Développement d'un In vitro Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la contractilité des cellules mésenchymateuses qui ont subi in vitro une transition mésenchymateuse épithéliale induite par des cytokines, ou EMT. Ce mésenchyme est une variation de la fonction cellulaire de base après l’EMT induite par des réponses immunitaires inflammatoires telles que lors d’une fibrose pulmonaire idiopathique ou d’un remodelage des voies respiratoires dans l’asthme sévère. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle ne nécessite pas d’appareils spécifiques et qu’elle présente un contenu élevé.

Commencez par laver une culture de cellules épithéliales pulmonaires humaines A-549 avec cinq à dix millilitres de PBS. Ensuite, détachez les cellules adhérentes avec deux millilitres de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Après trois minutes, transférez la suspension cellulaire dans des tubes coniques contenant du milieu de culture cellulaire et faites tourner les cellules dans une centrifugeuse.

Remettre les granulés en suspension dans deux millilitres de milieu de culture cellulaire, en réservant un petit éloquate pour le comptage. Ensuite, ensemencez 0,5 à 1 fois 10 à la 6ème cellule dans dix millilitres de milieu par boîte de polystyrène de dix centimètres et incubez les cultures cellulaires pendant 24 heures. Pour l’induction de l’EMT, le lendemain, traitez les cellules avec 10 microlitres de TGF bêta 1 et de TNF alpha, et retournez les plaques dans l’incubateur pendant 48 heures supplémentaires.

Le quatrième jour, lavez les cultures induites par l’emt avec cinq à dix millilitres de pbs, puis détachez les cellules avec de la trypsine-EDTA comme nous venons de le démontrer. Ensuite, faites tourner les suspensions cellulaires dans du DMEM complété par un inhibiteur de la tryspsine et remettez les granulés en suspension dans 500 microlitres de pbs. Ensuite, comptez les cellules et ajoutez un milieu de gel fraîchement préparé à une densité de 3 fois 10 à la 5ème cellule par puits, en mélangeant doucement mais rapidement la solution à l’aide d’une pipette avant la gélification.

Rapidement, mais soigneusement, versez 0,5 millilitre de cellules dans chaque puits d’une plaque non traitée à 24 puits sous forme cylindrique soignée. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 15 minutes. Lorsque le gel s’est complètement solidifié, déplacez une spatule stérilisée en cercle autour de l’extérieur de chaque gel dans une direction, pour détacher les gels des plaques sans les casser.

Lorsque vous retirez le gel, veillez à ne pas déplacer la spatule d’avant en arrière dans le puits. Ensuite, à l’aide de la spatule, transférez doucement les gels dans des boîtes de culture tissulaire individuelles de 16 millimètres contenant cinq millilitres de DMEM complétés par un pour cent de FBS, avec ou sans TGF bêta 1 et TNF alpha. Enfin, secouez doucement les plats pour vous assurer que les gels flottent sur le milieu et remettez les gels dans l’incubateur de culture cellulaire.

Les cellules a541 non traitées présentent un aspect en forme de pavé et de triangle, caractéristique des cellules épithéliales. Cependant, après leur stimulation avec le TGF bêta-1 et le TNF alpha, les cellules présentent une forme de long fuseau, similaire à celle observée pour les cellules mésynchémales. QRTCPR de l’expression des marqueurs épithéliales et mésynchémaux avant et après l’EMT révèle que les cellules A541 traitées avec des cytokines inflammatoires pendant 48 heures présentent une expression significativement réduite de CDH1 et des expressions significativement augmentées de VIAM et ACTA2.

De plus, la stimulation avec ces cytokines atténue l’expression de la E-cadhérine telle que déterminée par l’analyse sanguine occidentale, tandis que les expressions de la vimentine, de la N-cadhérine et de l’actine du muscle lisse alpha sont induites. Dans un test de contraction sur gel, après 48 heures, les gels contenant des cellules traitées au TGF bêta 1 et au TNF alpha sont plus petits que les gels contrôlés contenant des cellules traitées au PBS. En effet, après 72 heures, la taille des gels contenant les gels traités aux cytokines est considérablement réduite, par rapport aux gels contrôlés tels que mesurés par un analyseur de gel.

Comme observé, les étapes de contraction du gel peuvent être complétées en trois heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer que l’EMT a été induit avec succès avant d’effectuer le test de contraction du gel. Après observation, cette technique permet de faire varier le processus EMT pendant un état inflammatoire tel que la fibrose ou le remodelage pulmonaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’émettre des cellules qui ont EMT, dans une sorte de cuagenter et de les faire mousser dans un milieu.