Name: Développement dun In vitro Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Découvrez un essai de contraction de gel pour évaluer la contractilité des cellules mésenchymateuses après transition épithélio-mésenchymateuse induite par cytokines inflammatoires. Cette méthode simple ne nécessite pas d'équipement spécialisé.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr Tadashi Koyama pour son aide technique. Ce travail a été soutenu en partie par JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172 ; une subvention au Groupe de recherche sur l’insuffisance respiratoire du Ministère de la santé, du travail et des affaires sociales du Japon ; une bourse pour la recherche sur les maladies allergiques et l’immunologie, Japon.

1. Préparations et culture de cellules épithéliales du poumon <ol><li> les cellules épithéliales de poumon humain de la culture A549 (lignée de cellules adhérentes) dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 100 UI / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Retirer et jeter les milieux de culture cellulaire à partir de la boîte de culture, et laver une fois avec 5 - 10 ml de tampon phosphate salin (PBS). Après le lavage, aspirer immédiatement le PBS. </li><li> Ajouter 2 ml de Trypsine / acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,05%) et on incube à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 3 minutes. </li><li> Recueillir les cellules isolées dans des tubes à centrifuger contenant du milieu de culture cellulaire, centrifuger les tubes à température ambiante pendant 4 min à 150 x g. </li><li> Remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de milieu de culture cellulaire et de prélever un échantillon pour le comptage des cellules. Comptez le nombre de cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre avec Trypan bleuissement pour vérifier la viabilité des cellules. </li><li> cellules Seed A549 sur10 cm de plaques de polystyrène à une densité de 0,5 - 1,0 x 10 6 cellules / boîte de 10 ml de milieu pour le dosage de gel de contraction. Ensemencer les cellules sur 6 plaques et polystyrène à une densité de 0,5 - 1,0 x 10 5 cellules / puits avec 2 ml de milieu pour la confirmation EMT. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 heures. </li></ol> 2. EMT Procédure <ol><li> Ajouter 10 pi de TGF-β1 (5 pg / ml) et 10 ul de TNF-α (10 pg / ml) à la plaque pour essai de contraction du gel ensemencé à l&#39;étape 1.6. Ajouter 2 ul de TGF-β1 (5 pg / ml) et 2 ul de TNF-α (10 pg / ml) à la plaque de confirmation EMT tête de série à l&#39;étape 1.6. Incuber à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 48 heures. </li></ol> 3. Confirmation de procédure EMT par PCR et Western blot <ol><li> Confirmer changement de morphologie (de galets en pierre ressemblant à la broche de forme) des cellules traitées à l&#39;aide de la microscopie à contraste de phase. Note: NormDes cellules A549 al ont une apparence en forme analogue à la pierre et de galets triangulaire qui est une caractéristique des cellules epitheliales, mais après stimulation par TGF-β1 et le TNF-α, les cellules apparaissent en forme de broche long et qui est similaire à des cellules mésenchymateuses 14,15. </li><li> Évaluer l&#39;expression d&#39;un marqueur épithélial, comme E-cadhérine, et des marqueurs mésenchymateuses tels que la N-cadhérine, vimentine, et α-actine musculaire lisse par PCR ou Western blot. <ol><li> Extraire l&#39; ARN total à partir des cellules en utilisant le kit d&#39;extraction d&#39;ARN 16 et à synthétiser l&#39; ADNc en utilisant la transcriptase inverse 17 selon le protocole du fabricant. </li><li> Mesurer l&#39; expression de niveaux d&#39; ARNm en utilisant le système PCR en temps réel 18 et le kit de monomère colorant cyanine PCR selon les instructions du fabricant. Les amorces spécifiques de la GAPDH (de glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), ACTA2 (alpha-actine-2), CDH1 (Cadherine 1, E-cadhérine) et VIM (vimentine) sont présentés dans le tableau 1 </strong&gt;. </li><li> Lyser les cellules en utilisant un tampon de lyse (tableau 2) Solution contenant un inhibiteur de protease à 1% cocktail. Mesurer toutes les concentrations en protéines de l&#39; échantillon en utilisant un kit de dosage de protéine 19,20 et appliquer les mêmes quantités de protéine à un gel de polyacrylamide. <ol><li> Effectuer SDS électrophorèse sur gel et le transfert semi-sec des protéines de membrane de PVDF 21. Incuber la membrane avec des anticorps primaires dans un tampon de blocage pour 1 - 2 h. Après incubation, laver deux fois la membrane avec du tampon de lavage et on incube la membrane 1 heure avec les anticorps secondaires. Note: Voir le tableau Matériaux / Équipement pour les anticorps et les dilutions utilisées dans ces études. Voir le tableau 2 pour les composants du tampon de blocage. </li><li> Laver deux fois la membrane avec un tampon de lavage. Prenez des photos de la membrane avec le kit de détection Western blot 22 en utilisant une caméra CCD 11,23 froid. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Gel Contraction Assay pour EMT Évaluation <ol><li> Aspirer le milieu conditionné à partir du récipient de culture cellulaire, et lavez bien avec 5 - 10 ml de PBS pour éliminer les cellules mortes. Après le lavage, aspirer immédiatement le PBS. </li><li> Ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% / EDTA et on incube à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 3 minutes. </li><li> Recueillir les cellules isolées dans des tubes de centrifugation contenant du DMEM supplémenté avec un inhibiteur de la trypsine (1 mg / ml), on centrifuge les tubes à température ambiante pendant 4 min à 150 x g. </li><li> Mélanger un gel de type 1 de collagène avec de l&#39;eau distillée, et 4 x DMEM concentré pour ajuster le volume pour obtenir une concentration en collagène de 1,75 mg / ml et 1 × concentration DMEM. Assurez-vous de maintenir le milieu de gel sur la glace lors de cette étape. Remarque: Pour faire 6 ml de milieu de gel, bien mélanger 3,5 ml de type 1 gel de collagène (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentré et 1 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS et prélever un échantillon pour le comptage des cellules. Compterle nombre des cellules en utilisant un hémocytomètre avec coloration au bleu Trypan pour vérifier la viabilité des cellules. </li><li> Ajouter le support de gel pour ajuster les volumes pour atteindre une densité cellulaire de 3,0 x 10 5 cellules / puits (6,0 x 10 5 cellules / ml) et doucement mais rapidement le mélanger par pipetage sans gélification. </li><li> Distribuer 0,5 ml du mélange dans chaque puits d&#39;une plaque non-traitée 24 puits rapidement et soigneusement faire sous forme cylindrique soignée. Faites attention à ne pas laisser les bulles d&#39;air de contaminer les gels (figure 1A). Remarque: Le milieu de gel contenant les cellules est visqueux et peut facilement se gélifier et la forme sous forme de croissant dans le puits. </li><li> Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur de cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d&#39; humidité à gélifier complètement. </li><li> Détachez gels de la plaque sans casser en déplaçant une spatule stérilisée de manière à dessiner une circonférence dans une direction. À l&#39;aide d&#39;une spatule, le transfert en douceur des gels à 60 mm des boîtes de culture tissulairecontenant 5 ml de DMEM / FBS à 1%, avec ou sans TGF-β1 (5 ng / ml) et de TNF-α (10 ng / ml). </li><li> Secouer doucement les plats pour assurer gels sont flottantes sur le support. Incuber dans un incubateur de cellules à 37 ° C, 5% de CO2 et 95% d&#39; humidité. </li></ol> 5. Mesure de Gel Taille <ol><li> Mesurer la taille d&#39;un gel de collagène après 0, 24, 48 et 72 heures en utilisant un système d&#39;analyse d&#39;image. <ol><li> Allumez le système de documentation de gel (figure 2A), et de mettre la vaisselle dans l&#39;armoire de protection contre la lumière. Ensuite, enlever le couvercle de la vaisselle dans l&#39;armoire. </li><li> Ouvrir le logiciel d&#39;analyse d&#39;un gel associé. Cliquez sur le bouton &quot;d&#39;acquisition d&#39;image&quot; dans la barre de menu pour afficher l&#39;image des gels dans l&#39;armoire. Ensuite, cliquez sur «acquérir» dans la barre de menu pour prendre des photos des gels (figure 2B). </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;de détection&quot; dans la barre de menu (figure 2C) et ajuster la zone de mesure (jaune cercle in La figure 2C) en faisant glisser la souris. Ensuite, cliquez sur le bouton &quot;auto-détection&quot; dans la barre de menu (voir bouton dans la figure 2D). Le logiciel détecte automatiquement les gels montrant une heatmap (figure 2D). </li><li> Cliquez sur &quot;OK&quot; pour extraire le contour des gels de traitement d&#39;image et de calculer des zones entourées par le contour (figure 2E). Après la zone est calculée, la surface calculée est affichée dans la fenêtre pop-up séparée. Remarque: Si les gels se chevauchent les uns les autres lors de l&#39;imagerie, déplacer des gels doucement à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Le protocole mis au point dans la présente étude comprend deux étapes. La première étape est réalisée pour induire EMT, tandis que la deuxième étape est l&#39;essai de contraction du gel. Comme il est important de confirmer que les cellules ont subi EMT, l&#39;étape 2 fournit un excellent complément aux changements d&#39;expression morphologiques et génétiques. Des études antérieures ont montré que des cellules EMT A549 a été induite par le TGF-β1 seulement 24; Cependant, comme nous l&#39; avons signalé précé...

La fibrose est impliquée dans la pathogenèse de diverses maladies chroniques évolutives telles que la maladie pulmonaire interstitielle, la fibrose cardiaque, la cirrhose du foie, une insuffisance rénale terminale, la sclérose systémique, la maladie auto - immune et 1. Parmi les maladies pulmonaires interstitielles, fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) est une maladie chronique progressive et montre un mauvais pronostic. caractéristique pathologique du IPF est le développement de foyers fibroblastique constitué par les fibroblastes et les myofibroblastes activés qui sont associées au pronostic. Les origines de ces fibroblastes pulmonaires sont proposés pour être dérivé de plusieurs cellules mésenchymateuses, y compris les fibroblastes pulmonaires résidents à l&#39;origine et en circulation fibrocytes depuis la moelle osseuse. Récemment, la transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM) a été proposé d&#39;associer à la formation de cellules mésenchymateuses 2, et de contribuer à la pathogenèse des troubles fibrotiques. On pense que la surveillance électroniqueT joue un rôle important dans le processus de développement du foetus, la cicatrisation des plaies et la progression du cancer, y compris l&#39; invasion tumorale et les métastases 3. En suivant le procédé de l&#39; EMT, les cellules épithéliales obtenir la capacité des cellules mésenchymateuses par la perte de marqueurs épithéliaux, tels que la E-cadhérine, et par l&#39; expression de marqueurs de mésenchymateuses, comme la vimentine, et α-actine du muscle lisse (SMA) 4,5. Des études antérieures ont montré des preuves de ce processus EMT a été associé au développement de la fibrose tissulaire au niveau du rein et du poumon 6 7. En outre, l&#39; inflammation chronique favorise les maladies fibrotiques 8; En outre, de telles cytokines pro - inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale membre de la superfamille 14 (TNFSF14, la lumière), le facteur de nécrose tumorale (TNF) -α, l&#39; interleukine-1β et, il a été démontré pour améliorer EMT 12/09. test de la contraction du gel de collagène, une contraction de la cellule test à base de collagène dans lequel les fibroblastes sont noyés dans le type Igel de collagène dans les trois dimensions, est un idéal modèle in vitro pour l&#39;évaluation de la contractilité. Contractilité est l&#39; une des fonctions caractéristiques des fibroblastes et contribue à la réparation de plaies et de la fibrose 13 normale. Dans cet essai, on pense que la fixation des fibroblastes du collagène de type I par des mécanismes de intégrine-dépendant est censé produire une tension mécanique dans certaines conditions, et par conséquent, conduire à une contraction des tissus. Ici, la mise au point du test de contraction du gel est signalé à être adapté pour évaluer l&#39;acquisition de la fonction contractile dans les cellules qui ont subi EMT. Ce rapport démontre que cet essai modifié est adapté pour évaluer la contractilité dans les cellules mésenchymateuses qui ont subi EMT.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>Pour A549 moyen</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance transformant-&beta ; 1, Humain, recombinant</td><td>Wako Produits chimiques de laboratoire</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha humain recombinant ;</td><td>R& D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadhérine (24E10) Technologie</td><td>de signalisation cellulaire</td> Rabbit mAb<td>#3195</td><td>Dilution 1:3 000</td></tr><tr><td>Vimentine (D21H3) Technologie</td><td>de signalisation cellulaire</td> Rabbit mAb<td>#5741</td><td>Dilution 1:3 000</td></tr><tr><td>Anti-&alpha ;-Tubuline</td><td>anticorps sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>dilution 1:10 000</td></tr><tr><td>Anti-actine monoclonale, &alpha ;-Anticorps musculaire lisse& nbsp ;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>dilution 1:10 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-N-cadhérine</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>IgG anti-souris, HRP-Linked Whole Ab Sheep (anticorps secondaire)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>dilution 1:20 000</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, HRP Linked Whole Ab Donkey (anticorps secondaire)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20 000 dilution</td></tr><tr><td>Réactif bloquant</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2 % dans TBS-T</td></tr><tr><td>6 puits Transparent Fond plat TC-Treated TC-Cell Culture Plate Plate Plaque de culture cellulaire, avec couvercle</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de culture cellulaire</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>technologies de vie</td><td>en poudre 12100-046</td><td>Pour 4&times ; DMEM</td></tr><tr><td>Gel de collagène de type 1</td><td>Gélatine Nitta</td><td>Cellmatrix type I-A</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 24 puits</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Système de documentation sur gel&nbsp ;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Imageur gel</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de gel</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver. 3.00</td><td>logiciel d’analyse fourni avec AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05</td> %), <td>technologies de vie</td> du rouge de phénol <td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24 plaques de puits, non traitées</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4</td> % <td>technologies de vie</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ARN</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase inverse</td><td>life technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Système de PCR en temps réel</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green Kit PCR</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Membrane</td> <td>PVDFATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA</td><td></td></tr><tr><td>Gel de polyacrylamide</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de détection Western blot</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD froide</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyéthylène (20)Monolaurate de sorbitan</td><td>Wako Produits chimiques de laboratoire</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyéthylène (9) octyiphényléther</td><td>Wako Produits chimiques de laboratoire</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

développement d&#39;un<em&gt; in vitro</em&gt; essai pour évaluer contractile fonction mésenchymateuses les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse a subi

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

La fibrose est souvent impliquée dans la pathogenèse de diverses maladies chroniques progressives telles que la bronchopneumopathie interstitielle. La caractéristique pathologique est la formation de foyers fibroblastiques, qui est associée à la gravité de la maladie. Il est proposé que les cellules mésenchymateuses constituées des foyers fibroblastiques proviennent de plusieurs sources cellulaires, y compris des fibroblastes intrapulmonaires résidents à l’origine et des fibrocytes circulants de la moelle osseuse. Récemment, les cellules mésenchymateuses qui ont subi une transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) ont également été supposées contribuer à la pathogenèse de la fibrose. De plus, l’EMT peut être induite par la transformation du facteur de croissance β, et l’EMT peut être renforcée par des cytokines pro-inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale α. Le test de contraction du gel est un modèle in vitro idéal pour l’évaluation de la contractilité, qui est l’une des fonctions caractéristiques des fibroblastes et contribue à la réparation des plaies et à la fibrose. Ici, la mise au point d’un test de contraction du gel est démontrée pour évaluer la capacité contractile des cellules mésenchymateuses qui ont subi une EMT.

Au cours de l&#39; EMT, les cellules épithéliales perdent marqueurs épithéliaux, tels que la E-cadhérine et le gain de l&#39;expression des marqueurs de mésenchymateuses, comme la vimentine et α-actine du muscle lisse 4,5. L&#39;incubation des cellules épithéliales du poumon A549 humain avec du TGF-β1 et de TNF-α induit EMT. L&#39;apparition de cellules A549 normales sont en pierre de galets comme la forme et la forme de triangle qui est une caractéristique des cellules épithé...

Ici, nous décrivons le développement et l’application d’un test de contraction de gel pour évaluer la fonction contractile dans les cellules mésenchymateuses qui ont subi une transition épithéliale-mésenchymateuse.

Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la contractilité des cellules mésenchymateuses qui ont subi in vitro une transition mésenchymateuse épithéliale induite par des cytokines, ou EMT. Ce mésenchyme est une variation de la fonction cellulaire de base après l’EMT induite par des réponses immunitaires inflammatoires telles que lors d’une fibrose pulmonaire idiopathique ou d’un remodelage des voies respiratoires dans l’asthme sévère. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle ne nécessite pas d’appareils spécifiques et qu’elle présente un contenu élevé.Commencez par laver une culture de cellules épithéliales pulmonaires humaines A-549 avec cinq à dix millilitres de PBS. Ensuite, détachez les cellules adhérentes avec deux millilitres de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après trois minutes, transférez la suspension cellulaire dans des tubes coniques contenant du milieu de culture cellulaire et faites tourner les cellules dans une centrifugeuse.Remettre les granulés en suspension dans deux millilitres de milieu de culture cellulaire, en réservant un petit éloquate pour le comptage. Ensuite, ensemencez 0,5 à 1 fois 10 à la 6ème cellule dans dix millilitres de milieu par boîte de polystyrène de dix centimètres et incubez les cultures cellulaires pendant 24 heures. Pour l’induction de l’EMT, le lendemain, traitez les cellules avec 10 microlitres de TGF bêta 1 et de TNF alpha, et retournez les plaques dans l’incubateur pendant 48 heures supplémentaires.Le quatrième jour, lavez les cultures induites par l’emt avec cinq à dix millilitres de pbs, puis détachez les cellules avec de la trypsine-EDTA comme nous venons de le démontrer. Ensuite, faites tourner les suspensions cellulaires dans du DMEM complété par un inhibiteur de la tryspsine et remettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de pbs. Ensuite, comptez les cellules et ajoutez un milieu de gel fraîchement préparé à une densité de 3 fois 10 à la 5ème cellule par puits, en mélangeant doucement mais rapidement la solution à l’aide d’une pipette avant la gélification.Rapidement, mais soigneusement, versez 0,5 millilitre de cellules dans chaque puits d’une plaque non traitée à 24 puits sous forme cylindrique soignée. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 15 minutes. Lorsque le gel s’est complètement solidifié, déplacez une spatule stérilisée en cercle autour de l’extérieur de chaque gel dans une direction, pour détacher les gels des plaques sans les casser.Lorsque vous retirez le gel, veillez à ne pas déplacer la spatule d’avant en arrière dans le puits. Ensuite, à l’aide de la spatule, transférez doucement les gels dans des boîtes de culture tissulaire individuelles de 16 millimètres contenant cinq millilitres de DMEM complétés par un pour cent de FBS, avec ou sans TGF bêta 1 et TNF alpha. Enfin, secouez doucement les plats pour vous assurer que les gels flottent sur le milieu et remettez les gels dans l’incubateur de culture cellulaire.Les cellules a541 non traitées présentent un aspect en forme de pavé et de triangle, caractéristique des cellules épithéliales. Cependant, après leur stimulation avec le TGF bêta-1 et le TNF alpha, les cellules présentent une forme de long fuseau, similaire à celle observée pour les cellules mésynchémales. QRTCPR de l’expression des marqueurs épithéliales et mésynchémaux avant et après l’EMT révèle que les cellules A541 traitées avec des cytokines inflammatoires pendant 48 heures présentent une expression significativement réduite de CDH1 et des expressions significativement augmentées de VIAM et ACTA2.De plus, la stimulation avec ces cytokines atténue l’expression de la E-cadhérine telle que déterminée par l’analyse sanguine occidentale, tandis que les expressions de la vimentine, de la N-cadhérine et de l’actine du muscle lisse alpha sont induites. Dans un test de contraction sur gel, après 48 heures, les gels contenant des cellules traitées au TGF bêta 1 et au TNF alpha sont plus petits que les gels contrôlés contenant des cellules traitées au PBS. En effet, après 72 heures, la taille des gels contenant les gels traités aux cytokines est considérablement réduite, par rapport aux gels contrôlés tels que mesurés par un analyseur de gel.Comme observé, les étapes de contraction du gel peuvent être complétées en trois heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer que l’EMT a été induit avec succès avant d’effectuer le test de contraction du gel. Après observation, cette technique permet de faire varier le processus EMT pendant un état inflammatoire tel que la fibrose ou le remodelage pulmonaire.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’émettre des cellules qui ont EMT, dans une sorte de cuagenter et de les faire mousser dans un milieu.

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous décrivons l'utilisation d'un test sur des cellules de souris ES base pour identifier les fenêtres de temps critique pour Wnt / β-caténine et l'activation du signal BMP lors de l'induction cardiogénique. La méthode fournit une plate-forme standardisée qui quantifie l'efficacité fiable cardiogénique, et elle est applicable à l'étude de lignées cellulaires d'autres.

Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;induction cardiogénique

Le mésenchyme crânienne subit des mouvements morphogénétiques dramatiques qui fournit sans doute une force motrice pour l'élévation des plis...

Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

Une méthode simple est décrit pour l'induction de la transition épithélio mésenchymateuse (EMT) dans une variété de types de cellules. Méthodes d'analyse de cellules dans les Etats EMT par immunocytochimie sont inclus.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Il a été démontré que la régulation de l’épissage alternatif  contribue à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un programme cellulaire essentiel dans divers processus physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant un modèle EMT inductible pour la détection d’épissages alternatifs pendant l’EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Ici, nous décrivons des méthodes pour isoler des cellules épicardiques primaires de souris par un test de culture d’excroissance et évaluer la migration fonctionnelle des cellules dérivées d’épicardiens (EPDC) à l’aide d’un système de culture cardiaque ex vivo. Ces protocoles sont adaptés à l’identification des modulateurs génétiques et chimiques de la transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) épicardique et de la motilité.

Épicardique Excroissance Culture Assay et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Évaluation des épicardique dérivés Migration cellulaire

La transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) permet aux cancers de devenir invasifs. Pour étudier l’EMT, un modèle in vitro basé sur des cellules souches neurales (NSC) dépourvu de sérum et d’enzymes est décrit. Ce système standardisé permet une évaluation quantitative et qualitative de la migration cellulaire, de l’expression des gènes et des protéines. Le modèle est adapté à la découverte de médicaments.

Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Nous présentons un assay de traction de haut débit fabriqué avec le caoutchouc de silicone (PDMS). Ce nouvel exemple est approprié pour étudier les changements physiques dans la contractilité cellulaire au cours de divers processus et maladies biologiques et biomédicaux. Nous démontrons l'utilité de cette méthode en mesurant une augmentation dépendante de TGF-MD de contractilité pendant la transition épithélial-à-mesenchymal.

La microscopie de la force de traction à haut débit à l'aide du SMD révèle les effets dépendants de la dose de la transformation du facteur de croissance sur la transition épithéliale à mesenchymale

Nous décrivons un workflow systématique pour étudier la signalisation de TGF-β et l'EMT TGF-β-induit en étudiant la protéine et l'expression de gène impliquées dans cette voie de signalisation. Les méthodes incluent le blotting occidental, un essai de journaliste de luciferase, qPCR, et la coloration d'immunofluorescence.

Étude de la signalisation TGF-β et de la transition épithéliale à mésenchymale induite par le TGF-β dans le cancer du sein et les cellules normales

Nous décrivons des méthodes pour étudier l’EndMT induite par le TGF-β2 dans les cellules endothéliales en observant les changements de morphologie cellulaire et en examinant les changements de marqueur liés à l’endMT d’expression à l’aide de la coloration par immunofluorescence. L’édition du gène CRISPR/Cas9 a été décrite et utilisée pour épuiser le gène codant pour l’escargot afin d’étudier son rôle dans l’EndMT induite par le TGF-β2.

Transition endothéliale à mésenchymateuse médiée par TGF-β (EndMT) et évaluation fonctionnelle des effecteurs EndMT à l’aide de l’édition du gène CRISPR/Cas9

Ce travail présente un protocole flexible pour l’utilisation de la technologie FLECS (élastomère contractable surfaces élastomères marquées par fluorescence) au format micropuit pour une quantification simplifiée et sans intervention des forces contractiles unicellulaires basées sur des déplacements visualisés de micromotifs de protéines fluorescentes.

Analyse simplifiée et à haut débit de la contractilité unicellulaire à l’aide d’élastomères à micromotifs

Ce protocole fournit des méthodes pour générer des tissus cardiaques et musculaires squelettiques modifiés en 3D et décrit leur utilisation dans les modalités de dépistage préclinique des médicaments. Les méthodes décrites utilisent un système de détection magnétique pour faciliter l’évaluation simultanée de 24 tissus en parallèle.

Tests précliniques de médicaments dans des tissus musculaires 3D évolutifs

Découvrez un essai de contraction de gel pour évaluer la contractilité des cellules mésenchymateuses après transition épithélio-mésenchymateuse induite par cytokines inflammatoires. Cette méthode simple ne nécessite pas d'équipement spécialisé.

Développement dun In vitro Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi (Vidéo) | JoVE Journal

Développement d'un

Explorer plus de vidéos