispositif d’échantillonnage et retirez un millilitre de milieu du système du bioréacteur.

Stockez ensuite les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’Elisa soit effectuée. Pour déterminer le nombre de noyaux positifs au Ki67, utilisez d’abord un microscope inversé pour obtenir cinq images fluorescentes de coloration DAPI et cinq images fluorescentes de coloration Ki67 de cultures 2D à un grossissement de 20 fois de chaque condition, à partir de sections non chevauchantes de l’échantillon. Pour compter manuellement les noyaux positifs Ki67, ouvrez l’image émergée dans Fidji et sélectionnez, Plugins, et Compteur de cellules, puis, cliquez sur initialiser, sélectionnez un type de compteur et cliquez sur chaque noyau positif Ki67.

Le nombre de cellules cliquées apparaîtra à côté du type de compteur sélectionné. Pour le comptage automatique des cellules du nombre total de noyaux dans les images 2D, démarrez l’enregistreur de macros, ouvrez une image DAPI et cliquez sur image, tapez et 8 bits, puis cliquez sur améliorer le contraste et définissez le paramètre saturé sur un et normaliser. Pour améliorer la netteté de l’image, réglez le masque flou, en utilisant un rayon de un et un masque de 60.

Pour relier l’image, cliquez sur le seuil automatique et choisissez la méthode Reny/Entropy avec des objets blancs sur fond noir. Ensuite, cliquez sur Plugins, suivi de BioVoxxel, et de la fonction irrégulière du bassin versant, avec un rayon d’érosion de cinq pour séparer les cellules. Cliquez sur analyser, puis sur analyser les particules, sur 02 infini et sur la case résumer.

Le nombre de cellules sera affiché dans le tableau récapitulatif sous forme de nombres. Ensuite, cliquez sur créer, pour enregistrer la macro afin de permettre le comptage automatique des noyaux, dans d’autres images de culture cellulaire 2D. Après avoir utilisé des bases de données connues pour générer un réseau tumoral, ouvrez le logiciel d’analyse de réseau approprié, cliquez sur fichier et nouveau, puis entrez jove modèles tumoraux.

Cliquez sur ok, pour générer un nouveau réseau, puis cliquez, gros plan carré Nord et ok, pour visualiser le récepteur dans une double membrane. Pour visualiser les nœuds sous forme de rectangles, cliquez sur protéine générique, puis sur EGFR, puis Ok.To étiquetez les nœuds du réseau, cliquez avec le bouton droit de la souris pour changer la couleur et la forme, et définissez les codes de couleur des nœuds comme indiqué. Pour visualiser les paramètres de lecture sous forme d’hexagones, sélectionnez, phénotypez, entrez prolifération, puis cliquez sur OK.

Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez à nouveau Modifier la couleur et la forme pour définir le code couleur sur 255, 204, 204. Pour visualiser les bords des interactions de nœud, cliquez sur Transition d’état pour les flèches d’activation et sur Inhibition pour les flèches d’inhibition émoussées. Ensuite, cliquez sur fichier et enregistrez sous, puis enregistrez le réseau de signalisation généré, en tant que models.xml de tumeur

Pour l’analyse en régime permanent de l’équilibre du système, ouvrez le logiciel SQUAD, cliquez sur charger le réseau et téléchargez le fichier models. xml de la tumeur jove. Cliquez, lancez l’analyse.

Pour écrire un protocole de simulation, cliquez sur avancé et pertubator, puis sur modifier le protocole pour simuler la résistance anti-EGFR. Ensuite, cliquez sur pertubation et sélectionnez l’état initial standard est égal à l’état stable quatre. Cliquez sur Ajouter pour ajouter la nouvelle impulsion constante, puis sélectionnez le paramètre d’état et définissez la cible sur FLIP, le temps sur zéro et la valeur sur 4.

Cliquez sur OK et définissez les états pour c-MET et Gefitinib, de la même manière. Pour définir une valeur d’état sur le nœud EGFR actif, cliquez sur Nœud actif, puis sur Modifier. Réglez l’état sur 8 et cliquez sur OK.

Cliquez sur OK pour enregistrer le protocole. Pour afficher les courbes spécifiques, sous le panneau d’options, sélectionnez EGF-EGFR, EGF-EGFR étoile, Mek étoilé, caspases, PI3K, Gegitinib, apoptose, prolifération, inhibiteur de MEk et inhibiteur de PI3K. Ensuite, cliquez sur initialiser et exécuter pour démarrer une simulation complète de la réponse du système.

Pour simuler un traitement combiné par inhibiteur de PI3K et de Mek, cliquez sur Modifier le protocole. Ensuite, en utilisant le même paramètre de nœud que celui qui vient d’être démontré, cliquez sur pertubation, suivi de ajouter, pour ajouter une nouvelle impulsion constante. Ensuite, sélectionnez un paramètre d’état et définissez la cible sur l’inhibiteur PI3K, le temps jusqu’à zéro et la valeur sur un, puis cliquez sur OK.

Cliquez à nouveau sur Ajouter pour ajouter une autre nouvelle impulsion constante et, sous le paramètre d’état, définissez la cible sur l’inhibiteur de Mek, réglez le temps sur zéro et la valeur sur un, puis cliquez sur OK, puis sur OK à nouveau, pour enregistrer le protocole. Dans le panneau d’options, en utilisant les mêmes nœuds pour la représentation graphique que ceux qui viennent d’être démontrés, cliquez sur initialiser et exécuter pour démarrer une simulation complète de la réponse du système. Ensuite, pour terminer la simulation, cliquez sur réinitialiser.

Ce système de test de tumeur 3D, facilite la détermination de l’indice de prolifération. Et la quantification de l’apoptose à l’aide de M30 Elisa. Dans cette expérience représentative, par exemple, seules les cellules tumorales HCC827 mutées EGFR, incubées dans des conditions de culture statiques, ont répondu à l’inhibition du facteur de croissance épidermique.

Par l’inhibiteur de la tyrosine-kinase, le géfitinib, comme en témoigne l’augmentation de l’apoptose observée dans le système modèle tumoral HCC827. Ici, des images représentatives de modèles tumoraux statiques en 3D, avec ou sans, inducteur de transition épithélio-mésenchymateuse, simulation TGF-bêta-1, sont présentées. Notez l’augmentation de l’expression de la vimentine, dans les cultures de cellules tumorales traitées.

Dans des conditions dynamiques, le géfitinib exerce un effet robuste sur les cellules HCC827 mutées par l’EGFR, comme en témoigne la diminution des structures de type tissulaire, en présence de l’inhibiteur de la tyrosine-kinase, par rapport à la culture contrôlée non traitée. Dans ce graphique, la simulation de l’entraînement connu dans la mutation, la co-activation de l’EGFR et du c-MET, et l’augmentation du taux de prolifération, et une diminution du taux d’apoptose dans les cellules HCC827, au fil du temps, sont observées, reflétant une résistance induite par le Gefitinib qui est en corrélation avec l’activation de MEK et PI3K. En effet, la modélisation des inhibiteurs combinés de PI3K et de MEK entraîne une inversion de l’effet de résistance anti-EGFR, une réduction de la prolifération et l’induction de l’apoptose.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le Western Blot ou peuvent être effectuées pour étudier les voies de signalisation en aval. De plus, des systèmes de co-culture avec différents types de cellules peuvent également être utilisés pour analyser la diaphonie entre diverses cellules dans le microenvironnement tumoral. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du développement de médicaments pour explorer l’efficacité des médicaments in silico.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de prédire l’efficacité des médicaments dans des groupes de patients stratifiés, en simulant des changements de signalisation et en analysant les réponses du système qui en résultent dans différentes mutations et antécédents.