Name: Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à limage du développement Zebrafish Eye (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Apprenez l'imagerie du développement oculaire chez Danio rerio par microscopie à feuille de lumière. Cette méthode permet d'observer les événements morphogénétiques en temps réel avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

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Nous tenons à remercier Tobias Pietzsch pour avoir fourni son puissant logiciel open source BigDataViewer. Nous remercions l’installation de microscopie optique de l’Institut Max Planck de biologie cellulaire moléculaire et de génétique (MPI-CBG), à savoir Jan Peychl, Sebastian Bundschuh et Davide Accardi pour l’assistance technique, l’entretien parfait des microscopes utilisés dans l’étude et pour les commentaires sur le manuscrit et H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) pour le BigDataServer. Nous remercions Julia Eichhorn d’avoir assemblé le film 1. Les membres du laboratoire Norden et Svea Grieb ont fourni de nombreux commentaires utiles sur le manuscrit. Jaroslav Icha, Christopher Schmied et Jaydeep Sidhaye sont membres de l’École internationale de recherche Max Planck en biologie cellulaire, du développement et des systèmes et doctorants à l’Université technique de Dresde. Pavel Tomancak est soutenu par la bourse ERC Starting Grant : Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development et la bourse Human Frontier Science Program Young Investigator RGY0093/2012. Caren Norden est soutenue par le Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) et la Fondation allemande pour la recherche (DFG) [SFB 655, A25].

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Publication de cette vidéo-article est pris en charge par Zeiss.

Morphogenèse est le processus qui façonne l&#39;embryon et, avec la croissance et la différenciation entraîne l&#39;ontogenèse d&#39;un ovule fécondé dans un organisme multicellulaire mature. Les processus morphogénétiques au cours du développement des animaux peuvent être analysées mieux par imagerie des spécimens vivants intacts 1-3. En effet, comme l&#39;imagerie de l&#39;embryon entier conserve tous les composants qui alimentent et régulent le développement, notamment des gradients de molécules de signalisation, la matrice extracellulaire, du système vasculaire, innervation ainsi que les propriétés mécaniques du tissu environnant. Pour combler les échelles, à laquelle la morphogenèse se produit, les événements intracellulaires rapides doivent être capturés sur une échelle de temps de minutes dans le contexte du développement de l&#39;ensemble du tissu au cours des heures ou des jours. Pour répondre à toutes ces exigences, une implémentation moderne 4 du orthogonale plane illumination microscope 5 a été développé. A l&#39;origine, il a été nommé sélective Plan Illumination Microscopy (SPIM) 4; maintenant une feuille de lumière terme embrasse tout Fluorescence Microscopy (LSFM) est généralement utilisé. LSFM permet une imagerie à haute résolution temporelle, tout en induisant moins phototoxicité que le balayage laser ou disque rotatif de microscopes confocaux 6,7. Aujourd&#39;hui, il existe déjà de nombreuses implémentations du principe de base feuille de lumière d&#39;éclairage et il a été utilisé à l&#39; image d&#39; une grande variété de spécimens et les processus précédemment inaccessibles aux chercheurs 8-11. Nous voudrions d&#39;abord de mettre en évidence plusieurs avantages clés de LSFM par rapport aux approches de microscopie confocale classiques: Pour acquérir des résultats significatifs de l&#39;imagerie en direct des expériences microscopiques, il est important que l&#39;observation ne concerne que très peu l&#39;échantillon. Cependant, de nombreux organismes, y compris le poisson zèbre sont très sensibles à l&#39;exposition de lumière laser, ce qui rend difficile à l&#39;image dans un microscope confocal à haute résolution temporelle sans phototoxicité effets comme bloqué ou retardé 6,7 de développement. LSFM est actuellement la technique d&#39;imagerie de fluorescence avec le moins d&#39; effets perturbateurs sur l&#39;échantillon 7. Comme la feuille de lumière laser mince illumine seulement la partie de l&#39;échantillon qui est imagée à un point de temps particulier, la feuille microscope optique est en utilisant des photons très efficacement. Par conséquent, l&#39;exposition à la lumière faible permet de plus longues observations time-lapse de spécimens sains, par exemple 12-17. En outre, grâce à l&#39;invasivité minimale de LSFM, le nombre d&#39;images acquises ne sont plus dictées par la quantité de lumière de l&#39;échantillon peut tolérer, mais plutôt par la quantité de données peuvent être traitées et stockées. Dans le même sens de garder l&#39;échantillon dans des conditions proches physiologiques, LSFM est livré avec des exemples de stratégies de montage alternatives bien adaptés pour les embryons vivants. Dans les techniques de LSFM, les embryons sont généralement intégrés dans une mince colonne de faible pourcentage d&#39;agarose. Le mounting dans les cylindres d&#39;agarose permet la liberté totale de rotation, de sorte que l&#39;échantillon peut être observée à partir de l&#39;angle parfait (en LSFM appelé vue) et à partir de plusieurs vues simultanément. L&#39;imagerie multiview et la fusion subséquente multiview est bénéfique en particulier pour les grands, les spécimens de diffusion et permet de les capturer avec une haute résolution isotrope. Un résumé des autres stratégies de LSFM de montage possibles peut être trouvée dans le manuel d&#39;utilisation du microscope officiel, dans le chapitre sur la préparation de l&#39;échantillon écrit par le laboratoire de E. Reynaud. Il est recommandé d&#39;une lecture, surtout si l&#39;objectif est d&#39;image différents échantillons que ceux décrits ici. L&#39;acquisition de l&#39;image dans LSFM est basé caméra grand champ, par opposition à balayage laser microscope confocal. Il en résulte un signal plus élevé sur bruit (SNR) pour les images acquises et peut être très rapide (quelques dizaines à quelques centaines d&#39;images par seconde). La grande sensibilité de LSFM permet en outre de l&#39;imagerie samp faiblement fluorescentles, comme des facteurs de transcription exprimés à des niveaux endogènes 18 ou, dans un avenir proche, les protéines endogènes marqués en utilisant CRISPR / cas9. Le SNR élevé est également important pour le succès de l&#39;analyse d&#39;image en aval. La haute vitesse est nécessaire non seulement de capturer des processus intracellulaires rapides, mais aussi à l&#39;image tout embryon à partir de plusieurs points de vue assez rapide. Une fusion parfaite entre les multiples points de vue ne peut être atteint, si le phénomène observé ne change pas lors de l&#39;acquisition de ces plusieurs piles z provenant de vues séparées. Les avantages de LSFM ne viennent généralement au détriment de la qualité de l&#39;image. La résolution latérale de LSFM est légèrement pire que la résolution d&#39;un microscope confocal. En effet, les objectifs de détection utilisés dans LSFM ont une ouverture numérique plus faible (généralement 1,0 ou moins) par rapport à des objectifs de 01/02 à 01/03 d&#39;eau ou d&#39;immersion de silicium sur les configurations de confocale classiques. En outre, en raison de la détection de champ large en LSFM (AbsenCE d&#39;un sténopé), il n&#39;y a plus de lumière hors-focus par rapport à un microscope confocal. La quantité de lumière hors-focus est déterminé par l&#39;épaisseur de la nappe de lumière. Néanmoins, ces inconvénients sont compensés par le SNR supérieur en LSFM. Dans la pratique, cela se traduit par des images de qualité similaires par rapport à par exemple la filature disque acquisition confocal 15. Par conséquent, ce qui permet une extraction fiable des fonctionnalités telles que des membranes ou des noyaux cellulaires, par exemple, pour la lignée cellulaire de traçage 15,19. La résolution axiale LSFM est déterminée, en plus de l&#39;objectif de détection, par l&#39;épaisseur de la nappe de lumière. La résolution axiale de LSFM peut, dans certains cas dépasser la résolution des microscopes confocaux. Tout d&#39;abord, l&#39;amélioration de la résolution vient quand la feuille de lumière est plus mince que la résolution axiale de l&#39;objectif de détection, ce qui se produit généralement pour les grands spécimens imagées avec un objectif à faible grossissement. La deuxième façon, comment le LSFM peut atteIEVE meilleure résolution axiale, est la fusion de multiview, dans lequel les informations de haute résolution xy de différents points de vue est combiné en une seule pile d&#39;images. La pile fusionnée résultante a une résolution isotrope approchant les valeurs de résolution dans le sens latéral 20,21. La stratégie d&#39;enregistrement des vues multiples sur l&#39;autre décrit dans cet article est basé sur l&#39; utilisation de billes de polystyrène fluorescentes comme marqueurs fiduciaires intégrés dans l&#39;agarose autour de l&#39;échantillon 20,21. À la suite de la commercialisation de LSFM, cette technique est maintenant disponible pour une large communauté de scientifiques 22. Par conséquent, la motivation pour la rédaction de ce protocole est de rendre cette technologie accessible aux biologistes du développement qui manquent d&#39;expérience pratique dans LSFM et pour obtenir ces scientifiques ont commencé à utiliser cette technologie avec leurs échantillons. Notre protocole utilise le microscope à feuille de lumière commerciale, ce qui constitue un microscope conceptuellement simple tchapeau est facile à utiliser. Nous aimerions en outre évoquer d&#39; autres protocoles récents pour l&#39; imagerie zebrafish avec des configurations de LSFM maison construite, qui pourraient convenir pour répondre à des questions particulières 23-25. Une autre option d&#39;entrée à LSFM sont les plates - formes ouvertes 26,27, qui utilisent les principes d&#39;accès ouvert pour apporter la microscopie nappe de lumière à une communauté plus large. La documentation à la fois du matériel et les aspects logiciels peuvent être trouvées à http://openspim.org et https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. Dans ce protocole, nous utilisons le zebrafish téléostéens comme un système modèle pour étudier les processus de développement avec LSFM. Morphogénèse de l&#39;oeil du poisson zèbre est un exemple qui souligne un grand nombre des avantages de LSFM. LSFM a déjà été utilisé dans le passé pour étudier le développement des yeux dans medaka 28 et chez le poisson zèbre 29,30. Au stade précoce du développement de l&#39;œil, il est compliqué d&#39;orienter l&#39;embryon correctement pour la microscopie conventionnelle,comme le jaune encombrant ne permet pas l&#39;embryon de se coucher sur le côté avec son oeil face à l&#39;objectif. Cependant, avec LSFM de montage dans une colonne d&#39;agarose, l&#39;échantillon peut être positionné de manière reproductible. En outre, lors du passage de la vésicule optique au niveau optique coupe, l&#39;œil subit morphogénétiques remaniements majeurs accompagnés d&#39;une croissance, ce qui nécessite la capture d&#39;une grande z empilement et un grand champ de vision. Aussi pour ces défis LSFM est supérieure à l&#39;imagerie confocale conventionnelle. Le processus de formation de cupule optique est en trois dimensions, il est donc difficile de comprendre et de visualiser uniquement par l&#39;imagerie d&#39;une vue. Cela rend l&#39;imagerie multiview avec une résolution isotrope bénéfique. Après la formation de la cupule optique, la rétine devient de plus en plus sensible à l&#39;exposition au laser. Ainsi, la faible phototoxicité associée à LSFM est un atout majeur pour l&#39;imagerie à long terme. Nous présentons ici un protocole optimisé pour l&#39;imagerie d&#39;un à trois jours vieux zebrafish embryons d&#39;unnd larves en mettant l&#39;accent sur le développement de l&#39;œil. Notre méthode permet d&#39;enregistrer des films en accéléré couvrant jusqu&#39;à 12-14 heures avec une résolution spatiale et temporelle. Surtout, nous montrons également un pipeline pour le traitement des données, ce qui est une étape essentielle dans LSFM, car cette technique génère toujours de grands ensembles de données, souvent dans la gamme de téraoctet.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Sigma</td><td>A4018 ou A9414</td><td></td></tr><tr><td>Méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm rouge fluorescent perles F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu ; l (1&nbsp ; mm diamètre intérieur, marqué en noir) Marque</td><td></td><td>701904</td><td>vendue comme pièce de rechange pour transferpettor</td></tr><tr><td>Pistons d’embout en téflon pour 20&nbsp ; &mu ; l capillaires</td><td>Marque 701932</td><td></td><td>vendue comme pièce de rechange pour transferpettor</td></tr><tr><td>Lamelles circulaires en verre diamètre 18 mm, épaisseur choisie 0,17&nbsp ; mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Joints toriques pour fenêtres de chambre 17&times ; Pince</td> à <td>épiler de microscopie</td><td></td><td></td>Carl Zeiss de 1,5 mm</tr><tr><td>, style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>Seringues Luer-Lock de 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm Câble d’extension pour perfusion compatible avec les seringues Luer-Lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lien 1 Application</td><td></td><td></td> de reconstruction Multiview<td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Lien 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

utilisation de feuilles lumière fluorescence microscopy à l&#39;image du développement zebrafish eye

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) gagne de plus en plus en popularité en tant que méthode d’imagerie du développement embryonnaire. Les principaux avantages de la LSFM par rapport aux systèmes confocaux sont sa faible phototoxicité, ses stratégies de montage douces, son acquisition rapide avec un rapport signal/bruit élevé et la possibilité d’imager des échantillons sous différents angles (vues) pendant de longues périodes. L’imagerie à partir de plusieurs vues libère tout le potentiel de LSFM, mais en même temps, elle peut créer des ensembles de données de la taille d’un téraoctet. Le traitement de tels ensembles de données est le plus grand défi de l’utilisation de LSFM. Dans ce protocole, nous esquissons quelques solutions à ce problème. Jusqu’à récemment, la LSFM était principalement pratiquée dans des laboratoires qui avaient l’expertise nécessaire pour construire et exploiter leurs propres microscopes à feuillet de lumière. Cependant, au cours des trois dernières années, plusieurs implémentations commerciales de LSFM sont devenues disponibles, qui sont polyvalentes et faciles à utiliser pour tout biologiste du développement. Cet article s’adresse principalement aux chercheurs, qui ne sont pas des développeurs de technologie LSFM, mais qui souhaitent utiliser LSFM comme outil pour répondre à des questions spécifiques de biologie du développement. 
Ici, nous utilisons l’imagerie du développement de l’œil du poisson zèbre comme exemple pour présenter au lecteur la technologie LSFM et nous démontrons les applications de la LSFM à plusieurs échelles spatiales et temporelles. Cet article décrit un protocole expérimental complet commençant par le montage d’embryons de poisson-zèbre pour le LSFM. Nous décrivons ensuite les options d’imagerie à l’aide du microscope à feuillet de lumière disponible dans le commerce. Il est important de noter que nous expliquons également un pipeline pour l’enregistrement ultérieur et la fusion d’ensembles de données multivues à l’aide d’une solution open source mise en œuvre en tant que plugin Fiji. Bien que ce protocole se concentre sur l’imagerie de l’œil du poisson-zèbre en développement et le traitement des données à partir d’une configuration d’imagerie particulière, la plupart des informations et des suggestions de dépannage présentées ici sont d’usage général et le protocole peut être adapté à une variété d’expériences de microscopie à feuillet de lumière.

LSFM est une méthode idéale pour l&#39;imagerie des processus de développement à travers les échelles. Plusieurs applications sont compilées ici montrant l&#39;imagerie à la fois à court et à long terme des structures intracellulaires, ainsi que des cellules et des tissus entiers. Ces exemples démontrent également que LSFM est un outil utile à différents stades de développement de l&#39; œil de la formation de cupule optique à la neurogenèse dans la rétine. Film 1 sert d&#39;illustration de l&#39;approche générale de LSFM, montrant d&#39; abord une vue zoomée sur un embryon intact dans le enrobage cylindre d&#39;agarose à fond clair et plus tard montrant une vue détaillée de la rétine dans le canal de fluorescence. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. LSFM de la rétine zebrafish Pour illustrer l&#39;approche de LSFM, ce film montre d&#39; abord dans le fond clair que l&#39;embryon est imagé intacte à l&#39; intérieur de la unegarose cylindre avant de passer à fluorescence. Plus tard, il est démontré que le grand champ de vision permet l&#39;observation de l&#39;ensemble de la rétine. Ensuite, le film montre une petite région agrandie de la rétine pour mettre en évidence la bonne résolution subcellulaire. Un ath5: gap-GFP 37 transgénique embryon de poisson zèbre a été utilisé pour l&#39; imagerie. Ce transgène labels différents neurones dans la rétine (principalement des cellules ganglionnaires et des précurseurs de photorécepteurs). La partie de la fluorescence du film a été capturé en une seule vue d&#39;enregistrement avec un éclairage à double face en utilisant le W objectif 40X / 1.0 avec des intervalles de 5 min. La projection d&#39;intensité maximale d&#39;un volume épais de 30 um est affichée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">S&#39;il vous plaît</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> Movie 2 démontre, comment les événements intracellulaires très rapides peuvent être capturées avec une haute résolution; dans ce cas, la croissance des microtubules àainsi que leurs extrémités dans les cellules progénitrices neuronales rétiniennes. L&#39;information contenue dans le film permet un suivi et la quantification des microtubules ainsi que la fin de croissance. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Film 2:. Dynamique microtubules dans une cellule unique Ce film captures de plus en plus des conseils ainsi que des microtubules marqués par la pointe de plus de protéine marqueur EB3-GFP 38. La protéine est exprimée dans une cellule progénitrice de la rétine. Les microtubules croissent principalement dans la direction apicale à partir basale (haut en bas). La vitesse moyenne des comètes EB3 a été mesurée en 0,28 ± 0,05 um / sec. La tache lumineuse sur le côté apical de la cellule présentant une activité de nucléation élevée de microtubules est le centrosome. Le type embryon sauvage a été injecté avec hsp70: EB3-GFP ADN plasmidique. Le film a été acquis 4 heures après un choc thermique (15 min à 37 ° C) à environ 28 hrpost fertilization (HPF) en une seule vue d&#39;enregistrement avec un éclairage simple face en utilisant les 63X / 1.0 intervalles de temps objective et 1 sec W. La cellule unique a été recadrée d&#39;un champ de vision couvrant la majeure partie de la rétine. L&#39;intensité maximale de projection de deux tranches est affiché. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a> La figure 3 montre, comment les structures intracellulaires peuvent être suivis pendant plusieurs heures. Ici, le centrosome au sein de translocation des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) est capturé. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Figure 3:. Localisation Centrosome pendant la translocation des cellules ganglionnaires de la rétine Ce montage d&#39;une expérience time-lapse montre la position du centrosome pendant toute la maturation cellulaire ganglionnaires de la rétine (RGC).Dans les progéniteurs neuronaux centrosome est localisé dans la pointe du processus apical (1:00). Au cours de la division cellulaire, les deux centrosomes servent de pôles pour le fuseau mitotique (02h25). Cette division se traduit par une cellule fille qui se différencie en une RGC et une seconde cellule fille qui devient un précurseur de cellules photoréceptrices. Après la division, le corps cellulaire du CGR est transloqué sur le côté basal de la rétine, tandis que le processus apicale reste attaché sur le côté apical. Une fois que le RGC atteint le côté de la base, son processus apical se détache et le centrosome se déplace avec elle (06:15). Le centrosome peut être suivie tout en rétractant progressivement en même temps que le processus apical (6:50, 07:20, 08:10). Dans la dernière image (08h55) la cellule ganglionnaire augmente un axone de son côté de base, tandis que le centrosome est encore localisée apicalement. L&#39;expression mosaïque a été réalisée par injection d&#39;ADN plasmidique dans de type sauvage embryon à un stade de la cellule. Les cellules sont visualisées par le ath5: GFP-CAAX (vert) construct, qui marque RGC et d&#39;autres neurones. Les centrosomes (pointes de flèches) sont marquées par Centrin-tdTomato 29 expression (magenta). Du côté apical de la rétine se trouve au sommet de l&#39;image et de la face basale vers le bas. La projection d&#39;intensité maximale d&#39;un volume épais de 30 um est représenté. Les images ont été coupées à partir d&#39;un film couvrant toute la rétine. Le film commence à environ 34 h après la fécondation de (HPF). A z pile a été acquis toutes les 5 min avec le W objectif 40X / 1.0. Le temps est indiqué en hh: mm. La barre d&#39;échelle représente 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Sur la figure 4 , il apparaît, comme seul le comportement cellulaire peut être extraite à partir des données de capture du tissu entier tel que 1 dans le film. Translocation d&#39;un RGC peut facilement être suivie et son procédé apicale et basalees suivies. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Figure 4:. Translocation d&#39;une seule cellule ganglionnaire La translocation RGC apical vers le côté basal de la rétine se produit après la mitose terminal tel que décrit à la figure 3. Le CGR est marqué par l&#39; expression du ath5. Écart-GFP 37 transgène. La projection d&#39;intensité maximale d&#39;un volume épais de 30 um est représenté. Les images ont été coupées à partir d&#39;un film couvrant toute la rétine. Le film commence à environ 34 HPF. A z pile a été acquis toutes les 5 min avec le W objectif 40X / 1.0. Le temps est indiqué en hh: mm. La barre d&#39;échelle représente 5 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> La figure 5 démontre la capacité de multiview LSFM pour capturer sc tissulaireprocessus morphogénétiques ale avec une résolution cellulaire sur l&#39;exemple de fibre tasse morphogenèse, au cours de laquelle optique vésiculaire se transforme en une cupule optique. La qualité de l&#39;image peut être grandement améliorée par l&#39;imagerie multiview, lorsque l&#39;image finale est combiné à partir des informations de 5 vues différentes (dans ce cas) en un seul z pile avec une résolution isotrope. Cette figure illustre l&#39;amélioration de la qualité de l&#39;image après la fusion moyenne pondérée et gain supplémentaire en contraste de l&#39;image et de la résolution après multiview déconvolution. La figure montre deux tranches optiques dans différentes orientations à travers l&#39;ensemble de données. En outre, un montage de l&#39;ensemble de données déconvoluée montre la morphogenèse de cupule optique au fil du temps. Tous les points de temps sont ensuite présentés dans Movie 3. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Figure 5: Comparaison de la qualité d&#39;image entre vue unique et deux méthodes de multiview fusion. (A) Une tranche optique de données de vue unique représentés à la vue latérale et (B) vue dorsale. artefacts Stripe et la dégradation du signal plus profond à l&#39;intérieur de l&#39;échantillon sont apparents. Aussi une partie de l&#39;image visible dans les données fusionnées (FC) n&#39;a pas été capturé dans ce point de vue particulier. (C) La même tranche optique, maintenant que les données multivues fusionné présentés à la vue latérale et (D) vue dorsale. A noter que les artefacts de bande sont supprimés et les structures profondes dans l&#39;échantillon sont mieux résolus. (E) La même tranche optique maintenant multiview déconvoluée données présentées à la vue latérale et (F) vue dorsale. Notez le contraste et la résolution accrue de sorte que les membranes et les noyaux des cellules individuelles peuvent être bien distingués. La résolution ne se détériore pas notamment plus à l&#39;intérieur de l&#39;échantillon. L&#39;ensemble de données a été acquis avec un éclairage à double face de 5 vues environ 20 degrés. Les z piles de abà 100 um avec 1,5 um taille de l&#39;étape ont été acquises à chaque vue en intervalles de 10 minutes pendant 10 heures avec le W objectif 20X / 1.0. images d&#39;entrée pour la fusion de multiview et déconvolution ont été échantillonné 2 × pour accélérer le traitement de l&#39;image. 15 itérations de la déconvolution multivues ont été exécutés. (G) Le montage montre une zone recadrée de la vue dorsale à partir des données déconvoluées pour mettre en évidence les événements morphogénétiques au cours du développement de l&#39; œil au début de la vésicule optique à l&#39;étape de la cupule optique. Les deux couches de la vésicule optique, qui sont initialement épithéliums colonnaire similaires, se différencient en des populations cellulaires distinctes. La couche distale proche de l&#39;épiderme devient le neuroepithelium rétinienne (RN) et la couche proximale proche du tube neural devient l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (RP). Les cellules de la forme allongée et RN invaginent pour former la coupe optique (01 heures 40-à-05h00); en même temps, les cellules RP aplatissent. L&#39;ectoderme superficiel est amené à former une lentille (01:40), whinvagine ich plus tard (5:00). Le film commence à 17 HPF. Le temps est indiqué en hh: mm. Toutes les membranes cellulaires sont marquées par la β-actine: ras-GFP transgène et tous les noyaux sont marqués par la hsp70: H2B-RFP transgène. La barre d&#39;échelle représente 30 um. FB prosencéphale, lentille LE, OP placode olfactif, RN neuroepithelium rétinienne, RP épithélium pigmentaire rétinien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Film 3: Optic cup morphogenèse montré avec vue unique et deux méthodes de fusion multiview Le film time-lapse illustre le processus complet de fibre tasse morphogenèse de la vésicule optique à l&#39;étape de la cupule optique.. Il montre une seule tranche optique de la vue latérale (en haut) et une seule tranche optique de la vue dorsale (en bas). Les cellules de la vésicule optique en développement subissent des réarrangements complexes, pour finalement former la cupule optique hémisphérique, avec le neuro-épithélium de la rétine interne et externe de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine. Une lentille est formée à partir de l&#39;ectoderme de surface. Il invagine avec le neuroepithelium et se trouve dans la cupule optique. Toutes les membranes cellulaires sont marquées par l&#39;expression de la β-actine: ras-GFP (vert) transgène et les noyaux sont marqués par hsp70: H2B-DP (magenta). Le film commence à environ 17 HPF. L&#39;ensemble de données a été acquis à double éclairage de la face 5 vues environ 20 degrés de distance et az piles d&#39;environ 100 um ont été acquises toutes les 10 min avec le W objectif 20X / 1,0. Le temps est indiqué en hh: mm. La barre d&#39;échelle représente 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">S&#39;il vous plaît</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

La microscopie à fluorescence à feuillet de lumière est un excellent outil pour l’imagerie du développement embryonnaire. Il permet d’enregistrer de longs films en accéléré d’embryons vivants dans des conditions physiologiques proches. Nous démontrons son application pour l’imagerie du développement de l’œil du poisson-zèbre à de larges échelles spatio-temporelles et présentons un pipeline pour la fusion et la déconvolution d’ensembles de données multivues.

Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à l&#39;image du développement Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

L’objectif global de ce protocole expérimental est d’imager le développement oculaire de l’embryon de poisson-zèbre au microscope à feuillet de lumière et de traiter l’ensemble des données multivues acquises dans Figi via le plug-in de l’application de reconstruction multivue. Cette méthode peut vous aider à comprendre les événements morphogénétiques dans le développement animal. Le principal avantage de cette méthode est que vous pouvez observer des événements morphogénétiques dans l’embryon en développement intact avec une résolution spatiale et temporelle élevée.Les principaux avantages de la microscopie à feuillet de lumière sont la faible phototoxicité de la méthode, le temps d’acquisition rapide avec lequel vous pouvez imager l’échantillon et que vous pouvez imager l’échantillon sous différents angles, ce que l’on appelle des vues. La capture de l’échantillon à partir de différentes vues nous permet de surmonter la dégradation du signal et de l’axe défini. Ces différentes images peuvent ensuite être utilisées et enregistrées à l’aide de microsphères fluorescentes autour de l’échantillon.Nous pouvons reconstruire le volume tridimensionnel en atteignant la résolution isotrope. Bien que nous démontrions l’utilisation de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière pour le développement de l’œil du poisson-zèbre, cette méthode peut également être utilisée pour répondre à diverses questions en biologie du développement et en neurosciences en utilisant divers organismes modèles. Pour commencer, vissez l’objectif de détection dans le microscope tout en gardant les objectifs lumineux couverts.Ensuite, débouchez les objectifs et glissez soigneusement la chambre d’échantillon dans le microscope. Fixez la chambre en serrant la vis. Ensuite, connectez la sonde de température et le bloc Peltier au microscope.Les deux tubes qui font circuler le liquide de refroidissement du bloc Peltier sont compatibles avec les deux connecteurs et peuvent fonctionner dans les deux orientations. Ensuite, utilisez une seringue pour charger la chambre à travers la seringue avec de la solution jusqu’au bord supérieur des fenêtres de la chambre et vérifiez qu’il n’y a pas de fuites. Maintenant, allumez le microscope, l’ordinateur et l’incubation.Démarrez le logiciel d’exploitation du microscope et réglez la température d’incubation sur 28,5 degrés Celsius. Pendant que la température est nécessaire pendant une heure, préparez l’échantillon. Commencez par préparer l’agarose.Faites fondre une aliquote préparée d’un millilitre d’agarose à bas point de fusion à 1 % dans un milieu E trois à 70 degrés Celsius. Après environ 15 minutes, transférez 600 microlitres d’agarose fondu dans un tube frais de 1,5 millilitre et ajoutez 250 microlitres de milieu E3, 50 microlitres de 0,4 % MS 222 et 25 microlitres de solution de bouillon de billes fluorescentes vortex. Placez le tube dans un bloc chauffant à environ 39 degrés Celsius pour laisser l’agarose s’approcher de son point de gélification.Ensuite, poussez les pistons à pointe en téflon jusqu’au fond de capillaires en verre d’un millimètre de diamètre intérieur. Préparez-en cinq. Maintenant, vortex brièvement le mélange d’agarose, puis transférez cinq embryons avec la quantité minimale de liquide à l’intérieur.Ensuite, insérez un capillaire et aspirez un embryon la tête la première. La tête doit entrer avant la queue et il ne peut pas y avoir de bulles d’air. Prélevez suffisamment de solution pour qu’il y ait environ deux centimètres d’agarose au-dessus de l’embryon et un centimètre d’agarose en dessous.Aspirez un embryon dans chaque capillaire avant de continuer. Cette étape nécessite un peu de pratique pour être maîtrisée. Préparez-vous à cela en utilisant des embryons sans valeur.Lorsque l’agarose se solidifie complètement, stockez les échantillons dans un milieu E trois en soumettant les capillaires à une paroi de bécher avec de la pâte à modeler avec l’ouverture inférieure en solution. Assemblez maintenant le porte-échantillon. Tout d’abord, insérez deux manchons en plastique de la bonne taille l’un contre l’autre dans la tige.Les fentes sur les manches doivent être tournées vers l’extérieur. Ensuite, fixez une vis de serrage. Et insérez le capillaire à travers le support jusqu’à ce que la bande de couleur noire devienne visible de l’autre côté.Évitez de toucher le piston. Serrez ensuite la vis de serrage. Ensuite, poussez un centimètre d’agarose hors du capillaire et coupez-le.Insérez ensuite la tige dans le disque du porte-échantillon. Avant de charger le disque d’échantillonnage, vérifiez que la platine est dans la position la plus haute dans le logiciel de contrôle. Ensuite, à l’aide de rails de guidage, faites glisser le support et l’échantillon dans le microscope.Maintenant, imagez l’échantillon choisi comme décrit dans le protocole texte. Le traitement des données est effectué dans Figi. Il s’agit d’une distribution de ImageJ.Avant de commencer, Figi doit être mis à jour. Enregistrez l’ensemble des données d’image acquises dans un seul dossier. Les fichiers intermédiaires du traitement d’image seront enregistrés dans le même dossier.Maintenant, démarrez l’application de reconstruction multi-vues. Ensuite, définissez un nouvel ensemble de données. Sélectionnez l’option Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats et créez un nom pour le fichier de données de sortie.Sélectionnez ensuite le premier fichier CZI de l’ensemble de données. Les métadonnées seront chargées automatiquement. Dans les métadonnées de l’image, vérifiez que le nombre d’angles, les canaux, les éclairages et la taille du voxel sont tous correctement réglés.En appuyant sur OK, une fenêtre de journal, une fenêtre de l’explorateur de configuration de la vue et une fenêtre de console s’ouvrent. L’explorateur de configuration de la vue fournit une interface conviviale. Sélectionnez les fichiers à traiter et appuyez sur le bouton droit de la souris.Une nouvelle fenêtre s’ouvrira montrant les différentes étapes de traitement au fur et à mesure de leur exécution. Dans le coin supérieur droit se trouvent les boutons d’information et d’enregistrement. Info affiche un résumé du contenu du fichier de données enregistré et appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les résultats du traitement.Sinon, le programme n’enregistre pas les résultats des étapes de traitement. Pour réenregistrer l’ensemble des données, sélectionnez d’abord tous les fichiers en appuyant sur Ctrl+A et en utilisant un clic droit. Sélectionnez ensuite Réenregistrer le jeu de données et En tant que HDF5.Une confirmation de l’action de réenregistrement doit alors être cochée. Après quelques minutes, pour chaque point temporel, le programme indiquera quand la résauvegarde est terminée. Ensuite, procédez à la détection des points d’intérêt dans les données.Sélectionnez tous les points temporels en appuyant sur Ctrl+A et cliquez avec le bouton droit de la souris. Pour sélectionner, détectez les points d’intérêt. Dans les options, sélectionnez Différence-de-gaussienne.Et sélectionnez, descendez des échantillons d’images avant la segmentation. Dans la fenêtre suivante, choisissez les paramètres de détection. Dans les options de localisation des sous-pixels, sélectionnez Ajustement quadratique en 3 dimensions.Ensuite, dans la spécification du point d’intérêt, sélectionnez interactif. Pour l’option XY de l’échantillon descendant, sélectionnez Correspondance de la résolution Z. Et pour l’échantillon descendant Z, sélectionnez 1x.Ensuite, exécutez l’opération en sélectionnant l’option Calcul sur CPU Java. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez une vue pour tester les paramètres. Une fois la vue chargée, ajustez la luminosité et le contraste en appuyant sur Ctrl+Maj+C sur le clavier.De plus, pour la détection des billes, activez l’option de recherche de vert maxima. Observez maintenant la segmentation sous forme d’anneaux verts autour des détections. Ajustez les valeurs de différence de gaussienne pour les paramètres sigma un et threshold afin de segmenter de manière optimale les billes avec le nombre minimal de faux positifs.Chaque cordon ne doit être détecté qu’une seule fois. Après avoir déterminé les paramètres optimaux, appuyez sur OK. Une fois que l’ordinateur a chargé chaque vue individuelle du point temporel et segmenté les perles, le programme génère un fichier journal avec le nombre de perles détectées par vue.Il devrait y avoir entre 600 et plusieurs milliers de perles par vue. Sinon, les paramètres de détection doivent être peaufinés. Il s’agit d’un processus délicat.La pyramide de détection est rarement précise du premier coup et les réinitialisations peuvent varier entre les points temporels d’un film. Détendre le frais détectera toutes les vraies perles et permettra plus de faux positifs peut aider. Si aucune combinaison de la pyramide ne fonctionne, un nouvel ensemble de données utilisant différentes billes fluorescentes doit être acquis.Procédez maintenant à l’enregistrement des détections et à la réalisation d’une déconvolution multi-vues à partir de la pile. LSFM est une méthode idéale pour imager les processus de développement à plusieurs échelles, des structures intercellulaires aux cellules et aux tissus entiers pendant de longues périodes. Des événements intercellulaires très rapides peuvent être capturés à haute résolution, tels que la croissance de microtubules dans les cellules neuroprogénitrices.À partir d’un film d’une seule vision, la quantification de la croissance des microtubules est possible. Les structures intracellulaires peuvent être suivies pendant de nombreuses heures, comme le centrosome dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Le comportement d’une seule cellule peut être extrait d’images de tissus entiers, telles que la translocation d’une cellule ganglionnaire à travers la rétine.La déconvolution multi-vues crée une pile Z isotrope en combinant plusieurs vues différentes à l’aide de la fonction d’étalement de points. Cela permet d’obtenir des images considérablement améliorées par rapport aux vues uniques ou aux fusions moyennes pondérées. Par exemple, la transformation de la vésicule optique en une cupule optique peut être étudiée à partir de coupes optiques dans différentes orientations grâce à l’ensemble de données présenté.De plus, la bonne qualité globale de l’image, même au plus profond de l’embryon, est apparente. Comme lors de l’observation de la morphogenèse de la cupule optique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de monter une image d’embryons de poisson-zèbre dans un microscope à feuillet de lumière.Et comment traiter des ensembles de données multi-vues dans Figi. Une fois maîtrisé, il faudra environ deux heures pour démarrer une expérience en accéléré sur un microscope à feuillet de lumière. L’analyse ultérieure des données prendra beaucoup plus de temps.Il peut être avantageux d’utiliser un cluster d’ordinateurs pour cette tâche. Vous trouverez d’autres conseils pratiques, des conseils de dépannage et des liens vers d’autres ressources dans le protocole texte. Il doit y avoir une capacité de stockage suffisante et un plan de traitement des données clair disponible avant l’expérience.Si vous rencontrez des problèmes, des questions ou des demandes futures, veuillez vous référer au site Web de la fonctionnalité respective ou signaler des problèmes sur les dépôts github respectifs.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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