Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à l'image du développement Zebrafish Eye

L’objectif global de ce protocole expérimental est d’imager le développement oculaire de l’embryon de poisson-zèbre au microscope à feuillet de lumière et de traiter l’ensemble des données multivues acquises dans Figi via le plug-in de l’application de reconstruction multivue. Cette méthode peut vous aider à comprendre les événements morphogénétiques dans le développement animal. Le principal avantage de cette méthode est que vous pouvez observer des événements morphogénétiques dans l’embryon en développement intact avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Les principaux avantages de la microscopie à feuillet de lumière sont la faible phototoxicité de la méthode, le temps d’acquisition rapide avec lequel vous pouvez imager l’échantillon et que vous pouvez imager l’échantillon sous différents angles, ce que l’on appelle des vues. La capture de l’échantillon à partir de différentes vues nous permet de surmonter la dégradation du signal et de l’axe défini. Ces différentes images peuvent ensuite être utilisées et enregistrées à l’aide de microsphères fluorescentes autour de l’échantillon.

Nous pouvons reconstruire le volume tridimensionnel en atteignant la résolution isotrope. Bien que nous démontrions l’utilisation de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière pour le développement de l’œil du poisson-zèbre, cette méthode peut également être utilisée pour répondre à diverses questions en biologie du développement et en neurosciences en utilisant divers organismes modèles. Pour commencer, vissez l’objectif de détection dans le microscope tout en gardant les objectifs lumineux couverts.

Ensuite, débouchez les objectifs et glissez soigneusement la chambre d’échantillon dans le microscope. Fixez la chambre en serrant la vis. Ensuite, connectez la sonde de température et le bloc Peltier au microscope.

Les deux tubes qui font circuler le liquide de refroidissement du bloc Peltier sont compatibles avec les deux connecteurs et peuvent fonctionner dans les deux orientations. Ensuite, utilisez une seringue pour charger la chambre à travers la seringue avec de la solution jusqu’au bord supérieur des fenêtres de la chambre et vérifiez qu’il n’y a pas de fuites. Maintenant, allumez le microscope, l’ordinateur et l’incubation.

Démarrez le logiciel d’exploitation du microscope et réglez la température d’incubation sur 28,5 degrés Celsius. Pendant que la température est nécessaire pendant une heure, préparez l’échantillon. Commencez par préparer l’agarose.

Faites fondre une aliquote préparée d’un millilitre d’agarose à bas point de fusion à 1 % dans un milieu E trois à 70 degrés Celsius. Après environ 15 minutes, transférez 600 microlitres d’agarose fondu dans un tube frais de 1,5 millilitre et ajoutez 250 microlitres de milieu E3, 50 microlitres de 0,4 % MS 222 et 25 microlitres de solution de bouillon de billes fluorescentes vortex. Placez le tube dans un bloc chauffant à environ 39 degrés Celsius pour laisser l’agarose s’approcher de son point de gélification.

Ensuite, poussez les pistons à pointe en téflon jusqu’au fond de capillaires en verre d’un millimètre de diamètre intérieur. Préparez-en cinq. Maintenant, vortex brièvement le mélange d’agarose, puis transférez cinq embryons avec la quantité minimale de liquide à l’intérieur.

Ensuite, insérez un capillaire et aspirez un embryon la tête la première. La tête doit entrer avant la queue et il ne peut pas y avoir de bulles d’air. Prélevez suffisamment de solution pour qu’il y ait environ deux centimètres d’agarose au-dessus de l’embryon et un centimètre d’agarose en dessous.

Aspirez un embryon dans chaque capillaire avant de continuer. Cette étape nécessite un peu de pratique pour être maîtrisée. Préparez-vous à cela en utilisant des embryons sans valeur.

Lorsque l’agarose se solidifie complètement, stockez les échantillons dans un milieu E trois en soumettant les capillaires à une paroi de bécher avec de la pâte à modeler avec l’ouverture inférieure en solution. Assemblez maintenant le porte-échantillon. Tout d’abord, insérez deux manchons en plastique de la bonne taille l’un contre l’autre dans la tige.

Les fentes sur les manches doivent être tournées vers l’extérieur. Ensuite, fixez une vis de serrage. Et insérez le capillaire à travers le support jusqu’à ce que la bande de couleur noire devienne visible de l’autre côté.

Évitez de toucher le piston. Serrez ensuite la vis de serrage. Ensuite, poussez un centimètre d’agarose hors du capillaire et coupez-le.

Insérez ensuite la tige dans le disque du porte-échantillon. Avant de charger le disque d’échantillonnage, vérifiez que la platine est dans la position la plus haute dans le logiciel de contrôle. Ensuite, à l’aide de rails de guidage, faites glisser le support et l’échantillon dans le microscope.

Maintenant, imagez l’échantillon choisi comme décrit dans le protocole texte. Le traitement des données est effectué dans Figi. Il s’agit d’une distribution de ImageJ.

Avant de commencer, Figi doit être mis à jour. Enregistrez l’ensemble des données d’image acquises dans un seul dossier. Les fichiers intermédiaires du traitement d’image seront enregistrés dans le même dossier.

Maintenant, démarrez l’application de reconstruction multi-vues. Ensuite, définissez un nouvel ensemble de données. Sélectionnez l’option Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats et créez un nom pour le fichier de données de sortie.

Sélectionnez ensuite le premier fichier CZI de l’ensemble de données. Les métadonnées seront chargées automatiquement. Dans les métadonnées de l’image, vérifiez que le nombre d’angles, les canaux, les éclairages et la taille du voxel sont tous correctement réglés.

En appuyant sur OK, une fenêtre de journal, une fenêtre de l’explorateur de configuration de la vue et une fenêtre de console s’ouvrent. L’explorateur de configuration de la vue fournit une interface conviviale. Sélectionnez les fichiers à traiter et appuyez sur le bouton droit de la souris.

Une nouvelle fenêtre s’ouvrira montrant les différentes étapes de traitement au fur et à mesure de leur exécution. Dans le coin supérieur droit se trouvent les boutons d’information et d’enregistrement. Info affiche un résumé du contenu du fichier de données enregistré et appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les résultats du traitement.

Sinon, le programme n’enregistre pas les résultats des étapes de traitement. Pour réenregistrer l’ensemble des données, sélectionnez d’abord tous les fichiers en appuyant sur Ctrl+A et en utilisant un clic droit. Sélectionnez ensuite Réenregistrer le jeu de données et En tant que HDF5.

Une confirmation de l’action de réenregistrement doit alors être cochée. Après quelques minutes, pour chaque point temporel, le programme indiquera quand la résauvegarde est terminée. Ensuite, procédez à la détection des points d’intérêt dans les données.

Sélectionnez tous les points temporels en appuyant sur Ctrl+A et cliquez avec le bouton droit de la souris. Pour sélectionner, détectez les points d’intérêt. Dans les options, sélectionnez Différence-de-gaussienne.

Et sélectionnez, descendez des échantillons d’images avant la segmentation. Dans la fenêtre suivante, choisissez les paramètres de détection. Dans les options de localisation des sous-pixels, sélectionnez Ajustement quadratique en 3 dimensions.

Ensuite, dans la spécification du point d’intérêt, sélectionnez interactif. Pour l’option XY de l’échantillon descendant, sélectionnez Correspondance de la résolution Z. Et pour l’échantillon descendant Z, sélectionnez 1x.

Ensuite, exécutez l’opération en sélectionnant l’option Calcul sur CPU Java. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez une vue pour tester les paramètres. Une fois la vue chargée, ajustez la luminosité et le contraste en appuyant sur Ctrl+Maj+C sur le clavier.

De plus, pour la détection des billes, activez l’option de recherche de vert maxima. Observez maintenant la segmentation sous forme d’anneaux verts autour des détections. Ajustez les valeurs de différence de gaussienne pour les paramètres sigma un et threshold afin de segmenter de manière optimale les billes avec le nombre minimal de faux positifs.

Chaque cordon ne doit être détecté qu’une seule fois. Après avoir déterminé les paramètres optimaux, appuyez sur OK. Une fois que l’ordinateur a chargé chaque vue individuelle du point temporel et segmenté les perles, le programme génère un fichier journal avec le nombre de perles détectées par vue.

Il devrait y avoir entre 600 et plusieurs milliers de perles par vue. Sinon, les paramètres de détection doivent être peaufinés. Il s’agit d’un processus délicat.

La pyramide de détection est rarement précise du premier coup et les réinitialisations peuvent varier entre les points temporels d’un film. Détendre le frais détectera toutes les vraies perles et permettra plus de faux positifs peut aider. Si aucune combinaison de la pyramide ne fonctionne, un nouvel ensemble de données utilisant différentes billes fluorescentes doit être acquis.

Procédez maintenant à l’enregistrement des détections et à la réalisation d’une déconvolution multi-vues à partir de la pile. LSFM est une méthode idéale pour imager les processus de développement à plusieurs échelles, des structures intercellulaires aux cellules et aux tissus entiers pendant de longues périodes. Des événements intercellulaires très rapides peuvent être capturés à haute résolution, tels que la croissance de microtubules dans les cellules neuroprogénitrices.

À partir d’un film d’une seule vision, la quantification de la croissance des microtubules est possible. Les structures intracellulaires peuvent être suivies pendant de nombreuses heures, comme le centrosome dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Le comportement d’une seule cellule peut être extrait d’images de tissus entiers, telles que la translocation d’une cellule ganglionnaire à travers la rétine.

La déconvolution multi-vues crée une pile Z isotrope en combinant plusieurs vues différentes à l’aide de la fonction d’étalement de points. Cela permet d’obtenir des images considérablement améliorées par rapport aux vues uniques ou aux fusions moyennes pondérées. Par exemple, la transformation de la vésicule optique en une cupule optique peut être étudiée à partir de coupes optiques dans différentes orientations grâce à l’ensemble de données présenté.

De plus, la bonne qualité globale de l’image, même au plus profond de l’embryon, est apparente. Comme lors de l’observation de la morphogenèse de la cupule optique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de monter une image d’embryons de poisson-zèbre dans un microscope à feuillet de lumière.

Et comment traiter des ensembles de données multi-vues dans Figi. Une fois maîtrisé, il faudra environ deux heures pour démarrer une expérience en accéléré sur un microscope à feuillet de lumière. L’analyse ultérieure des données prendra beaucoup plus de temps.

Il peut être avantageux d’utiliser un cluster d’ordinateurs pour cette tâche. Vous trouverez d’autres conseils pratiques, des conseils de dépannage et des liens vers d’autres ressources dans le protocole texte. Il doit y avoir une capacité de stockage suffisante et un plan de traitement des données clair disponible avant l’expérience.

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