Name: Exosomal miRNA Analyse en non-small cell lung cancer (NSCLC) Plasma de patients Par qPCR: A Faisable Liquid Biopsie outil (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Apprenez à isoler des exosomes purs du plasma de patients atteints de NSCLC grâce à un traitement enzymatique double. Cette méthode permet d'analyser les microARN exosomaux comme biomarqueurs potentiels.

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Cette étude a également été financée par la subvention MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) 2014.

1. Exosome Isolation Note: L&#39;isolement des exosomes à partir d&#39;échantillons de plasma, a été réalisée avec un kit commercial, selon le protocole du fabricant et en ajoutant le traitement RNAse: (toutes ces étapes doivent être effectuées avec des équipements de protection individuelle et de l&#39;environnement et suivants procédure juridique spécifique pour la manipulation d&#39;échantillons biologiques ). <ol><li> Prendre 1 ml de plasma de chaque échantillon, stockés à -80 ° C, et le placer sur la glace. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 2000 × g pendant 20 min à température ambiante; ce passage est obligatoire afin d&#39;éliminer les cellules et les débris. </li><li> Transférer le surnageant contenant le plasma propre à un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger le nouveau tube à 10.000 x g pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Transférer le surnageant contenant le plasma propre à un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 100 ng / ml de RNAse au surnageant et on incube le tube à 37 ° C pendant 10 minafin de dégrader les ARN circulant. </li><li> Transférer tout le plasma traité à un nouveau tube de 2 ml et ajouter 0,5 volume de PBS 1x. </li><li> Vortex l&#39;échantillon afin de mélanger les solutions. </li><li> Ajouter 0,05 volumes de solution de proteinase K (joindre dans le kit) à l&#39;échantillon. </li><li> Tourbillon l&#39;échantillon et ensuite incuber à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Ajouter 0,2 volume de tampon de précipitation exosomes à l&#39;échantillon et mélanger la solution par inversion. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 2 ° C à 8 ° C pendant 30 min, puis centrifuger l&#39;échantillon à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer et jeter le surnageant. Le culot contient les exosomes isolés. </li><li> Ajouter un tampon sélectionné au culot exosomes afin de remettre en suspension les exosomes. La sélection de la mémoire tampon dépend de l&#39;analyse en aval prévu, dans ce cas: <ol><li> Ajouter 100 ul de PBS 1x afin d&#39;effectuer une analyse de TEM. </li><li> Ajouter 346,5 pi de lyse buf spécifiquefer pour l&#39;extraction de l&#39;ARN (de kit commercial) (ATTENTION: risques chimiques). </li><li> Ajouter 100 pi de tampon de lyse pour l&#39;extraction de la protéine (mM à pH 7,6 Tris-HCl 50 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - leupeptine / aprotinine 10 ug / ml) afin d&#39;effectuer une analyse Western Blot. (ATTENTION: risques chimiques). </li></ol></li><li> Stocker les exosomes remises en suspension à -20 ° C. </li></ol> 2. Exosome Caractérisation par Analyse Western Blot Remarque: Afin de caractériser les nanovésicules isolés, western blot avec des anticorps contre ALIX et TSG101 (Marqueurs exosomales bien connus) est recommandé. <ol><li> Après la remise en suspension du culot exosomes dans un tampon Lysis, placez-le sur la glace pendant 1 heure afin de dissoudre la membrane exosomal. </li><li> Centrifuger le lysat à 12000 g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube sans perturber le culot. </li><li> Quantifier le total conten de protéine exosomalt par le dosage de Bradford ou d&#39;autres méthodes et de la charge 50 pg de protéines par puits dans un tampon Tris / Glycine SDS - gel de Polyacrylamide à 8%. (ATTENTION: risques chimiques). </li><li> Séparer les protéines (et un marqueur approprié de poids moléculaire) dans électrophorèse 8% de gel SDS-PAGE avec un tampon en cours d&#39;exécution (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS à 0,1%) pendant 1 heure et 30 min à 120 V. (ATTENTION: risques chimiques ). </li><li> Transférer la protéine à une membrane de nitrocellulose par électrotransfert avec 4 ° C tampon de transfert à froid (Tris 25 mM, glycine 192 mM, 20% de méthanol) pendant 1 h à température constante de 50 V. (ATTENTION: risques chimiques). </li><li> Bloquer la membrane pendant 1 h dans une agitation lente avec 5% de lait sec non gras dans 1x TBS -Tween 0,1%. </li><li> Laver la membrane 4 fois pendant 5 min dans une agitation rapide avec 1x TBS - Tween 0,1%. </li><li> Ajouter les anticorps primaires contre ALIX et TSG101 (une par membrane) dans un tampon approprié (en conséquence à la fiche technique d&#39;anticorps du fabricant) et incuber la membrane O / N; Dans une agitation lente. </li><li> Laver la membrane 5 fois pendant 5 min dans une agitation rapide avec 1x TBS - Tween 0,1% afin d&#39;éliminer l&#39;anticorps excessive. </li><li> Ajouter l&#39;anticorps secondaire approprié dans un tampon approprié (en conséquence à la fiche technique d&#39;anticorps du fabricant) et incuber la membrane pendant 1 h dans une agitation lente. </li><li> Laver la membrane 5 fois pendant 5 min dans une agitation rapide avec 1x TBS - Tween 0,1% afin d&#39;éliminer l&#39;anticorps excessive. </li><li> Détecter la protéine choisie par l&#39; analyse de chimioluminescence 11. </li></ol> 3. Exosome Caractérisation par Analyse TEM Remarque: Afin de visualiser les exosomes isolés, TEM (Transmission Electron Microscopy) analyse a été réalisée. <ol><li> Lieu ~ 10 ug (préalablement quantifiés par le dosage de Bradford) de l&#39;échantillon d&#39;exosomes intactes remises en suspension dans du PBS 1X sur un parafilm et de mettre l&#39;échantillon tomber une grille de nickel revêtue de carbone Formvar pendant 1 heure. </li> &lt;li&gt; Laver la grille 3 fois en le positionnant sur trois 40 pl PBS 1x gouttes. </li><li> Laver la grille 5 fois en le positionnant sur cinq 30 ul de gouttes d&#39;eau ultrapure. </li><li> Fixer l&#39;échantillon en ajoutant une goutte de 2,5% de glutaraldéhyde (ATTENTION: risque chimique) pendant 10 min. </li><li> Laver la grille 3 fois en le positionnant sur trois 40 pl PBS 1x gouttes. </li><li> Ajouter une goutte de 2% d&#39;acétate d&#39;uranyle (ATTENTION: risques chimiques) et de mettre la grille au-dessus de celui-ci pendant 15 minutes afin de comparer l&#39;échantillon. </li><li> Incluez l&#39;échantillon sur une baisse de 0,13% de méthylcellulose (ATTENTION: risques chimiques) et 0,4% d&#39;acétate d&#39;uranyle et incuber la grille au-dessus de la goutte pendant 10 min. </li><li> Retirez délicatement l&#39;excès de liquide avec un papier absorbant et sécher la grille pendant 5 min avec la face enduite vers le haut. </li><li> Examiner la grille par un microscope électronique à transmission 12. </li></ol> 4. exosomal ARN Extraction et quantification Note: Nous avons décidé de perform l&#39;extraction totale à partir d&#39;échantillons exosomales en utilisant un kit commercial d&#39;ARN, selon le protocole du fabricant: (ATTENTION: risques chimiques, examiner le protocole et les directives du fabricant). <ol><li> Après la remise en suspension du culot exosomes dans 346,5 pi de tampon de lyse, ajouter 3,5 ul de β-mercaptoéthanol (ATTENTION: risques chimiques) et vortex vigoureusement; ce passage est obligatoire afin de détruire les membranes lipidiques. </li><li> Ajouter le lysat sur la colonne de lavage dans un tube collecteur et centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min. Après centrifugation, éliminer la colonne et le transfert du filtrat dans un nouveau tube de 1,5 ml sans RNase. </li><li> Ajouter 350 ul de 70% d&#39;éthanol (ATTENTION: risques chimiques) et mélanger par tourbillonnement pendant 5 secondes. </li><li> Chargez le lysat dans la colonne de résolution et centrifugeuse pendant 30 secondes à 8000 × g. Après centrifugation, jeter le accréditive et transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte. </li><li> Charger 350 pi de dessalage buffer et centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min. Après centrifugation, jeter le accréditive et retourner la colonne dans le même tube de collecte. </li><li> Ajouter 95 ul de désoxyribonucléase I mélange réactionnel (10 ul de désoxyribonucléase I reconstitué + 90 ßl de tampon DNase, pour chaque échantillon) sur la membrane de silice de la colonne et incuber à température ambiante pendant 15 min à température ambiante. (ATTENTION: risque chimique) </li><li> Ajouter 200 pi de tampon de lavage (ATTENTION: risques chimiques) à la colonne et centrifuger à 11000 × g pendant 1 min. Placer la colonne dans un nouveau tube de collecte. </li><li> Ajouter 600 pl de tampon de lavage à la colonne et centrifuger à 11 000 x g pendant 1 min. Après centrifugation, jeter accréditive et placer la colonne dans le même tube de collecte. </li><li> Ajouter 250 pi de tampon de lavage à la colonne et centrifuger à 11 000 x g pendant 2 min. Placer la colonne dans un tube sans RNAse 1,5 ml. </li><li> Eluer l&#39;ARN dans 40 pi d&#39;eau sans RNase et centrifuger à 11.000<html> 5; g pendant 1 minute, afin d&#39;avoir une forte concentration d&#39;ARN dans ce petit volume. </li><li> Immédiatement placer l&#39;ARN élue sur la glace pour empêcher la dégradation potentielle ou conserver à -80 ° C. </li><li> Quantifier le contenu de l&#39;ARN. Remarque: Ici, la quantification de l&#39;ARN a été réalisée en utilisant 1 pi de l&#39;échantillon à travers un spectrophotomètre. </li></ol> 5. Retrotrascription des miARN exosomal Remarque: En raison de la quantité limitée décrite de contenu miARN dans exosomes, il a été décidé d&#39;effectuer la transcription inverse de miARN sélectionnés par le biais d&#39;un kit commercial en utilisant un test individuel pour chaque miARN, selon le protocole du fabricant. Pour chaque échantillon, 8 miARN corrélées au statut NSCLC ont été sélectionnés (miR-30b; miR-30c; miR-103, miR-122, miR-195, miR-203, miR-221, miR-222 et miR-1228- 3p comme contrôle endogène). <ol><li> Préparer le mélange maître de transcription inverse (RT mix). Pour chaque réaction préparer 7 pi de mélange de RT, comme décrit danshttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx&quot;&gt;Table 1 (cliquez ici pour télécharger) (ATTENTION: risque chimique). Remarque: Dans cette expérience, 9 mix RT différents ont été préparés pour chaque échantillon. </li><li> Mélanger délicatement et stocker le mélange RT sur la glace. Ajouter 7 pl de RT mélange par tube de réaction. </li><li> Ajouter 5 pi d&#39;ARN de l&#39;échantillon (10 ug d&#39;ARN total) par tube de réaction et mélanger doucement. </li><li> Ajouter 3 pi des amorces de transcription inverse 5x (ATTENTION: risque chimique) de chaque essai fixé dans le tube de réaction correspondante. </li><li> Mélanger lentement, fermer le tube et incuber sur la glace pendant 5 min. </li><li> Chargez le tube de réaction dans le cycleur thermique et commencer la réaction de transcription inverse en utilisant les valeurs des paramètres suivants (HOLD à 16 ° C pendant 30 min; TENIR à 42 ° C pendant 30 min; TENIR à 85 ° C pendant 5 min; TENIR ∞ 4 ° C). </li></ol> 6. Analyse PCR en temps réel de exosomal miARN Note: Cette analyse a étéréalisée en utilisant un kit commercial pour PCR en temps réel (qPCR), avec trois répétitions biologiques et techniques par échantillon. <ol><li> Pour chaque réaction, préparer 17,67 pi de mélange PCR en temps réel (10 pl de PCR Master Mix + 7,67 ul d&#39;eau exempte de nucléase), mélanger et mettre sur la glace. (ATTENTION: risque chimique) </li><li> Ajouter 1 pl, pour chaque tube PCR, des amorces 20x qPCR (ATTENTION: risque chimique). </li><li> Placez 18.67 ul du mélange qPCR dans chaque puits de plaque. </li><li> Ajouter 1,33 ul du produit de transcription inverse dans le correspondant bien-plaque. </li><li> Fermez la plaque et la faire tourner (300 gx 5 sec). </li><li> Insérez la plaque dans un système PCR en temps réel et commencer la course en utilisant les conditions de PCR suivantes: HOLD à 95 ° C pendant 10 min; 40 cycles de 15 sec à 95 ° C et 60 sec à 60 ° C. Procédé et normaliser les données conformément à la formule 2 - 13 ΔΔct. </li></ol>

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<li>Garofalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+TRAIL+resistance+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer.</a> Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).</li>
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<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Derived+from+Human+Umbilical+Cord+Mesenchymal+Stem+Cells+Relieve+Acute+Myocardial+Ischemic+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>Yoko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+MDR%271and+induction+of+doxorubicin+resistance+by+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+%28FK228%29+and+ATRA+in+acute+promyelocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells.</a> Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).</li>
</ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Avec ce protocole combiné, il était possible d&#39;effectuer une analyse exosomal miRNA à partir du plasma de patients atteints de CPNPC. Ces données peuvent refléter l&#39;état de la maladie, mais cela doit être confirmé par une étude plus approfondie. Le protocole utilisé dans cet article était basé sur un kit commercial pour l&#39;isolement des exosomes. La raison en est que les autres procédés d&#39;isolement connus (par ex., Une ultracentrifugation à gradient de densité) nécess...

Le faible taux de survie dans le CPNPC (cancer non à petites cellules du poumon) des patients est principalement due à l&#39;efficacité limitée des traitements dans la maladie avancée et la détection précoce pauvres 1. Des mutations activatrices du gène EGFR, qui ont été découverts dans une sous - population de patients atteints de CPNPC, sont connus pour conférer une sensibilité à la tyrosine kinase (ITK inhibiteurs). Malheureusement, la majorité des patients atteints de CPNPC EGFR muté développent une résistance de TKI 2. Surtout dans ce contexte, un diagnostic correct est obligatoire. D&#39;une manière générale, en raison de la localisation de tumeurs, l&#39;obtention d&#39;un tissu de biopsie dans NSCLC est pas toujours possible. Par conséquent, plusieurs études sont en cours qui utilisent des méthodes non invasives pour obtenir ces données biologiques. Les exosomes sont décrits comme composants de biopsie liquides qui pourraient être étudiés afin d&#39;obtenir des valeurs diagnostiques et pronostiques avec des techniques non-invasives 3. Les exosomes sont des nanovésicules (40-100 nm de diamètre) de l&#39;eorigine ndocytic qui sont libérés par les différents types de cellules à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques 4. Ils peuvent transporter des protéines, des lipides, des ARNm et microARN. En outre, plusieurs études suggèrent un rôle pleiotrope des exosomes tumorales dérivées qui peuvent influencer la croissance et la survie des cellules tumorales, l&#39; angiogenèse, stroma et la matrice extracellulaire et le remodelage 5 résistance aux médicaments. Les microARN (miARN) sont courts ARN non codantes qui sont impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle, liant l&#39;extrémité 3 &#39;UTR des ARNm cibles et conduisant l&#39;ARNm à la dégradation ou à une non-traduction 6. Le tri sélectif des miARN dans exosomes a été décrite. Dans ce contexte, il a récemment été démontré in vitro et in vivo, un emballage sélectif de miR-21 (un miARN bien connu des effets oncogenes) dans les exosomes libérés par les lignées cellulaires de la leucémie myéloïde chronique après traitement curcumine 7. leprofil exosomal miARN est similaire au profil miRNA de la tumeur primitive et cette caractéristique peut être exploitée dans le diagnostic précoce et le pronostic 3. Plus précisément, il est possible de caractériser, par PCR en temps réel miARN sélectionnés en corrélation avec le profil moléculaire de la maladie, par exemple., Les mutations de l&#39; EGFR , entre autres 8. Ici, l&#39;analyse d&#39;un panel sélectionné de NSCLC corrélé miARN 8-9 est décrite qui ont été isolés à partir des exosomes libérés dans le sang des patients atteints de CPNPC. Après avoir obtenu le rapport de consentement informer des patients, le plasma de 12 patients atteints de CPNPC et 6 témoins en bonne santé, ont été analysés. L&#39;isolement exosomes a été réalisée avec le kit commercial en suivant le protocole du fabricant. Avant l&#39;isolement exosomes, des échantillons de plasma ont été traités avec la RNase, afin de dégrader les contaminants circulant miARN. Nous avons décidé d&#39;effectuer cette analyse avec un kit commercial en raison de la normalisation limitée d&#39;autres techniques (par ex., l&#39; ultracentrifugation) , ce qui est particulièrement important lorsque l&#39;on travaille avec des échantillons cliniques. Ce kit comprend un traitement à la protéinase K, ce qui dégrade la RNAse, et diminue ainsi le risque de se dégrader miARN exosomales après exosomes lyse. l&#39;analyse de micro-ARN a été réalisée par une analyse sensible et spécifique PCR en temps réel; miR-1228-3p a été utilisé comme contrôle endogène et les données ont été normalisés selon la formule 2 - ΔΔct. Les valeurs de contrôle sont utilisés comme référence et les résultats sont présentés sur une échelle logarithmique.

<table><tbody><tr><td>Kit d’isolement d’exosomes totaux (à partir du plasma)</td><td> Invitrogen</td><td>4484450</td><td>Use Traitement à la protéinase K</td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps ALIX (3A9)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps TSG-101 (C-2)</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris HRP 1 ml&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra mini kit 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse</td><td>Transcription Kit Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA</td><td>test Life Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30b TaqMan MicroRNA test Life</td><td>Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30c TaqMan Test de microARN</td><td>Life Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-122 Essai de microARN TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-195 Test de microARN TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-203 Test de microARN TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-103 Essai de microARN TaqMan</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>000439</tr><tr><td>has-miR-221 TaqMan MicroRNA</td><td>test Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-222 TaqMan MicroRNA</td><td>test Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table>

exosomal mirna analyse en non-small cell lung cancer (nsclc) plasma de patients par qpcr: a faisable liquid biopsie outil

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

La découverte d’altérations dans les gènes EGFR et ALK, entre autres, dans le CPNPC a conduit au développement d’une thérapie médicamenteuse ciblée utilisant des inhibiteurs sélectifs de la tyrosine kinase (ITK). Pour optimiser l’utilisation de ces ITK, la découverte de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et la progression de la maladie est obligatoire. Ces exosomes isolés dans le plasma peuvent être utilisés comme moyen non invasif et reproductible pour la détection et le suivi de ces biomarqueurs. Un ml de plasma provenant de 12 patients atteints de CPNPC, avec différentes mutations et traitements (et 6 donneurs sains comme témoins), a été utilisé comme sources d’exosomes. Après le traitement à l’ARNase, afin de dégrader les miARN circulants, les exosomes ont été isolés à l’aide d’un kit commercial et remis en suspension dans des tampons spécifiques pour une analyse plus approfondie. Les exosomes ont été caractérisés par western blot pour ALIX et TSG101 et par analyse par microscopie électronique à transmission (MET), les techniques standard pour obtenir des données biochimiques et dimensionnelles de ces nanovésicules. L’extraction totale de l’ARN a été réalisée à l’aide d’un kit commercial à haut rendement. En raison de la teneur limitée en miARN des exosomes, nous avons décidé d’effectuer une PCR de rétrotranscription en utilisant un test individuel pour chaque miARN sélectionné. Un panel de miARN (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), tous corrélés à la maladie NSCLC, a été analysé en tirant parti de la sensibilité et de la spécificité remarquables de l’analyse PCR en temps réel ; MIR-1228-3P a été utilisé comme contrôle endogène et les données ont été traitées selon la formule 2-ΔΔct 13. Les valeurs de contrôle ont été utilisées comme référence et les résultats sont présentés sur une échelle logarithmique.

Un total de 12 plasma de patients atteints de CPNPC et 6 témoins en bonne santé ont été traités avec le kit commercial pour l&#39;isolement des exosomes du plasma. Chaque échantillon a été traité par une analyse Western Blot afin d&#39;évaluer les marqueurs exosomales ALIX (96 kDa) et TSG101 (43 kDa). Un exemple de ces résultats est présentée pour 3 échantillons de la figure 1, ce qui indique que l&#39; isolement d&#39; exosomes à partir d&#39; échantillons de plasma est...

Ce protocole décrit la faisabilité d’effectuer un profilage des miARN dans les exosomes, libérés dans le plasma des patients atteints de CPNPC, par le biais d’un kit commercial d’isolement d’exosomes avec des traitements à base de protéinase K et d’ARNase, afin d’éviter la contamination par les miARN circulants et d’évaluer leurs caractéristiques de biomarqueurs dans le CPNPC.

Exosomal miRNA Analyse en non-small cell lung cancer (NSCLC) Plasma de patients Par qPCR: A Faisable Liquid Biopsie outil

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les exosomes présents dans le plasma de patients atteints de CBNPC, exempts de sources de micro-ARN non exosomales telles que les micro-ARN circulants libres, en utilisant un traitement enzymatique double avant l'isolement des exosomes. Cette méthode peut faciliter l'analyse des biopsies lipidiques de micro-ARN au niveau du compartiment exosomal, ce qui contribuera à clarifier leur utilisation en tant que biomarqueurs. Le principal avantage de cette procédure réside dans le prétraitement enzymatique, qui élimine les sources non exosomales de micro-ARN susceptibles d'interférer avec l'analyse.Pour commencer, décongelez un échantillon de plasma d'un mL sur de la glace. Une fois décongelé, retournez le tube plusieurs fois afin de désagréger les éventuels cryoprécipités formés. Ensuite, centrifugez le plasma à 2 000 G pendant 20 minutes à température ambiante afin d'éliminer les cellules et les débris.Recueillir le surnageant et centrifuger le plasma à nouveau, maintenant à 10 000&nbsp;g pendant 20&nbsp;minutes. Récupérer à nouveau le surnageant plasmatique, puis ajouter 10&nbsp;microlitres de RNase. Incuber le plasma à 37&nbsp;degrés Celsius pendant 10&nbsp;minutes dans un bloc chauffant thermorégulé.Nous avons ajouté l'étape de traitement par RNase au protocole clé standard afin de dégrader les micro-ARN libres. Ensuite, l'étape de traitement par protéinase, incluse dans le protocole clé, a été utilisée afin de dégrader les essais d'ARN et préserver l'intégrité des micro-ARN exosomaux. Transférez ensuite le plasma dans un nouveau tube, ajoutez un demi-volume de PBS 1x et vortexez.Ensuite, ajoutez 0,05 volume de solution de protéinase K, vortexez à nouveau l'échantillon et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajoutez maintenant 0,2 volume de tampon de précipitation des exosomes et mélangez l'échantillon par retournement. Incubez ensuite l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Après l'incubation à froid, centrifuger l'échantillon à 10 000 G pendant cinq minutes à température ambiante. Prélever un aliquot de 20 à 50 microlitres du surnageant et le conserver à des fins de contrôle. Puis aspirer et jeter le surnageant restant.Resuspendre le culot d'exosomes dans le tampon choisi, à un volume dépendant de l'analyse en aval. Pour l'analyse de l'ARN, ajouter le tampon de lyse spécifique destiné à l'extraction de l'ARN. Avant de commencer, nettoyer la zone de travail et les objets associés avec les réactifs appropriés afin d'assurer un environnement exempt de RNases.Préparez votre mélange maître de transcription inverse selon les instructions du fournisseur. Dans cet exemple, deux échantillons seront traités. Pour chaque échantillon, neuf aliquotes de sept microlitres du mélange maître sont préparées, une pour chaque microARN sélectionné.Conservez les tubes à réaction sur de la glace. Ajoutez maintenant cinq microlitres de solution d'ARN exosomal dans chaque tube à réaction, pour une concentration totale en ARN de 10 microgrammes. Mélangez les échantillons par pipetage doux.Ensuite, ajouter trois microlitres du primer d'hybridation inverse approprié à chaque tube de réaction et mélanger délicatement les échantillons à l’aide d’une pipette. Laisser les échantillons incuber sur de la glace pendant cinq minutes avant de poursuivre. À présent, les tubes de réaction peuvent être placés dans le thermocycleur.Effectuez les cycles de réaction conformément aux exigences du fournisseur. Dans cette procédure, tous les ARN micro doivent être testés en triple pour chaque patient. Cela inclut l'exécution de triplés pour les contrôles négatifs.Veillez à inclure au moins un micro ARN de référence pour normaliser correctement les données, car aucun consensus n'existe pour les micro ARN circulants exprimés de manière stable. Les micro ARN candidats obtenus précédemment peuvent être utilisés comme référence. Commencez par préparer le mélange de PCR.Préparez un mélange pour chaque microARN qui sera évalué. Conservez les réactifs et les amorces sur de la glace, à l’abri de la lumière, jusqu’à leur utilisation. Pour chaque puits de PCR, prévoyez de charger 10 microlitres de mélange maître de PCR.Avec 7,67 mL d'eau sans nucléase et un microlitre d'amorce de PCR, ajustez ces volumes au nombre de puits à remplir sur la plaque, en ajoutant un peu d'excès. Ajoutez maintenant 18,67 microlitres des mélanges préparés dans les puits correspondants de la plaque. Puis ajoutez 1,33 microlitre du produit approprié de la réaction de transcription inverse dans le puit de plaque approprié, en complétant chaque puit à 20 microlitres.Pour les puits de contrôle négatif, ajoutez 1,33 microlitre d'eau. Fermez maintenant la plaque et centrifugez-la dans un centrifugeuse pour plaque pendant quelques secondes à 300 G. À l'aide du logiciel de PCR en temps réel, attribuez les marqueurs dans le modèle, attribuez les gènes cibles, définissez les volumes de réaction et configurez les puits de l'expérience.Chargez maintenant la plaque dans un thermocycleur et définissez les paramètres de réaction conformément aux spécifications du fournisseur. Une fois l'analyse terminée, exportez les données, y compris les valeurs CT, vers un tableur pour analyse. Douze échantillons de plasma provenant de patients atteints de CBNPC et six témoins sains ont été traités comme décrit.Les marqueurs des exosomes ont été analysés par immunotransfert. Les marqueurs associés aux exosomes, ALIX et TSG101, étaient présents dans les échantillons. Pour caractériser biophysiquement les échantillons, une analyse par microscopie électronique en transmission a été réalisée.Des vésicules sphériques, mesurant entre 40 et 100 nanomètres, ont été observées. Huit microARN, décrits comme étant régulés de façon anormale dans le CBNPC par divers modèles, ont été analysés par RT-PCR. Le contrôle interne mir-1228 a été validé comme un contrôle endogène stable dans un autre ensemble d'échantillons.Il a été constaté que les microARN analysés sont régulés de manière anormale dans les échantillons cliniques provenant de patients atteints de cancer du poumon par rapport aux témoins. Ce protocole permet d'analyser les microARN liés aux exosomes à partir d'échantillons de plasma, en évitant les autres compartiments qui pourraient interférer avec votre analyse. Nous vous recommandons d'utiliser l'aliquot de surnageant conservé comme témoin afin de surveiller l'efficacité du traitement enzymatique.Les biopsies liquides sont très importantes en cancérologie, en particulier dans le cancer du poumon, car plusieurs de leurs composants, comme les CTC ou l'ADN libre, sont utilisés non seulement aujourd'hui, mais également pour le suivi des patients. Les exosomes constituent une nouvelle composante de ces biopsies liquides, dotée d'activités pléiotropes importantes. L'une d'entre elles, par exemple, est la résistance directe.Je vous invite à regarder cette vidéo afin de sélectionner et caractériser vos exosomes dans votre propre laboratoire. Merci d'avoir regardé.

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