Name: Haut Analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (HPHC) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez l'analyse de dépistage à haut contenu pour évaluer la toxicité des composants de la fumée de cigarette sur des cellules épithéliales bronchiques humaines normales. Cette méthode combine l'analyse d'impédance en temps réel et le screening à haut contenu pour déterminer les doses efficaces et les modes d'action.

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Les auteurs tiennent à remercier Karsta Luettich et Grégory Vuillaume pour leur examen du manuscrit.

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</ol>

Tous les auteurs sont des employés de Philip Morris International. Philip Morris International est la seule source de financement et parrain de ce projet.

Les besoins des alternatives à l&#39;expérimentation animale et de nouvelles approches de test à haut débit ont été largement discutés au cours des dernières années. Cela a conduit les scientifiques et les autorités réglementaires pour étudier des méthodes alternatives pour les tests de toxicité standard, en utilisant des dosages cellulaires qui imitent étroitement la physiologie des tissus cibles. Dans cette étude, nous avons démontré l&#39;applicabilité de la combinaison d&#39;un analyseur de cellules en temps réel (RTCA) avec une projection haute teneur (HCS) plate-forme pour évaluer l&#39;impact de l&#39;exposition aux constituants CS simples sur les cellules épithéliales pulmonaires humaines. Cette configuration pourrait être appliquée de façon analogue pour évaluer la cytotoxicité induite par divers autres polluants atmosphériques, les particules en suspension, et des nanoparticules. En outre, les résultats obtenus peuvent être jumelés à ceux de transcriptomique du génome entier et les méthodes de calcul basé sur les réseaux biologiques causales. Comme indiqué précédemment, cette approche nous a permis de corroborer les données sur voie moléculaireperturbation sur CS exposition 5 avec les terminaux HCS, face à ces perturbations de la voie aussi phénotypique. Comme un essai d&#39;organigramme, l&#39; analyse des cellules en temps réel fournit des informations sur la viabilité des cellules dans une résolution de la dose et dépendante du temps, ce qui permet une meilleure prise de décision qui dose et l&#39; exposition point de temps peuvent être favorables pour l&#39; analyse en aval 14. Le principe de l&#39;analyseur de repose sur des variations de l&#39;impédance électrique produite par les cellules où ils se fixent et se propager sur une surface de culture de puits recouvert d&#39;un micro-électrodes en or. L&#39;impédance est convertie en un paramètre sans dimension appelé cellule d&#39;indice, qui peut être utilisé pour contrôler l&#39;adhérence cellulaire, la propagation, la morphologie et la viabilité des cellules en fin de compte. Bien que cette technique ne fournit pas d&#39;informations sur les mécanismes cytotoxiques, sa sensibilité permet de détecter des changements cellulaires morphologiques, même à des doses très faibles au cours de laquelle le HCS est pas informative (données non présentées). Sur la base de précéexpériences UO, nous avons constaté que la méthodologie RTCA est capable de détecter les changements morphologiques à des doses plus faibles par rapport aux points de terminaison HCS. Après la sélection initiale avec la cellule d&#39;analyse en temps réel, une plate-forme de HCS a été utilisé pour gagner plus en profondeur des informations sur le type de cytotoxicité induite par chaque HPHC. Le panneau d&#39;essai HCS permis au profil HPHCs vers leur impact potentiel sur les compartiments cellulaires / organelles, ainsi que pour identifier les personnes suscitant génotoxicité ou stress oxydatif. L&#39;analyse a révélé des profils distincts de sorte que les HPHCs sélectionnés induisent une cytotoxicité dans les cellules NHBE. D&#39;une manière générale, tous les composés, à l&#39;exception Phénol, se sont avérés induire une nécrose aux doses maximales testées. Conformément à un rôle potentiel dans le développement du cancer 1-aminonaphtalène phosphorylation induite de H2AX comme marqueur pour la génotoxicité, mais le panneau de HCS également de l&#39;activité découverte de cette HPHC dans la toxicité mitochondriale lecture (masse accrue et cytochrome C releasoi) et le stress oxydatif (GSH d&#39;épuisement). De même, comme décrit précédemment, le phénol a été identifié pour provoquer un dysfonctionnement mitochondrial, et causer des dommages de l&#39;ADN, ainsi que l&#39;épuisement en GSH. Le chrome (VI), l&#39;un des composés classés comme cancérogènes de groupe I, et crotonaldéhyde ont également été identifiés comme étant à la fois génotoxique, en particulier, le chrome (VI) l&#39;apoptose induite également (activation en cascade de caspase) et crotonaldéhyde provoqué une augmentation de la génération de ROS. Enfin, l&#39;arsenic (V) a été trouvée pour induire la phosphorylation cJun qui est un marqueur d&#39;activation de la voie de la kinase de stress. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules NHBE comme un modèle pour les cellules épithéliales pulmonaires in vitro. L&#39;utilisation de ces cellules dans un cadre de HCS est sans précédent et a permis à l&#39;enquête sur une plus large gamme de terminaux, y compris les marqueurs de génotoxicité et le stress oxydatif. Les deux cellules vivantes et des approches fixes de coloration des cellules ont été décrits au sein de nos protocoles, ce qui démontre la flexibilité de la technique dans son ensemble. En floi, les mêmes protocoles peut être appliquée à un plus large éventail de cibles, qui peut être traitée par l&#39;utilisation d&#39;un colorant ou d&#39;un anticorps fluorescent. Pour la bonne exécution des protocoles de coloration en direct, il est important de respecter le temps d&#39;incubation, comme certains des colorants ont une demi-vie limitée et le signal de fluorescence peut diminuer avant l&#39;acquisition d&#39;image est terminée. Il est également important de considérer que, si un type de cellule différent est utilisé, toutes les conditions de coloration doivent être réévalués, comme la concentration optimale de colorant et le temps d&#39;incubation peuvent être différentes. Dans le présent document, nous avons décrit un scénario où seulement cinq composés où criblées avec la méthodologie de HCS. Compte tenu de la disposition de la plaque décrite précédemment, ils ont reçu une dose de plus de deux différents ensembles de plaques pour un total de 24 plaques (6 essais et 2 points temporels) .Le nombre de plaques pourrait également être augmentée, permettant ainsi la projection simultanée de plusieurs composés ou les investigation de plusieurs noeuds finaux. Avant de le faire, cependant, il faut prendre en considération que certains effets (GSH et ROS) nécessitent l&#39;acquisition immédiate, et en conséquence, le dosage des plaques doit être réalisée de manière décalée pour permettre l&#39;acquisition de la plaque précédente. D&#39;autre part, en utilisant un protocole de coloration cellulaire fixe représente un avantage car les plaques peuvent être empilées, en interrompant le protocole à une étape quelconque après la fixation, pour l&#39;achèvement de la procédure de coloration à un stade ultérieur. Cette approche, par exemple, permettrait à l&#39;opérateur le temps de remplir toutes les plaques de coloration des cellules vivantes sans compromettre la qualité des données. Afin d&#39;optimiser davantage le flux de production en réduisant le nombre de plaques, il serait également possible de multiplexer plusieurs noeuds finaux ensemble. Par exemple dans ce dommages de l&#39;ADN de contexte et le stress Kinase pourraient être étudiés ensemble simplement en utilisant deux anticorps secondaire avec des fluorochromes émettant dans différentes channels. Le développement continu de la plate-forme de HCS, y compris l&#39;ensemencement automatisé des cellules, la dilution composé, le dosage et la coloration, ainsi que l&#39;ajout de nouveaux paramètres vont encore étendre la capacité de la plate-forme de HCS comme un outil de profilage puissant pour HPHCs sur épithéliale et d&#39;autres types de cellules .

l&#39;évaluation des risques toxicologiques a toujours compté sur l&#39;utilisation de modèles animaux qui, bien que fondamentale dans les sciences de la vie, sont aussi liés à des insuffisances telles que traductibilité incompatibles pour les humains et les coûts élevés. En outre, il y a eu un effort de plus en plus de trouver des alternatives à l&#39; expérimentation animale dans l&#39;esprit de «Les 3R» 2 (remplacement, réduction et raffinement). Cet effort a été accéléré au cours des dernières années, non seulement en raison des progrès récents, tels que les techniques à haut débit et approches de biologie systémique, mais aussi à cause de la législation limitant l&#39;utilisation de tests sur les animaux, en particulier dans l&#39;Union européenne. La complexité des voies de signalisation cellulaires régulant la réponse aux agressions toxiques, il est évident que l&#39;utilisation de paramètres toxicologiques simples ne sera pas suffisant pour décrire la base toxicologique de certains composés. Pour cela, le jeu des centaines d&#39;interagir proteins contribuant à un réseau biologique devront également être pris en compte. Pour étudier l&#39;effet des substances toxiques sur ces réseaux, une approche de la toxicologie du système combiné à moyen phénotypiques et des essais de criblage à haut débit est utile de déduire dynamisations et en même temps fournir plus d&#39;informations sur le mécanisme d&#39;action des toxiques individuels. Dans cette étude, nous avons utilisé HCS comme un puissant outil de criblage qui se compose d&#39;un microscope automatisé et d&#39;une application logicielle biologique, qui peut acquérir, traiter et analyser des données d&#39;images dérivées d&#39;analyses cellulaires spécifiques basées sur la fluorescence. Cela permet des changements visuels dans une cellule à quantifier, à une seule cellule ou au niveau subcellulaire, et de nombreux paramètres à analyser simultanément. 3 Par exemple, l&#39; ADN cassures double brin ont été évaluées à l&#39; aide d&#39; une identification à base d&#39; anticorps de l&#39; histone H2AX phosphorylation et espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) ont été quantifiés en utilisant une cellule-permsuperoxyde Eable de colorant sensible. Parce que les cellules épithéliales pulmonaires représentent la première barrière biologique contre les substances toxiques inhalés, y compris la fumée de cigarette, nous avons utilisé les cellules épithéliales bronchiques primaires comme un modèle in vitro pour profiler l&#39;effet de HPHCs publiés par les États-Unis Food and Drug Administration. 4 Ce manuscrit est un suivi -up sur une étude précédente 5 , dans lequel nous avons évalué l&#39;impact biologique d&#39;un sous - ensemble différent de HPHCs. Dans le cadre de notre flux de travail pour évaluer la cytotoxicité in vitro, nous avons d&#39; abord évalué les potentialités d&#39;une sélection de 15 HPHC de, en utilisant une analyse cellulaire en temps réel à base d&#39; impédance système (RTCA) qui nous a permis d&#39;établir la dose-gammes, appropriées pour HCS ultérieure analyse (figure 1). Une évaluation toxicologique HCS a ensuite été menée en utilisant neuf points d&#39;extrémité multi-paramétriques de toxicité cellulaire, chaque suivi à deux points de temps (4 et 24 h). Les marqueurs utilisés sont une indication de la toxicité mitochondriale, des lésions de l&#39; ADN, le stress kinase, les espèces réactives de l&#39; oxygène (ROS), le glutathion (GSH) contenu caspase 3 - 7 activité, le cytochrome C libération et de la perméabilité de la membrane cellulaire, comme décrit dans le tableau 1. Notre approche a permis l&#39;identification et la caractérisation de l&#39;effet des composants de la fumée de cigarette par échantillonnage de la dose et en fonction du temps. En fin de compte, cela a produit un profil toxicologique in vitro pour chaque HPHC. Les approches multi-omique peuvent également être utilisés pour compléter davantage l&#39;analyse de HCS. Ce serait finalement aussi fournir une compréhension plus approfondie des effets sur la signalisation cellulaire et / ou niveau de la transcription.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td></td><td></td></tr> 05331625001 <tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plastic scelleuse de plaques breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Cellules épithéliales bronchiques humaines normales (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-fumeur donneur masculin caucasien de 60 ans&nbsp ;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Chaud à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Tiède à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask bouchon filtrant 75&nbsp ; cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>plaque d’essai à 96 puits&nbsp ; noir&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (pour coloration nucléaire Far Red)</td><td>Biostate</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Colorant mitochondrial : MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Colorant mitochondrial : MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Colorant : Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Colorant : MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Colorant : Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>Toxique GSH Colorant : Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Perméabilité toxique</td></tr> de <tr><td>la membrane Colorant : YO-PRO-1&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie</td><td>Y3603</td><td>Irritant&nbsp ;</td></tr><tr><td>Perméabilité de la membrane Colorant : TO-PRO-1&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie</td><td>T3602</td><td>Irritant&nbsp ;</td></tr><tr><td>Perméabilité de la membrane Colorant : TOTO-1&nbsp ;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritant&nbsp ;</td></tr><tr><td>Colorant Caspase : Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritant&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cytochrome C (souris)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-phospho-c-Jun (souris)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-phospho-H2AX (souris)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre DyLight 650&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon de perméabilisation</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4 % solution de formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>toxique</td></tr><tr><td>10x tampon de blocage</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Solution saline</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycine</td> toxique <td>Sigma</td><td>V0627</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td> toxique <td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Anisomycine</td> toxique <td>Sigma</td><td>A9789</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthacrynique</td> toxique <td>Sigma</td><td>E4754</td><td></td></tr><tr><td>1-aminonaphtalène</td><td>toxique Sigma</td><td>34390</td><td>Toxique</td></tr><tr><td>2-nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td></td></tr><tr><td>Acétamide</td><td>toxique Sigma</td><td>695122</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>toxique Sigma</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>toxique Sigma</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Arsenic toxique (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>toxique</td></tr><tr><td>Benzène</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Chrome toxique</td></tr><tr><td>(VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td></td></tr><tr><td>Crotonaldéhyde</td> toxique <td>Sigma</td><td>262668</td><td></td></tr><tr><td>Méthyléthylcétone</td> toxique <td>Sigma</td><td>34861</td><td>Nickel toxique</td></tr><tr><td>.</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td></td></tr><tr><td>Toxique Nitrobenzène</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Phénol toxique</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td></td></tr><tr><td>Quinoléine</td><td>toxique Sigma</td><td>241571</td><td></td></tr><tr><td>Toluène</td><td>toxique Sigma</td><td>34866</td><td>Toxique</td></tr></tbody></table>

haut analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (hphc)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

La fumée de cigarette (CS) est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires et pulmonaires. Parce que CS est un aérosol complexe contenant plus de 7000 produits chimiques 1 , il est difficile d&#39;évaluer les contributions des différents constituants à sa toxicité globale. Profils toxicologiques des composants individuels ainsi que les mélanges peuvent cependant être établies in vitro, par application d&#39;une haute traversante mettre des outils de dépistage, qui permettent le profilage des constituants nocifs et potentiellement dangereux (HPHCs) de la fumée de tabac, tel que défini par la US Food and Drug administration (FDA). 2 Pour une évaluation initiale, un instrument à base d&#39;impédance a été utilisé pour un temps réel, l&#39;évaluation sans étiquette de la toxicité du composé. L&#39;affichage de l&#39;appareil repose sur l&#39;adhésion cellulaire, de la viabilité et de la morphologie qui fournissent ensemble une vue d&#39;ensemble de l&#39;état de la cellule. Un paramètre sans dimension, nommé index de cellule, est utilisée pour la quantification. Un ensemble de difprotocoles de coloration diffé- a été développé pour une enquête basée sur l&#39;imagerie par fluorescence et une plate-forme de HCS a été utilisé pour gagner plus en profondeur des informations sur le type de cytotoxicité induite par chaque HPHC. Sur les 15 constituants testés, seuls cinq ont été sélectionnés pour une analyse basée sur HCS comme ils ont enregistré une LD calculable 50 (&lt;20 mM). Ceux-ci comprenaient 1-aminonaphtalène, Arsenic (V), le chrome (VI), crotonaldéhyde et Phénol. Sur la base de leurs effets dans le HCS, 1-aminonaphtalène et Phénol pourraient être identifiés pour induire un dysfonctionnement mitochondrial, et, conjointement avec le chrome (VI) comme génotoxique sur la base phosphorylation accrue de l&#39;histone H2AX. Crotonaldéhyde a été identifié comme un inducteur de stress oxydatif et l&#39;arsenic en tant que voie activateur stress kinase. Cette étude démontre qu&#39;une combinaison de technologies à base d&#39; impédance et HCS fournit un outil robuste pour l&#39; évaluation in vitro des constituants CS.

RTCA Du fait que les points d&#39;extrémité HCS ne seront pas informatifs lorsque aucun effet toxique est détectée, ces composés ne présentant pas de diminution de la viabilité des cellules jusqu&#39;à la concentration la plus élevée dans la RCTA ne sont pas testés par HCS (figure 3b, c, d, g, k, l, m , p). Les composés présentant une diminution de la viabilité cellulaire à la seule concentration la plus élevée (figure 3e, o) sont également désélectionné HCS. Enfin, seuls les constituants avec un LD calculable 50 (&lt;20 mM) sont sélectionnés pour une analyse plus approfondie de HCS (Figure 3a, f, h, j, n). HPHCs répondant aux critères ci-dessus sont: 1-aminonaphtalène, Arsenic (V), le chrome (VI), crotonaldéhyde et Phénol. HCS Comme un contrôle de qualité (QC), les contrôles positifs sont fipremière analyse pour assurer que la procédure de coloration est correctement effectuée. Des images représentatives des cellules témoins positives traitées sont montrées sur la figure 6. Les valeurs données sont normalisées par rapport au véhicule tel que décrit précédemment. Aucune courbes dose-réponse sont tracées en seulement trois doses sont testées et ne sont pas tous les trois doses sont considérés comme à chaque point de temps. Les doses de témoin positives sont sélectionnées (sur la base des expériences antérieures, les données non présentées) de telle sorte que des réponses appropriées soient respectées pour chaque critère d&#39;évaluation à la fois 4 h et 24 h. En doses particulières 1 et 2 sont utilisés pour évaluer l&#39;effet à 4 h alors que des doses 2 et 3 sont utilisées pour évaluer l&#39;effet à 24 h. Les plaques sont rejetées si aucune réponse est observée pour les doses de contrôle positif. A noter que pour tous les points d&#39;extrémité, à l&#39;exception du potentiel de membrane mitochondriale et la teneur en GSH, il est prévu une augmentation de l&#39;intensité du signal. Tous les composés, à l&#39;exception de Phénol, induit une phéno nécrotique<html> le type, basé sur l&#39; augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire (figure 7a, f, h, i). 1-aminonaphtalène, chrome (VI), crotonaldéhyde et Phénol ont été identifiés comme étant génotoxiques basée sur l&#39; augmentation de la phosphorylation de l&#39;histone H2AX de (figure 7e, j, n, p). Phénol et 1-aminonaphtalène ont été trouvés pour induire une dysfonction mitochondriale sévère (figure 7b, o) qui, avec 1-aminonaphtalène, a conduit à une libération du cytochrome C a augmenté (Figure 7c). La détection d&#39;une activité accrue de la caspase 3/7 a fourni des preuves de l&#39;événement apoptotique lors de l&#39;exposition au chrome. Le stress oxydatif induction (ROS ou GSH) a également été détecté lors d&#39;un traitement avec le 1-aminonaphtalène, crotonaldéhyde et Phénol (Figure 7d, m, q). Enfin, l&#39; arsenic induit un stress cellulaire tel que démontré par une augmentation de la phosphorylation du facteur de transcription cJun (figure 7g). charge / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Composé Tox-Profiler Workflow. A) Schéma du flux de travail suivi dans cette étude. Tout d&#39; abord, une constatation dose-gamme a été réalisée en utilisant la plate - forme RTCA pour sélectionner des doses appropriées pour HCS ultérieure pour caractériser les profils de toxicité spécifiques des composés. B) la conception expérimentale de l&#39;étude. 24 heures après l&#39; ensemencement, les cellules ont été dosés et les valeurs d&#39;impédance surveillés en continu pendant 24 heures suivantes, alors que HCS paramètres ont été étudiés 4 et 24 heures après l&#39; administration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figure 2. RTCA Exposition Plate. Plaque maîtresse composé est d&#39; abord générée en effectuant une cinq étapes dilution 1:10 série. Chaque composé,y compris le contrôle du véhicule (dose 0) est ensuite ajouté en triple à la plaque d&#39;exposition et en même temps avec un milieu staurosporine comme témoins. Notez que les doses séquence est maintenue au moment du transfert, doses les plus élevées sont dans la ligne numéro 1 tandis que les contrôles de véhicules sont en numéro de ligne 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figure 3 représentant RTCA Résultats Viabilité cellulaire. A) 1-aminonaphtalène, b) le 2-nitropropane, c) -acétamide, d) Acétone, e) acrylamide, f) , l&#39; arsenic (V), g) benzène, h) et le chrome (VI) , j) crotonaldéhyde, k) méthyléthylcétone, l) Nickel (II), m) nitrobenzène, n) phénol, le o) -quinoléine, p) Toluène. À 24 h après l&#39;administration, l&#39;aire sous la courbe (AUC) a été calculée pour chaque dose (y compris le contrôle positif et le véhicule) et normalisé dans une plage de 0 à -100% d&#39;activité (axe y), où 0 reflète l&#39;activité de le véhicule et -100 du contrôle positif. Les valeurs ont ensuite été tracées et ajustés à l&#39; aide d&#39; un à quatre paramètres colline équation et, lorsque cela est possible, DL 50 a été calculé. Les concentrations sont exprimées sur une échelle logarithmique (axe x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figure 4. Schéma Dilution pour les composés contrôle positif pour HCS Assays. A) Ajout de contrôles positifs et cinqcule à la dilution de série plaque. b) de dilution en série des contrôles positifs. c) 200X contrôles positifs doses. de) Dilution des 200x positifs doses de contrôle dans le milieu (1:40) pour générer la plaque de contrôle positif contenant les doses 5x. Notez que chaque dose est diluée en triple afin de refléter la mise en page finale de la plaque d&#39;exposition). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figure 5. HCS Exposition Plate. Plaque maîtresse composé est d&#39; abord générée en effectuant une dilution en cinq étapes. Chaque composé, y compris le contrôle du véhicule (dose 0) est ensuite ajouté en triple à la plaque d&#39;exposition en même temps que les témoins positifs. Notez que l&#39;ordre des doses est maintenue au moment du transfert,doses les plus élevées sont en ligne numéro 1 tandis que les contrôles de véhicules sont en numéro de ligne 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figure 6. Représentant fluorescents Photos de anticorps- ou Dye-cellules colorées a) Paramètres nucléaires - tinctoriales nucléaire:. Un colorant perméable qui se lie à l&#39; ADN dans les cellules vivantes ou fixes. Cette tache est utilisée pour identifier des cellules individuelles en matière d&#39; étiquetage de la région nucléaire b) Nécrose - perméabilité de la membrane cellulaire colorant:. La détection de l&#39; intégrité de la membrane cellulaire à base de colorant. Le réactif est intrinsèquement imperméable à la membrane cellulaire. Au cours de la nécrose, la membrane devient perméable et le colorant pénètre dans la cellule et se lie à l&#39;ADN produisant une forte fluorescence de. ignal c) Apoptose - Cytochrome C: détection du cytochrome C libération, une caractéristique bien connue de l&#39; apoptose précoce à base d&#39;anticorps. Lors de l&#39; induction de l&#39; apoptose, le cytochrome c est libéré de la mitochondrie et diffuse dans le noyau d) l&#39; ADN de dommages - de pH2AX:.. La détection de la phosphorylation de l&#39; histone H2AX à base d&#39;anticorps, une caractéristique bien connue des cassures double brin de l&#39; ADN e) Stress Kinase - cJun:. la détection à base d&#39;anticorps de la phosphorylation à Ser-73 de cJun, une caractéristique bien connue du stress cellulaire f) du stress oxydatif - DHE: détection de radicaux superoxydes Dye-based. Dihydroethidium se fluoresces bleu dans le cytoplasme tandis que la forme éthidium oxydée réagit en rouge sur l&#39; ADN intercalation g) GSH - mBcl:. Détection de molécules libres GSH Dye-based. mBcl réagit avec GSH àgénérer un produit hautement fluorescent h) Apoptose - Caspase 3/7 activation:. détection de caspase 3/7 activité Dye-based. Le réactif est non fluorescent avec un peptide d&#39;acides aminés quatre qui inhibe la liaison à l&#39;ADN. Lors de l&#39;activation de la caspase-3/7, le peptide est clivé permettre au colorant de se lier à l&#39;ADN et de produire une réponse fluorogène lumineuse. Panneaux Bh montrent des cellules témoins traités positifs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figure 7. Résultats représentant HCS. 1-aminonaphtalène (ae), l&#39; arsenic (V) (f et g), de chrome (VI) (hk), crotonaldéhyde (ln) et Phénol (OQ). 4 h (ligne bleue) etsignaux 24 h (ligne orange) ont été calculées pour chaque dose et normalisée à l&#39;activité du véhicule (0%). Les valeurs qui ne sont pas inclus dans la courbe des calculs d&#39;ajustement sont affichées en gris. Les concentrations sont exprimées sur une échelle logarithmique (axe x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Essai </td><td> Endpoint # </td><td> critère biologique </td><td> compartiment cellulaire </td><td> fonction de sortie </td></tr><tr><td rowspan="4"> cytotoxicité </td><td> 1 </td><td> Masse mitochondriale 6 </td><td> Cytoplasme </td><td> surface moyenne spot </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Le potentiel de la membrane mitochondriale 6 </td><td> Cytoplasme </td><td> intensité moyenne spot </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Cytochrome C libération <sup&gt; 7 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Membrane cellulaire perméabilité 8 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> DNA Damage </td><td> 5 </td><td> phospho-H2AX 9 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> stress Kinase </td><td> 6 </td><td> 10 phospho-cJun </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> GSH contenu </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Cytoplasme </td><td> intensité moyenne spot </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> 9 </td><td> 13 caspase 3 </td><td> Cytoplasme </td><td> intensité moyenne spot </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des HCS assays et les terminaux. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Véhicule </td><td colspan="6" rowspan="2"> doses RTCA (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> doses HCS </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> La viabilité des cellules sélectionnées (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-aminonaphtalène </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 280 uM </td><td> 2000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropane </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acétamide </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acétone </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acrylamide </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsenic (V) </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 160 uM </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzène </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Le chrome (VI) </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 20 pm </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> dix </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td colspan="2"> crotonaldéhyde </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 200 um </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Méthyle éthyle cétone </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt;20 mM, </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nickel </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzène </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phénol </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 2.300 uM </td><td> 5000 </td><td> 2000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> quinoléine </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Toluène </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. Liste des composés HPHC Testé avec LD Relative 50 à 24 h de traitement. Les composés sélectionnés pour l&#39; analyse HCS sont surlignés en orange et les doses testées sont également donnés. La dose 3R4F est équivalente à la quantité de constituant présent dans la fumée d&#39;un bâton de la 3R4F de cigarettes de référence. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Essai </td><td> Composé </td><td> Stock Solution </td><td> Solvant </td&gt; <td colspan="3"> Dose (s) (M) </td></tr><tr><td> Viabilité cellulaire </td><td> staurosporine </td><td> 10 mM, </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> cytotoxicité </td><td> valinomycine </td><td> 10 mM, </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DNA Damage </td><td> paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> stress Kinase </td><td> anisomycine </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> dix </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> roténone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> GSH contenu </td><td> l&#39;acide éthacrynique </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> staurosporine </td><td> 40 mM, </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Liste des contrôles positifs et concentrations utilisées pour chaque essai.

L’objectif de l’étude était d’évaluer l’impact biologique de 15 constituants de la fumée de cigarette en utilisant une combinaison d’un analyseur de cellules en temps réel basé sur l’impédance et d’une plateforme basée sur le criblage à haut contenu (HCS) pour l’évaluation toxicologique in vitro. Cette étude fournit des informations sur les doses efficaces, la toxicité et les modes d’action des composés testés.

Haut Analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

L’objectif global de cette approche, qui combine un analyseur de cellules en temps réel basé sur l’impédance et une plate-forme basée sur le criblage à haut contenu, est de fournir des informations sur les doses efficaces, la toxicité et les effets biologiques, afin d’obtenir le profil de toxicité des composés testés. Cette approche peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la toxicologie. Aborder, par exemple, la cytotoxiticité, la génotoxicité et les réponses cellulaires au stress.De plus, non seulement il fournit des informations sur plusieurs paramètres biochimiques et morphologiques simultanément, mais il peut également être appliqué à une gamme différente de types de cellules et de modèles de culture cellulaire. En raison de la compétence et de la limitation, l’ensemble de l’approche sera effectué en n’évaluant qu’un court morceau de composé. Pour la même raison, un seul protocole sera présenté pour démontrer l’évaluation préalable à haut contenu.Stefano Acali et Alexander Laurent, techniciens de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour voir les cellules épithéliales bronchiques humaines normales, ou cellules NHBE, programmez l’instrument pour définir le nombre et la durée des mesures d’impédance. Dans cette étude, les données sont enregistrées toutes les 15 minutes, pendant 48 heures.Mesurez le fond de la plaque en pipetant 50 microlitres de milieu préchauffé dans chaque puits d’une plaque RTCA de 96 puits. Cette étape représente une exigence technique pour que l’instrument calcule la résistance électrique du milieu à utiliser comme référence de référence pour les calculs basés sur les cellules. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire à une concentration de 144 000 cellules par millilitre au milieu déjà présent dans chaque puits de la plaque RTCA.Une fois que la cellule a chauffé, il est très important de laisser la plaque à température ambiante pendant 40 minutes pour permettre aux cellules de se fixer et d’obtenir une distribution cellulaire homogène. Incuber les plaques RTCA dans le socle de l’incubateur et commencer à enregistrer les données pendant les 24 prochaines heures, plus ou moins deux heures, avant l’administration. Pour le témoin positif, diluer la solution mère de staurosporine de 10 millimolaires, un à 10, dans du DMSO.Ajouter cinq microlitres de dilution à 195 microlitres de milieu pour obtenir une solution de travail 5x. Pour les constituants nocifs et potentiellement nocifs, dissolvez chacun d’eux dans le véhicule pour générer une solution mère d’une molaire. Ensuite, diluer chaque solution mère de la substance d’essai, de un à 10, dans un milieu pour obtenir une solution de 100 millimolaires.Générez la plaque maîtresse composée en ajoutant d’abord le milieu plus 10 % de véhicule dans les puits de B à F, et la solution de 100 millimolaires dans le puits A. Effectuez une dilution en série en cinq étapes, de un à 10, pour obtenir les solutions de travail 5x. Pour le dosage, mettez l’instrument RTCA en pause, ouvrez le socle pour retirer la plaque d’exposition et placez la plaque dans l’outil de température RTCA pour éviter de refroidir les cellules, ce qui pourrait avoir un impact sur la mesure de l’impédance. Ajoutez 25 microlitres de solution 5x de la plaque maîtresse Compound aux cellules en trois exemplaires, en maintenant le même ordre de dosage que dans la plaque maîtresse Compound.Ne retirez pas le milieu de culture cellulaire existant. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de contrôle positif 5x dans les cellules de la moitié droite de la rangée inférieure, sans retirer le milieu de culture existant. De même, ajoutez 25 microlitres de milieu aux cellules de la moitié gauche de la rangée inférieure.Après avoir scellé la plaque avec la scelleuse de plaques, replacez la plaque dans le berceau RTCA et verrouillez-la. Redémarrez l’enregistrement des données pour le temps d’exposition souhaité. Après l’enregistrement des données, analyser les données de viabilité cellulaire de l’ATCR afin de déterminer la substance d’essai à utiliser dans l’analyse HCS.Dans cette expérience, le 1-aminonaphtalène, l’arsenic, le chrome et le crotonaldéhyde sont sélectionnés pour l’analyse HCS. Pour voir les cellules NHBE, ajoutez 100 microlitres d’une suspension cellulaire à 120 000 cellules par millilitre dans chaque puits d’une plaque noire de 96 puits. Après avoir laissé la plaque HCS à température ambiante pendant 30 minutes, pour permettre aux cellules de se fixer aux puits, incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 24, plus ou moins deux heures, avant le dosage.Pour le témoin positif, distribuer 40 microlitres de la solution mère de chaque témoin positif dans la deuxième colonne. Ensuite, distribuez 20 microlitres du véhicule dans les colonnes trois et cinq. Et 40 microlitres du véhicule dans la quatrième colonne.Retirez 12 microlitres des puits de la deuxième colonne, distribuez-les dans les puits de la troisième colonne et mélangez. Continuer jusqu’à l’obtention d’une dilution finale en série avec trois doses et un véhicule pour chaque composé témoin positif. Pour générer la plaque de contrôle positif, préparer une dilution de un à 40 dans le milieu des trois doses et du véhicule.Pour fabriquer la plaque maîtresse du composé, remettre en suspension et diluer chaque solution mère de la substance d’essai, de un à 10 po de milieu pour une concentration de 100 millimolaires. Effectuer des dilutions à l’aide d’un milieu contenant 10 % de véhicule afin d’obtenir les doses 5x sélectionnées pour chaque substance d’essai. Les témoins positifs et la plaque composée sont maintenant prêts à être dosés sur la plaque d’exposition.Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solutions 5x de la plaque maîtresse Compound aux cellules en trois exemplaires, en maintenant le même ordre de dosage que dans la plaque maîtresse Compound. Ne retirez pas le milieu de culture cellulaire existant. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de la solution 5x de la plaque de contrôle positif dans les cellules de la rangée inférieure, en maintenant le même ordre de dosage que dans la plaque de contrôle positif.Préparez un volume suffisant de la solution de coloration des cellules vivantes comme décrit dans le protocole textuel. Ensuite, diluez à la fois le colorant mitochondrial, et le colorant de perméabilité membranaire dans la solution de coloration des cellules vivantes, selon les instructions du fournisseur. Ajouter 50 microlitres de la solution de coloration de cellules vivantes dans chaque puits de la plaque désignée Cytotoxicity Assay.Ne retirez pas le milieu de culture cellulaire et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, 5 % CO2. Aspirez doucement le milieu et la solution de coloration et ajoutez 100 microlitres de solution de fixation dans chaque puits. Ensuite, incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante, dans l’obscurité.Après l’incubation, aspirez doucement la solution de fixation et lavez-la une fois avec 100 microlitres par puits de tampon de lavage. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 100 microlitres par puits de 1x tampon de perméabilisation à chaque puits, avant d’incuber pendant 10 minutes à température ambiante, dans l’obscurité. Aspirez le tampon de perméabilisation et lavez la plaque deux fois avec 100 microlitres, par puits, de tampon de lavage.Ensuite, aspirez le tampon de lavage et ajoutez 100 microlitres de 1x tampon de blocage dans chaque puits. Ensuite, incubez pendant 15 minutes à température ambiante, dans l’obscurité. Diluer l’anticorps anti-cytochrome C, de un à 250, dans une solution d’anticorps primaires.Ensuite, aspirez le tampon de blocage et ajoutez 50 microlitres, par puits, de solution d’anticorps primaires dans chaque puits, avant d’incuber pendant 60 minutes à température ambiante, dans l’obscurité. Diluer l’anticorps anti-souris, de un à 500, dans une solution d’anticorps secondaire et nucléaire. De plus, diluez le colorant nucléaire, de un à 1 000, dans une solution d’anticorps secondaire et de nucléaire.Après avoir aspiré la solution d’anticorps primaires, lavez la plaque trois fois avec 100 microlitres, par puits, de tampon de lavage, à l’aide du laveur de plaques. Aspirez le tampon de lavage et ajoutez 50 microlitres, par puits, d’anticorps secondaires et de solution nucléaire dans chaque puits de la plaque. Maintenant, incubez la plaque pendant 60 minutes à température ambiante, dans l’obscurité.Après l’aspiration de l’anticorps secondaire et de la solution nucléaire, laver la plaque trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage par puits à l’aide du laveur de plaques. Ensuite, ajoutez 100 microlitres, par puits, de tampon de lavage. La plaque est maintenant prête à être évaluée sur l’instrument HCS et l’acquisition est lancée.Les résultats représentatifs de la viabilité cellulaire de l’ATR du traitement de la substance d’essai sont présentés. Un effet toxique dose-dépendant est obtenu sur 24 heures d’exposition uniquement avec le 1-aminonaphtalène, l’arsenic, le chrome et le crotonaldéhyde, car ils ont tous présenté une DL50 calculée inférieure à 20 millimolaires. Aucun effet toxique n’a été obtenu avec les autres composés.Les résultats HCS représentatifs ne sont présentés que pour le traitement par 1-aminonaphtalène. L’effet toxique du 1-aminonaphtalène induit de graves dommages à la membrane cellulaire, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire en fonction de la dose, après quatre heures d’exposition. Le composé affecte également les mitochondries, induisant une augmentation de masse après quatre heures d’exposition, ainsi que la libération du cytochrome C, qui est ensuite détectable dans les noyaux après quatre et 24 heures d’exposition.Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en deux à trois jours, car la plupart d’entre elles nécessitent environ une heure par jour de temps pratique pour le réglage et le dosage. Selon le protocole choisi, le criblage à haut contenu nécessite un maximum de trois heures et demie pour l’exécution de l’ensemble de la procédure de coloration. Lorsque vous tentez cette procédure, gardez à l’esprit que même si la sélection d’un plus grand nombre de points de terminaison ajoute de la complexité au flux de travail, elle n’augmentera pas considérablement le temps.Avec un flux de travail optimal, en effet, plusieurs plaques peuvent être évaluées en parallèle. La poursuite du développement de la plateforme de criblage à haut contenu, y compris le réglage entièrement automatisé des cellules, la dilution des composés, le dosage et la coloration, ainsi que l’ajout de nouveaux critères d’évaluation, élargiront encore la capacité de la plateforme de criblage à haut contenu en tant qu’outil puissant pour le profilage toxicologique. De plus, la combinaison de plusieurs paramètres toxicologiques uniques à un débit aussi élevé nous permettra de faire un pas de plus dans nos efforts visant à réduire les tests chimiques sur les animaux.

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Nous décrivons une méthodologie combinant la culture cellulaire automatisé à haute teneur en imagerie pour visualiser et quantifier les multiples processus cellulaires et des structures, de manière à haut débit. De telles méthodes peuvent aider dans l'annotation fonctionnelle des génomes d'autres ainsi que d'identifier des réseaux de gènes des maladies et de cibles thérapeutiques potentielles.

Dépistage du contenu haute sur les maladies neurodégénératives

Les protocoles décrivent deux vitro systèmes de test de toxicité sur le développement dans (UKK et UKN1) basée sur les cellules souches embryonnaires humaines et des études de transcriptome. Les systèmes de test prédisent risque de toxicité pour le développement humain, et peuvent contribuer à réduire les études sur les animaux, les coûts et le temps requis pour l'essai de la sécurité chimique.

Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

Compte tenu du principe des 3 r, modèles respiratoires comme des alternatives aux études sur les animaux évoluent. Surtout pour l’évaluation des risques des substances respiratoires, il y a un manque d’essais appropriés. Nous décrivons ici l’utilisation de tranches de poumon humain de coupe de précision pour l’évaluation des substances véhiculées.

Évaluation de la cytotoxique et effets immunomodulateurs de Substances dans des tranches de poumon humain de coupe de précision

Criblage de RNA inhibitrice petit haut débit est un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. Nous présentons ci-après, le développement et la validation des modèles d’exposition et des méthodes pour le criblage à haut débit de fluorure d’hydrogène et chloropicrine-cornée épithéliales lésion induite.

Criblage à haut débit siARN préjudice de cellules épithéliales de chloropicrine et cornée induite par le fluorure d’hydrogène

Une méthode quantitative a été développée pour identifier et prédire la toxicité aiguë de substances chimiques en analysant automatiquement la détermination des caractéristiques phénotypiques de Caenorhabditis elegans. Ce protocole décrit comment traiter les vers avec des produits chimiques dans une plaque 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes associés toxicologiques.

Un test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique de profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans

Ce protocole présente une technique automatisée à haut débit basée sur l’image pour identifier les composés modulant la destruction des cellules cancéreuses du sein médiée par les cellules tueuses naturelles en présence d’un anticorps thérapeutique anti-HER-2.

Essai de criblage à haute teneur pour l’identification de composés modificateurs de la cytotoxicité cellulaire dépendants des anticorps

Démonstration de la quantification des ADN double brin à l'aide Molecular Probes PicoGreen colorant et spectrophotomètre Hitachi fluorescence F-7000 équipé d'un accessoire lecteur de microplaques.

Quantification des ADNdb utilisant le Hitachi F-7000 Spectrophotomètre de fluorescence et de PicoGreen Dye

Procédé de criblage à haut contenu de la nouvelle identification de signalisation des récepteurs transmembranaires compétentes est décrite. Cette méthode se prête à l'automatisation à grande échelle et permet des prédictions...

Un workflow d&#39;imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d&#39;expression

Un protocole est développé pour examiner les effets d’un médicament épigénétique DZNep sur le développement, la fécondité et la survie des moustiques.  Nous décrivons ici les procédures d’exposition aqueuse de DZNep aux moustiques immatures et d’exposition sanguine de DZNep aux moustiques adultes, en plus de mesurer l’inhibition de l’hydrolase de l’HSA.

Les analyses toxicologiques pour Effets d&#39;essais d&#39;un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Découvrez l'analyse de dépistage à haut contenu pour évaluer la toxicité des composants de la fumée de cigarette sur des cellules épithéliales bronchiques humaines normales. Cette méthode combine l'analyse d'impédance en temps réel et le screening à haut contenu pour déterminer les doses efficaces et les modes d'action.

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