assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

L'objectif général de ce protocole pour la LAM est d'isoler des cellules végétales spécifiques afin d'obtenir des ARN de haute intégrité destinés à une analyse transcriptionnelle. L'accent est mis sur des cellules inaccessibles, telles que les cellules œufs, chez des espèces de boechera sexuées et apomictiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique du développement végétal, notamment la base transcriptionnelle des modes de reproduction sexuée et asexuée des plantes par voie semencière.

Le principal avantage de cette technique est qu'il est possible de réaliser certains types spécifiques de styles. Elle permet de surmonter l'effet de masquage des transcriptions de types cellulaires rares lors de l'analyse de tissus d'athérogenèse. Pour commencer cette procédure, utilisez la station de blocage pour remplir un plateau d'équilibrage en plastique, préalablement réchauffé et propre, avec de la paraffine fondue à 56 degrés Celsius.

Soulevez le couvercle du bain de paraffine et prenez une cassette à la fois. Transférez un échantillon dans la paraffine liquide à 56 degrés Celsius située dans un plateau d'équilibrage. Procédez rapidement afin d'éviter tout durcissement de la paraffine autour de l'échantillon lors de la manipulation de la cassette.

Ensuite, positionner l'échantillon selon le plan expérimental à l'aide d'une aiguille de préparation. Répéter la procédure jusqu'à ce que tous les échantillons soient transférés. Pour préparer des coupes minces destinées à la MEL, sur une table éclairée, retirer la paraffine contenant l'échantillon du plateau en plastique.

Dissez un bloc de cire contenant l'échantillon, comme un bourgeon ou une fleur, à l'aide d'un scalpel sans RNase. Ensuite, faites fondre une petite goutte de cire de paraffine sur l'extrémité d'une spatule. Utilisez ensuite la cire chaude pour fixer le bloc contenant l'échantillon sur le support.

Retirez la cire excédentaire entourant l'échantillon à l'aide d'un rasoir, et assurez-vous que le bloc présente une surface carrée aux bords parallèles. Ensuite, réglez le plateau chauffant à 42 degrés Celsius. Montez l'échantillon en toute sécurité sur le microtome.

Préparer des sections de sept micromètres d'épaisseur pour les cellules du gamétophyte mature de boechera. Ensuite, transférer les rubans de paraffine de 10 à 15 centimètres de long dans une boîte en plastique munie d’un carton noir au fond, avant de les positionner sur les lames pour MAC. Pour préparer les lames pour MAC, placer de cinq à dix lames montées sur cadre métallique sur la plaque chauffante, les surfaces planes orientées vers le haut.

Placer à la pipette un à deux millilitres d'eau sans RNase sur la partie plastique des lames. À l'aide d'une lame de rasoir, couper les rubans de paraffine en petits morceaux d'environ quatre à cinq centimètres. Assez longs pour recouvrir entièrement les fenêtres en plastique des lames.

Ensuite, utilisez une paire de pinces et une aiguille de préparation pour disposer les bandes de paraffine parallèlement les unes aux autres sur la fenêtre en plastique des lames. Soulevez délicatement les lames par une extrémité pour éliminer l'eau, puis remettez-les en place. Recouvrez le plateau chauffant d'un couvercle en plastique sans toucher les lames, et veillez à ce que le couvercle en plastique permette un échange d'air.

Séchez les lames à 42 degrés Celsius pendant la nuit. Sous une hotte chimique, déparaffinez les lames dans du xylol deux fois pendant 10 minutes à chaque fois. Veillez à immerger uniquement la partie en plastique des lames et à garder l'extrémité la plus large du cadre métallique de chaque lame sèche pour faciliter son retrait.

Laisser sécher les lames pendant 10 minutes dans la hotte chimique avant la microdissection au laser (LAM). Dans cette procédure, allumer l'ordinateur et le microscope pour la LAM. Ensuite, démarrer le programme qui commande le microscope et le laser.

Activez la boîte de commande du laser et allumez le laser en appuyant sur le bouton correspondant de la boîte de commande. Ensuite, placez un capuchon dans le support de capuchon. Placez la lame LAM sur une lame en verre destinée à la microscopie et assurez-vous que la surface plane de la lame, sur laquelle les tissus sont fixés, soit orientée vers la lame en verre.

Ensuite, placer la lame dans l'appareil avec la lame de verre en dessous. Enfin, positionner le support de capuchon avec le capuchon dans l'appareil. Sélectionner l'objectif 4x.

Dans le programme, déplacez le capot en position haute. Ensuite, effectuez une numérisation de la lame. Parcourez la lame et identifiez les structures d'intérêt.

Repérez et enregistrez leurs positions sur la lame afin de pouvoir revenir à l'emplacement exact pour l'étape de découpe. Ensuite, sélectionnez un objectif approprié. Vérifiez la position du laser en appuyant une fois sur le bouton de tir du laser.

Idéalement, dans une partie de la membrane ne contenant aucun tissu. Avec le capuchon en position vers le bas, utilisez l'outil stylet manuel pour délimiter les contours du type cellulaire ou du tissu d'intérêt. Par exemple, la cellule œuf.

Dissez-le au laser en appuyant sur Couper. Afin d'isoler des cellules individuelles, il est essentiel de les identifier clairement dans les bonnes sections. De plus, les cellules doivent avoir un diamètre d'au moins huit micromètres pour rendre possible une analyse transcriptionnelle spécifique au type cellulaire.

Veuillez noter que la sectionnement doit être répété si la bordure entourant la cellule n’a pas été complètement disséquée, ce qui peut généralement être observé à l’écran. Dans ce cas, il est recommandé de configurer le logiciel pour exécuter automatiquement deux répétitions du sectionnement par défaut. Ensuite, soulevez le capot et déplacez-vous vers la prochaine position d’enregistrement présentant une structure d’intérêt, puis disséquez la section suivante de cellule jusqu’à ce que toutes les cellules d’intérêt d’une lame soient collectées.

Veillez à ce que le bouchon soit positionné de manière à ce que la nouvelle section adhère à un emplacement vide sur le bouchon. Une fois que les types cellulaires d'intérêt de toutes les lames ont été isolés, retirez la lame de l'appareil. Placez le support de bouchon en position basse et inspectez visuellement la surface du bouchon.

Et utilisez l'objectif 4x pour exclure les contaminations non spécifiques de l'échantillon. Ensuite, fermez le bouchon. Et congélez les coupes sèches à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure.

Voici le schéma du gamétophyte femelle mature. Il s'agit de coupes minces d'ovules contenant des gamétophytes femelles chez Boechera divaricarpa, dans lesquelles les cellules œufs sont clairement identifiables en raison de la morphologie caractéristique du gamétophyte femelle. Une qualité d'ARN similaire a été obtenue lors de l'analyse des sections de cellules œufs par rapport aux zones tissulaires plus grandes prélevées sur les mêmes lames en tant que témoins.

La qualité de l'ARN obtenue était adaptée à un séquençage de l'ARN spécifique aux types cellulaires, permettant l'identification de 236 gènes exprimés dans la cellule œuf apomictique, mais pas dans la cellule centrale apomictique, la cellule synergide ou la cellule initiale apomictique. Ni dans les cellules du gamétophyte sexué mature d'Arabidopsis thaliana. D'autres types cellulaires et tissulaires provenant d'espèces différentes peuvent être analysés afin de répondre à des questions supplémentaires en génétique du développement.

Par exemple, la base moléculaire de l'empreinte génomique dans l'endosperme et les embryons des graines de plantes. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la génétique du développement et de la reproduction végétale pour explorer la base transcriptionnelle de la reproduction apomictique dans le genre Boechera. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des ARN de bonne qualité pour des analyses transcriptionnelles spécifiques à un type cellulaire à l'aide de la microdissection assistée par laser.