Name: assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez la microdissection assistée par laser pour isoler des cellules végétales spécifiques et obtenir de l'ARN de haute qualité. Cette méthode permet d'étudier la reproduction sexuée et apomictique chez Boechera.

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Nous remercions Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) pour avoir fourni des graines de Boechera divaricarpa et Sharon Kessler (Université de l’Oklahoma) pour la lecture critique et la relecture. Les travaux sur l’analyse du transcriptome spécifique au type cellulaire pour étudier le développement des gamétophytes et l’apomixie dans le laboratoire de l’UG sont soutenus par l’Université de Zurich, par une bourse de la « Deutsche Forschungsgemeinschaft » et le projet Marie Curie IDEAGENA to AS, par des subventions du « Staatssekretariat für Bildung und Forschung » dans le cadre de l’action COST FA0903 (à UG et AS) et par le Fonds national suisse (à UG).

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<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
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<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle%2C+transcriptional%2C+hormonal+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+GENET%22%5BJournal%5D)">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476(2014).</li>
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<li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li>
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<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li>
<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
<li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li>
<li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li>
<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole est adapté à différents types de cellules et de tissus LAM combinée avec transcriptome analyse par microarrays ou ARN-Seq est un outil précieux pour mieux comprendre les modèles spécifiques de l&#39; activité des gènes régulant les processus de développement ou physiologiques 7-11,13,14. Cependant, la pertinence de cette méthode pour tout type de cellule donné dépend de façon critique sur les questions structurelles. La cellule doit ê...

Dans les études de transcription effectuées au niveau des tissus, les transcriptomes de types de cellules hautement spécialisées, mais rares sont souvent masqués par les cellules environnantes plus abondantes. Un exemple de ces types de cellules hautement spécialisées sont les cellules de la lignée de reproduction féminin (germinale) dans les plantes. La lignée germinale femelle est spécifié dans les ovules en développement, les précurseurs de graines à l&#39; intérieur du gynécée du 1,2 fleur. La cellule mégaspore mère (MMC) est la première cellule de la lignée germinale femelle. Il subit la méiose pour former une tétrade de mégaspores réduits. En règle générale, une seule de ces mégaspores survit et se divise en mitose sans cytokinèse, soit dans un syncytium. Ces mitoses sont suivis par cellularisation pour former le gamétophyte mature, qui se compose généralement de quatre types de cellules: trois antipodes, deux cellules synergide, l&#39;œuf et la cellule centrale. Les cellules d&#39;oeufs et centrales sont les gamètes femelles qui se fécondés par deux spermatozoïdes pendant doufertilisation ble pour donner naissance à l&#39;embryon et de l&#39; albumen du 1,2 de graines de développement. Dans le sexuel système modèle Arabidopsis thaliana, seulement ~ 50 graines se développent par fleur tandis qu&#39;environ 50 - 80 graines se développent par fleur dans le genre étroitement apparenté Boechera. Ainsi, la lignée germinale femelle se compose de seulement quelques types de cellules hautement spécialisées, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les processus de développement, tels que la spécification et la différenciation cellulaire. En outre, un aperçu des processus de régulation des gènes régissant la reproduction des plantes peuvent être de valeur appliquée. Chez les plantes, à la fois la reproduction sexuée et asexuée par graines (apomixie) peut se produire. Bien que la reproduction sexuelle génère la diversité génétique dans une population, apomixie conduit à la formation de la progéniture clonale qui est génétiquement identique à la plante mère. Par conséquent, l&#39;apomixie a un grand potentiel pour des applications dans l&#39;agriculture et la production de semences, comme les génotypes maternels même complexes peuventêtre maintenu inchangé pendant plusieurs générations 3,4,5. Parce que apomixie ne se produit pas naturellement dans toutes les principales espèces cultivées, l&#39;ingénierie de l&#39; apomixie dans les cultures est d&#39; une grande 3,4,5 d&#39;intérêt. Cependant, cet objectif à long terme est difficile à réaliser parce que la base génétique et moléculaire sous - jacente de l&#39; apomixie on ne comprend pas suffisamment détaillée 6. Pour obtenir un aperçu de la base de la transcription qui régissent la reproduction apomictique, une cellule de type spécifique de transcription profilage à l&#39; aide microdissection assistée par laser (LAM) et le séquençage de prochaine génération (NGS) représente une approche très puissante 7,8. LAM a d&#39;abord été mis en place pour les animaux et la recherche biomédicale. Au cours des dernières années LAM a également été appliquée à la biologie végétale 6,9,10. Contrairement à d&#39; autres méthodes permettant de profilage de types de cellules et de tissus, LAM ne nécessite pas la génération des lignes de marquage 6,9,10. Par conséquent, il peut être applimenti à une cellule ou d&#39;un tissu de type sans connaissance moléculaire préalable. Un autre avantage de LAM est qu&#39;il peut être appliqué à tout type de cellule aussi longtemps que la cellule peut être reconnu dans les sections sèches en fonction de la position et / ou les caractéristiques structurelles. LAM présente l&#39;avantage supplémentaire que les tissus fixes sont utilisés, ce qui empêche toute modification du profil de transcription lors du traitement. Le tissu d&#39;intérêt, par exemple, le tissu floral, est fixé dans un fixateur non réticulant avant l&#39;enrobage dans la paraffine. Incorporation dans la cire de paraffine peut être fait manuellement, en suivant les protocoles établis 9,11. Cependant, l&#39;utilisation d&#39;un processeur de tissu automatisé pour la déshydratation et l&#39;infiltration avec la cire se traduit généralement par une reproductibilité élevée en termes de conservation de la qualité de l&#39;ARN et la morphologie du tissu. La stratégie alternative d&#39;incorporation des tissus en résine a également été utilisé avec succès pour des analyses spécifiques de type cellulaire par LAM 8. Cependant, l&#39;utilisation d&#39;un automprocesseur de tissus ATED pour l&#39;enrobage dans de la cire est très efficace du temps, car de nombreux échantillons peuvent être traités à la fois exigeant un minimum de temps sur les mains. Bien qu&#39;elle soit généralement pas de perte significative de qualité de l&#39;ARN a lieu lors de la fixation et l&#39;intégration, la préparation de sections minces avec le microtome et, en particulier, leur montage sur les frameslides utilisés pour LAM restent une étape essentielle pour la préservation de la qualité de l&#39;ARN. Cela a déjà été noté et l&#39;utilisation d&#39;un système de transfert de bande a été décrite pour aboutir à une meilleure qualité de l&#39; ARN à cette étape 12. Toutefois, cela ajoute une étape de temps supplémentaire lors de la préparation des diapositives et nécessite également un équipement spécial. Le protocole optimisé décrit ci - dessous produit reproductible ARN qui est d&#39; une qualité suffisante pour le profilage transcriptionnel avec GeneChips et Next Generation Sequencing (NGS) approches 7,11,13,14. En outre, avec le microscope à microdissection laser utilisé, avec une pureté élevée des types de cellules isolées est routinely produit 7,11,13,14. Le genre Boechera est un excellent modèle pour étudier les principales étapes de la reproduction apomictique. Dans Boechera, une variété de différentes accessions sexuelles et apomictiques ont été identifiés et peut être utilisé pour des analyses comparatives 15,16,17. Dans une comparaison des transcriptomes type de cellules spécifiques de cellules de la lignée germinale femelle d&#39;Arabidopsis sexuelle et apomictique Boechera, nous avons identifié les gènes et les voies qui sont exprimés différemment, identifiant ainsi les nouveaux aspects des processus réglementaires régissant apomixie 7. En outre, cette étude a vérifié l&#39;aptitude des cellules LAM pour la transcription spécifique du type d&#39;analyses de types de cellules petites et rares. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour l&#39;analyse des différents types de cellules dans une variété d&#39;espèces végétales, mais l&#39;espèce et des modifications spécifiques de tissus au protocole peut être nécessaire dans certains cas.

<table><tbody><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>1,009,861,000</td><td>absolu EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml tubes à centrifuger faucon</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100 % biologie moléculaire grade</td></tr><tr><td>Ambion Nucléase technologies</td><td>de vie aquatique</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>processeur de tissus&nbsp ;</td></tr>le <tr><td>carton</td><td></td><td></td> noir <td>peut être acheté dans des papeteries spéciales</td></tr><tr><td>sans ADN ni RNAse Frame Slides</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 & micro ; m Membrane PET ; peut également être acheté auprès de Leica</td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>exsiccateur</td> de lampe <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>à éthanol</td></tr> Sigma-Aldrich Z354074-1EA Nalgene Vaccuum Dessicator ou équipement similaire <tr><td>pointes à filtre 10&nbsp ; et micro ; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>peut être remplacé par des pointes similaires</td></tr><tr><td>pointes filtrantes 1 000&nbsp ; et micro ; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>peut être remplacé par des pointes similaires</td></tr><tr><td>pointes filtrantes 20&nbsp ; et micro ; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>peut être remplacé par des pointes similaires</td></tr><tr><td>pointes filtrantes 200&nbsp ; et micro ; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>peut être remplacé par des pointes similaires</td></tr><tr><td>pince de précision</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>porte-lames en verre</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml ; rbek&auml ; sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>goutre de coloration du verre</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml ; rbekasten</td></tr><tr><td>Module d’enrobage de paraffine chauffé Leica</td><td>Leica</td><td>Leica Leica EG 1150 H</td><td>station de blocage, des dispositifs similaires conviennent</td></tr><tr><td>Table de chauffage et de séchage</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>d’autres modèles et/ou fournisseurs sont appropriés</td></tr><tr><td>seau à</td><td>glace VWR seau à glace avec couvercle&nbsp ;</td><td>10146-184</td><td>seaux similaires également adaptés</td></tr><tr><td>table lumineuse</td><td>UVP An Analytique Jena Company</td><td>TW-26&nbsp ;</td><td>Transluminateur de lumière blanche</td></tr><tr><td>lame de microscope</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td> lames <td>de</td></tr><tr><td>microtome Lame de microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 jetable</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiadhésif, sans RNAse Tubes de microfuge, 2 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>pour l’histologie</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation</td><td>Kit life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure Kit d’isolation de l’ARN</td></tr> en <tr><td>plastique Plateaux d’équilibrage en plastique</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>Boîte en plastique</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>couvercle en plastique pour plaque</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chauffante aiguille de préparation</td> maison <td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microfuge sans RNAse</td><td>technologies de vie AM12400</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td><td>life technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif semi-automatisé&nbsp ;</td>Les appareils similaires <td>Leica</td><td>RM2245</td><td>conviennent également</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo Screen Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>des cassettes similaires d’autres fournisseurs conviennent</td></tr><tr><td>Tubes avec couvercle adhésif, sans diffuseur 500 & micro ; l&nbsp ;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99 %, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>cassettes d’enrobage de processus</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I sans couvercle</td></tr><tr><td>Four universel</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>d’autres modèles et/ou fournisseurs conviennent</td></tr></tbody></table>

assistée par laser microdissection (lam) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

La compréhension des processus de développement au niveau moléculaire nécessite des connaissances sur la régulation transcriptionnelle, et donc le transcriptome, au niveau des types de cellules individuelles. Bien que les méthodes décrites ici soient généralement applicables à un large éventail d’espèces et de types de cellules, nos recherches se concentrent sur la reproduction des plantes. La culture des plantes et la production de semences sont d’une importance cruciale pour la nutrition humaine et animale. Une compréhension détaillée des réseaux régulateurs qui régissent la formation de la lignée reproductive (germinale) et, en fin de compte, des graines est une condition préalable à la manipulation ciblée de la reproduction des plantes. En particulier, l’ingénierie de l’apomixie (reproduction asexuée par graines) dans les plantes cultivées promet de grandes améliorations, car elle conduit à la formation de graines clonales génétiquement identiques à la plante mère. Par conséquent, les types de cellules de la lignée germinale féminine sont d’une importance majeure pour la compréhension et l’ingénierie de l’apomixie. Cependant, comme les cellules correspondantes sont profondément ancrées dans les tissus floraux, elles sont très difficiles d’accès pour des analyses expérimentales, y compris la transcriptomique spécifique au type de cellule. Pour surmonter cette limitation, des sections de cellules individuelles peuvent être isolées par microdissection assistée par laser (LAM). Bien que la LAM en combinaison avec le profilage transcriptionnel permette d’identifier des gènes et des voies actifs dans tout type de cellule avec une spécificité élevée, l’établissement d’un protocole approprié peut être difficile. Plus précisément, la qualité de l’ARN obtenu après la LAM peut être compromise, en particulier lorsque de petites cellules uniques sont ciblées. Pour contourner ce problème, nous avons établi un flux de travail pour LAM qui se traduit de manière reproductible par une qualité d’ARN élevée qui convient bien à la transcriptomique, comme illustré ici par l’isolement de cellules de la lignée germinale féminine chez Boechera apomictique. Dans ce protocole, les procédures sont décrites pour la préparation des tissus et la LAM, également en ce qui concerne l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité.

Préparation d&#39; échantillons et LAM sont effectuées dans les étapes consécutives Un certain nombre d&#39;étapes successives sont nécessaires pour préparer l&#39; ARN pour une analyse de la transcription à partir de types de cellules sélectionnées par le LAM (figure 1). Ceci commence par la récolte des fleurs et une fixation immédiate pour assurer que la pop...

Nous présentons ici un protocole de microdissection assistée par laser de types spécifiques de cellules végétales pour le profilage transcriptionnel. Bien que le protocole convienne à différentes espèces et types de cellules, l’accent est mis sur les cellules hautement inaccessibles de la lignée germinale féminine importantes pour la reproduction sexuée et apomictique dans le genre de crucifères Boechera.

assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

L'objectif général de ce protocole pour la LAM est d'isoler des cellules végétales spécifiques afin d'obtenir des ARN de haute intégrité destinés à une analyse transcriptionnelle. L'accent est mis sur des cellules inaccessibles, telles que les cellules œufs, chez des espèces de boechera sexuées et apomictiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique du développement végétal, notamment la base transcriptionnelle des modes de reproduction sexuée et asexuée des plantes par voie semencière.Le principal avantage de cette technique est qu'il est possible de réaliser certains types spécifiques de styles. Elle permet de surmonter l'effet de masquage des transcriptions de types cellulaires rares lors de l'analyse de tissus d'athérogenèse. Pour commencer cette procédure, utilisez la station de blocage pour remplir un plateau d'équilibrage en plastique, préalablement réchauffé et propre, avec de la paraffine fondue à 56 degrés Celsius.Soulevez le couvercle du bain de paraffine et prenez une cassette à la fois. Transférez un échantillon dans la paraffine liquide à 56 degrés Celsius située dans un plateau d'équilibrage. Procédez rapidement afin d'éviter tout durcissement de la paraffine autour de l'échantillon lors de la manipulation de la cassette.Ensuite, positionner l'échantillon selon le plan expérimental à l'aide d'une aiguille de préparation. Répéter la procédure jusqu'à ce que tous les échantillons soient transférés. Pour préparer des coupes minces destinées à la MEL, sur une table éclairée, retirer la paraffine contenant l'échantillon du plateau en plastique.Dissez un bloc de cire contenant l'échantillon, comme un bourgeon ou une fleur, à l'aide d'un scalpel sans RNase. Ensuite, faites fondre une petite goutte de cire de paraffine sur l'extrémité d'une spatule. Utilisez ensuite la cire chaude pour fixer le bloc contenant l'échantillon sur le support.Retirez la cire excédentaire entourant l'échantillon à l'aide d'un rasoir, et assurez-vous que le bloc présente une surface carrée aux bords parallèles. Ensuite, réglez le plateau chauffant à 42 degrés Celsius. Montez l'échantillon en toute sécurité sur le microtome.Préparer des sections de sept micromètres d'épaisseur pour les cellules du gamétophyte mature de boechera. Ensuite, transférer les rubans de paraffine de 10 à 15 centimètres de long dans une boîte en plastique munie d’un carton noir au fond, avant de les positionner sur les lames pour MAC. Pour préparer les lames pour MAC, placer de cinq à dix lames montées sur cadre métallique sur la plaque chauffante, les surfaces planes orientées vers le haut.Placer à la pipette un à deux millilitres d'eau sans RNase sur la partie plastique des lames. À l'aide d'une lame de rasoir, couper les rubans de paraffine en petits morceaux d'environ quatre à cinq centimètres. Assez longs pour recouvrir entièrement les fenêtres en plastique des lames.Ensuite, utilisez une paire de pinces et une aiguille de préparation pour disposer les bandes de paraffine parallèlement les unes aux autres sur la fenêtre en plastique des lames. Soulevez délicatement les lames par une extrémité pour éliminer l'eau, puis remettez-les en place. Recouvrez le plateau chauffant d'un couvercle en plastique sans toucher les lames, et veillez à ce que le couvercle en plastique permette un échange d'air.Séchez les lames à 42 degrés Celsius pendant la nuit. Sous une hotte chimique, déparaffinez les lames dans du xylol deux fois pendant 10 minutes à chaque fois. Veillez à immerger uniquement la partie en plastique des lames et à garder l'extrémité la plus large du cadre métallique de chaque lame sèche pour faciliter son retrait.Laisser sécher les lames pendant 10 minutes dans la hotte chimique avant la microdissection au laser (LAM). Dans cette procédure, allumer l'ordinateur et le microscope pour la LAM. Ensuite, démarrer le programme qui commande le microscope et le laser.Activez la boîte de commande du laser et allumez le laser en appuyant sur le bouton correspondant de la boîte de commande. Ensuite, placez un capuchon dans le support de capuchon. Placez la lame LAM sur une lame en verre destinée à la microscopie et assurez-vous que la surface plane de la lame, sur laquelle les tissus sont fixés, soit orientée vers la lame en verre.Ensuite, placer la lame dans l'appareil avec la lame de verre en dessous. Enfin, positionner le support de capuchon avec le capuchon dans l'appareil. Sélectionner l'objectif 4x.Dans le programme, déplacez le capot en position haute. Ensuite, effectuez une numérisation de la lame. Parcourez la lame et identifiez les structures d'intérêt.Repérez et enregistrez leurs positions sur la lame afin de pouvoir revenir à l'emplacement exact pour l'étape de découpe. Ensuite, sélectionnez un objectif approprié. Vérifiez la position du laser en appuyant une fois sur le bouton de tir du laser.Idéalement, dans une partie de la membrane ne contenant aucun tissu. Avec le capuchon en position vers le bas, utilisez l'outil stylet manuel pour délimiter les contours du type cellulaire ou du tissu d'intérêt. Par exemple, la cellule œuf.Dissez-le au laser en appuyant sur Couper. Afin d'isoler des cellules individuelles, il est essentiel de les identifier clairement dans les bonnes sections. De plus, les cellules doivent avoir un diamètre d'au moins huit micromètres pour rendre possible une analyse transcriptionnelle spécifique au type cellulaire.Veuillez noter que la sectionnement doit être répété si la bordure entourant la cellule n’a pas été complètement disséquée, ce qui peut généralement être observé à l’écran. Dans ce cas, il est recommandé de configurer le logiciel pour exécuter automatiquement deux répétitions du sectionnement par défaut. Ensuite, soulevez le capot et déplacez-vous vers la prochaine position d’enregistrement présentant une structure d’intérêt, puis disséquez la section suivante de cellule jusqu’à ce que toutes les cellules d’intérêt d’une lame soient collectées.Veillez à ce que le bouchon soit positionné de manière à ce que la nouvelle section adhère à un emplacement vide sur le bouchon. Une fois que les types cellulaires d'intérêt de toutes les lames ont été isolés, retirez la lame de l'appareil. Placez le support de bouchon en position basse et inspectez visuellement la surface du bouchon.Et utilisez l'objectif 4x pour exclure les contaminations non spécifiques de l'échantillon. Ensuite, fermez le bouchon. Et congélez les coupes sèches à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure.Voici le schéma du gamétophyte femelle mature. Il s'agit de coupes minces d'ovules contenant des gamétophytes femelles chez Boechera divaricarpa, dans lesquelles les cellules œufs sont clairement identifiables en raison de la morphologie caractéristique du gamétophyte femelle. Une qualité d'ARN similaire a été obtenue lors de l'analyse des sections de cellules œufs par rapport aux zones tissulaires plus grandes prélevées sur les mêmes lames en tant que témoins.La qualité de l'ARN obtenue était adaptée à un séquençage de l'ARN spécifique aux types cellulaires, permettant l'identification de 236 gènes exprimés dans la cellule œuf apomictique, mais pas dans la cellule centrale apomictique, la cellule synergide ou la cellule initiale apomictique. Ni dans les cellules du gamétophyte sexué mature d'Arabidopsis thaliana. D'autres types cellulaires et tissulaires provenant d'espèces différentes peuvent être analysés afin de répondre à des questions supplémentaires en génétique du développement.Par exemple, la base moléculaire de l'empreinte génomique dans l'endosperme et les embryons des graines de plantes. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la génétique du développement et de la reproduction végétale pour explorer la base transcriptionnelle de la reproduction apomictique dans le genre Boechera. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des ARN de bonne qualité pour des analyses transcriptionnelles spécifiques à un type cellulaire à l'aide de la microdissection assistée par laser.

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