Haut Analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (HPHC)

L’objectif global de cette approche, qui combine un analyseur de cellules en temps réel basé sur l’impédance et une plate-forme basée sur le criblage à haut contenu, est de fournir des informations sur les doses efficaces, la toxicité et les effets biologiques, afin d’obtenir le profil de toxicité des composés testés. Cette approche peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la toxicologie. Aborder, par exemple, la cytotoxiticité, la génotoxicité et les réponses cellulaires au stress.

De plus, non seulement il fournit des informations sur plusieurs paramètres biochimiques et morphologiques simultanément, mais il peut également être appliqué à une gamme différente de types de cellules et de modèles de culture cellulaire. En raison de la compétence et de la limitation, l’ensemble de l’approche sera effectué en n’évaluant qu’un court morceau de composé. Pour la même raison, un seul protocole sera présenté pour démontrer l’évaluation préalable à haut contenu.

Stefano Acali et Alexander Laurent, techniciens de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour voir les cellules épithéliales bronchiques humaines normales, ou cellules NHBE, programmez l’instrument pour définir le nombre et la durée des mesures d’impédance. Dans cette étude, les données sont enregistrées toutes les 15 minutes, pendant 48 heures.

Mesurez le fond de la plaque en pipetant 50 microlitres de milieu préchauffé dans chaque puits d’une plaque RTCA de 96 puits. Cette étape représente une exigence technique pour que l’instrument calcule la résistance électrique du milieu à utiliser comme référence de référence pour les calculs basés sur les cellules. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire à une concentration de 144 000 cellules par millilitre au milieu déjà présent dans chaque puits de la plaque RTCA.

Une fois que la cellule a chauffé, il est très important de laisser la plaque à température ambiante pendant 40 minutes pour permettre aux cellules de se fixer et d’obtenir une distribution cellulaire homogène. Incuber les plaques RTCA dans le socle de l’incubateur et commencer à enregistrer les données pendant les 24 prochaines heures, plus ou moins deux heures, avant l’administration. Pour le témoin positif, diluer la solution mère de staurosporine de 10 millimolaires, un à 10, dans du DMSO.

Ajouter cinq microlitres de dilution à 195 microlitres de milieu pour obtenir une solution de travail 5x. Pour les constituants nocifs et potentiellement nocifs, dissolvez chacun d’eux dans le véhicule pour générer une solution mère d’une molaire. Ensuite, diluer chaque solution mère de la substance d’essai, de un à 10, dans un milieu pour obtenir une solution de 100 millimolaires.

Générez la plaque maîtresse composée en ajoutant d’abord le milieu plus 10 % de véhicule dans les puits de B à F, et la solution de 100 millimolaires dans le puits A. Effectuez une dilution en série en cinq étapes, de un à 10, pour obtenir les solutions de travail 5x. Pour le dosage, mettez l’instrument RTCA en pause, ouvrez le socle pour retirer la plaque d’exposition et placez la plaque dans l’outil de température RTCA pour éviter de refroidir les cellules, ce qui pourrait avoir un impact sur la mesure de l’impédance. Ajoutez 25 microlitres de solution 5x de la plaque maîtresse Compound aux cellules en trois exemplaires, en maintenant le même ordre de dosage que dans la plaque maîtresse Compound.

Ne retirez pas le milieu de culture cellulaire existant. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de contrôle positif 5x dans les cellules de la moitié droite de la rangée inférieure, sans retirer le milieu de culture existant. De même, ajoutez 25 microlitres de milieu aux cellules de la moitié gauche de la rangée inférieure.

Après avoir scellé la plaque avec la scelleuse de plaques, replacez la plaque dans le berceau RTCA et verrouillez-la. Redémarrez l’enregistrement des données pour le temps d’exposition souhaité. Après l’enregistrement des données, analyser les données de viabilité cellulaire de l’ATCR afin de déterminer la substance d’essai à utiliser dans l’analyse HCS.

Dans cette expérience, le 1-aminonaphtalène, l’arsenic, le chrome et le crotonaldéhyde sont sélectionnés pour l’analyse HCS. Pour voir les cellules NHBE, ajoutez 100 microlitres d’une suspension cellulaire à 120 000 cellules par millilitre dans chaque puits d’une plaque noire de 96 puits. Après avoir laissé la plaque HCS à température ambiante pendant 30 minutes, pour permettre aux cellules de se fixer aux puits, incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24, plus ou moins deux heures, avant le dosage.

Pour le témoin positif, distribuer 40 microlitres de la solution mère de chaque témoin positif dans la deuxième colonne. Ensuite, distribuez 20 microlitres du véhicule dans les colonnes trois et cinq. Et 40 microlitres du véhicule dans la quatrième colonne.

Retirez 12 microlitres des puits de la deuxième colonne, distribuez-les dans les puits de la troisième colonne et mélangez. Continuer jusqu’à l’obtention d’une dilution finale en série avec trois doses et un véhicule pour chaque composé témoin positif. Pour générer la plaque de contrôle positif, préparer une dilution de un à 40 dans le milieu des trois doses et du véhicule.

Pour fabriquer la plaque maîtresse du composé, remettre en suspension et diluer chaque solution mère de la substance d’essai, de un à 10 po de milieu pour une concentration de 100 millimolaires. Effectuer des dilutions à l’aide d’un milieu contenant 10 % de véhicule afin d’obtenir les doses 5x sélectionnées pour chaque substance d’essai. Les témoins positifs et la plaque composée sont maintenant prêts à être dosés sur la plaque d’exposition.

Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solutions 5x de la plaque maîtresse Compound aux cellules en trois exemplaires, en maintenant le même ordre de dosage que dans la plaque maîtresse Compound. Ne retirez pas le milieu de culture cellulaire existant. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de la solution 5x de la plaque de contrôle positif dans les cellules de la rangée inférieure, en maintenant le même ordre de dosage que dans la plaque de contrôle positif.

Préparez un volume suffisant de la solution de coloration des cellules vivantes comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, diluez à la fois le colorant mitochondrial, et le colorant de perméabilité membranaire dans la solution de coloration des cellules vivantes, selon les instructions du fournisseur. Ajouter 50 microlitres de la solution de coloration de cellules vivantes dans chaque puits de la plaque désignée Cytotoxicity Assay.

Ne retirez pas le milieu de culture cellulaire et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, 5 % CO2. Aspirez doucement le milieu et la solution de coloration et ajoutez 100 microlitres de solution de fixation dans chaque puits. Ensuite, incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante, dans l’obscurité.

Après l’incubation, aspirez doucement la solution de fixation et lavez-la une fois avec 100 microlitres par puits de tampon de lavage. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 100 microlitres par puits de 1x tampon de perméabilisation à chaque puits, avant d’incuber pendant 10 minutes à température ambiante, dans l’obscurité. Aspirez le tampon de perméabilisation et lavez la plaque deux fois avec 100 microlitres, par puits, de tampon de lavage.

Ensuite, aspirez le tampon de lavage et ajoutez 100 microlitres de 1x tampon de blocage dans chaque puits. Ensuite, incubez pendant 15 minutes à température ambiante, dans l’obscurité. Diluer l’anticorps anti-cytochrome C, de un à 250, dans une solution d’anticorps primaires.

Ensuite, aspirez le tampon de blocage et ajoutez 50 microlitres, par puits, de solution d’anticorps primaires dans chaque puits, avant d’incuber pendant 60 minutes à température ambiante, dans l’obscurité. Diluer l’anticorps anti-souris, de un à 500, dans une solution d’anticorps secondaire et nucléaire. De plus, diluez le colorant nucléaire, de un à 1 000, dans une solution d’anticorps secondaire et de nucléaire.

Après avoir aspiré la solution d’anticorps primaires, lavez la plaque trois fois avec 100 microlitres, par puits, de tampon de lavage, à l’aide du laveur de plaques. Aspirez le tampon de lavage et ajoutez 50 microlitres, par puits, d’anticorps secondaires et de solution nucléaire dans chaque puits de la plaque. Maintenant, incubez la plaque pendant 60 minutes à température ambiante, dans l’obscurité.

Après l’aspiration de l’anticorps secondaire et de la solution nucléaire, laver la plaque trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage par puits à l’aide du laveur de plaques. Ensuite, ajoutez 100 microlitres, par puits, de tampon de lavage. La plaque est maintenant prête à être évaluée sur l’instrument HCS et l’acquisition est lancée.

Les résultats représentatifs de la viabilité cellulaire de l’ATR du traitement de la substance d’essai sont présentés. Un effet toxique dose-dépendant est obtenu sur 24 heures d’exposition uniquement avec le 1-aminonaphtalène, l’arsenic, le chrome et le crotonaldéhyde, car ils ont tous présenté une DL50 calculée inférieure à 20 millimolaires. Aucun effet toxique n’a été obtenu avec les autres composés.

Les résultats HCS représentatifs ne sont présentés que pour le traitement par 1-aminonaphtalène. L’effet toxique du 1-aminonaphtalène induit de graves dommages à la membrane cellulaire, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire en fonction de la dose, après quatre heures d’exposition. Le composé affecte également les mitochondries, induisant une augmentation de masse après quatre heures d’exposition, ainsi que la libération du cytochrome C, qui est ensuite détectable dans les noyaux après quatre et 24 heures d’exposition.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en deux à trois jours, car la plupart d’entre elles nécessitent environ une heure par jour de temps pratique pour le réglage et le dosage. Selon le protocole choisi, le criblage à haut contenu nécessite un maximum de trois heures et demie pour l’exécution de l’ensemble de la procédure de coloration. Lorsque vous tentez cette procédure, gardez à l’esprit que même si la sélection d’un plus grand nombre de points de terminaison ajoute de la complexité au flux de travail, elle n’augmentera pas considérablement le temps.

Avec un flux de travail optimal, en effet, plusieurs plaques peuvent être évaluées en parallèle. La poursuite du développement de la plateforme de criblage à haut contenu, y compris le réglage entièrement automatisé des cellules, la dilution des composés, le dosage et la coloration, ainsi que l’ajout de nouveaux critères d’évaluation, élargiront encore la capacité de la plateforme de criblage à haut contenu en tant qu’outil puissant pour le profilage toxicologique. De plus, la combinaison de plusieurs paramètres toxicologiques uniques à un débit aussi élevé nous permettra de faire un pas de plus dans nos efforts visant à réduire les tests chimiques sur les animaux.