Application séquentielle de verre Lamelles pour évaluer la compression Rigidité de l'objectif de la souris: Strain et morphométriques Analyses

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la rigidité compressive et la géométrie des lentilles de souris en utilisant une approche simple et peu coûteuse. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine des lentilles. Comme la façon dont différentes perturbations génétiques et expérimentales affectent les propriétés biomécaniques du cristallin.

Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est précise, reproductible et qu’elle ne nécessite pas d’équipement coûteux ou spécialisé. Cette méthode donne un aperçu des propriétés des lentilles de souris, avec une application potentielle à des organismes modèles plus grands tels que les rats et les lapins. La visualisation de la méthode est essentielle car les étapes de dissection du cristallin et d’application de la lamelle sont difficiles à apprendre sans démonstration.

La démonstration de la procédure sera assurée par Catherine Cheng, post-doc de mon laboratoire. Commencez la dissection à l’aide d’une pince incurvée pour enfoncer le tissu autour de l’œil d’une souris euthanasiée, en sortant l’œil de l’orbite. Ensuite, retirez l’œil et placez-le dans une boîte de dissection contenant du PBS frais sous un microscope à dissection.

Coupez le nerf optique aussi près que possible du globe oculaire. Et insérez doucement et soigneusement une pince à épiler fine et droite dans le globe oculaire par le trou où le nerf optique sort de la partie postérieure de l’organe. Faites soigneusement une incision avec des ciseaux de l’arrière vers le bord de la cornée, en prenant soin de ne pas endommager le cristallin.

Poursuivez l’incision le long de la jonction entre la cornée et la sclère, au moins à mi-chemin autour du globe oculaire. Et appuyez doucement sur la cornée pour retirer le cristallin de l’œil par l’ouverture. Ensuite, utilisez une pince droite à pointe fine pour retirer soigneusement tous les gros débris encore attachés à la lentille.

Et confirmez visuellement que l’objectif n’est pas endommagé. Au moins deux heures avant de commencer les mesures de rigidité, utilisez une balance analytique pour peser au moins 10 lamelles de la même boîte. Déterminez le poids moyen des lamelles.

Ensuite, pré-mouillez les lamelles de couverture et un miroir à angle droit dans du PBS à température ambiante. Pendant que les matériaux sont hydratés, remplissez la chambre de mesure avec 65 à 75 millilitres de PBS. Et placez la chambre sous un microscope de dissection réglé sur un grossissement de 30 X, avec un éclairage par le bas et une source de lumière à fibre optique sur les côtés gauche et droit.

Lorsque les lamelles sont prêtes, placez le miroir à angle droit dans la chambre à une distance constante du divot qui sera utilisé pour maintenir l’objectif. Ensuite, à l’aide d’une pince incurvée, transférez soigneusement les lentilles disséquées dans la chambre de mesure. Réglez l’alimentation optique d’alimentation à 80 % de l’intensité lumineuse maximale et ajustez la sortie de l’alimentation en fonction de l’éclairage ambiant, des préférences de l’utilisateur et de la qualité d’image selon vos besoins.

Obtenez des images de la vue de dessus des objectifs déchargés directement au-dessus de la chambre. Ensuite, prenez une photo du bord du miroir mis au point, suivie d’une image latérale de la lentille déchargée à travers le miroir à l’extérieur du divot. Ensuite, placez une lentille dans le divot et confirmez que la lentille est bien en place et droite dans le divot sur son pôle antérieur ou postérieur.

Prenez une photo de l’objectif dans le miroir. Ensuite, placez délicatement une lamelle sur l’objectif. Après deux minutes, prenez une autre image latérale de l’objectif chargé.

Continuez à ajouter des lamelles, en obtenant des images de côté deux minutes après l’ajout de chaque lamelle, jusqu’à ce que le total de 10 lamelles ait été appliqué. Ensuite, retirez toutes les lamelles, attendez deux dernières minutes et obtenez des images latérales de l’objectif à l’intérieur et à l’extérieur du divot. Et une image vue de dessus de l’objectif à l’extérieur du divot.

Pour déterminer la taille du noyau du cristallin, placez une lentille dans une boîte de Pétri propre remplie de PBS et utilisez une pince fine et droite pour décapsuler doucement la lentille. Pour enlever les cellules de la fibre corticale, faites rouler la lentille entre les doigts gantés. Ensuite, rincez doucement le noyau du cristallin dans le PBS et replacez le noyau dans la chambre de mesure.

Acquérez une image du noyau de la lentille à travers le miroir à angle droit. Enfin, pour analyser les images, utilisez le logiciel d’analyse d’images approprié pour mesurer les diamètres équatorial et axial des lentilles avant et après chaque étape de chargement. Mesurez également le diamètre de chaque noyau de lentille.

Dans cette expérience représentative, la rigidité et les dimensions de lentilles de souris âgées de deux, quatre et huit mois ont été mesurées et les déformations axiales et équatoriales ont été calculées. La déformation axiale est une fonction logarithmique de la charge appliquée avec une diminution statistiquement significative, dépendante de l’âge, des déformations axiales et équatoriales sous la charge maximale appliquée, indiquant que la lentille de la souris se raidit avec l’âge. Les données d’image recueillies au cours de cette expérience ont également été utilisées pour déterminer plusieurs autres caractéristiques morphologiques des lentilles.

Comme prévu, les diamètres axial et équatorial, ainsi que le volume de la lentille, ont augmenté avec l’âge. Le rapport hauteur/largeur indique que l’objectif a un diamètre équatorial légèrement supérieur au diamètre axial. Et ce paramètre n’a pas changé avec l’âge.

Le diamètre, le volume et la fraction du noyau du cristallin augmentent avec l’âge, ce qui suggère que le noyau du cristallin se remodèle pour augmenter de taille relative à mesure que le cristallin vieillit. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 45 minutes par objectif, si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de positionner la lentille uniformément à l’intérieur du motte et de permettre à la lentille de se détendre pendant deux minutes entre chaque lamelle supplémentaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la rigidité compressive et la morphométrie des lentilles de souris à l’aide de l’application séquentielle de lamelles. Cette technique précise, simple et peu coûteuse ouvre la voie aux chercheurs sur les lentilles pour explorer les effets biomécaniques des mutations génétiques chez la souris.