Name: In Vivo Biocapteur Tracks apoptotique non-activité Caspase chez la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Découvrez le biosenseur CaspaseTracker pour détecter l'activité caspasique non apoptotique chez Drosophila melanogaster. Cette méthode permet d'étudier les fonctions cellulaires saines et la régulation neuronale in vivo.

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Nous remercions Polan Santos et Darren Obbard pour les illustrations de drosophile en Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena pour l&#39;utilisation de l&#39;insectarium JHMRI. Ce travail a été soutenu par la bourse de la Fondation Life Science Research (HLT), Comité des bourses universitaires de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) et NIH accorde NS096677, NS037402 et NS083373 (JMH). Ho Lam Tang est une fondation Shurl et Kay Curci Fellow de la Fondation de recherche en sciences de la vie.

1. Préparation des mouches CaspaseTracker <ol><li> Pour préparer CaspaseTracker (DQVD) mouches pour des expériences, effectuer cette croix: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-DP; UAS-FLP; UBI&gt; Stop&gt; GFP-NLS), en transférant 7-10 femelle vierge (ou masculin) les mouches portant le substrat de caspase biocapteur mCD8-DIAP1-Gal4 dirigé par le promoteur de l&#39; ubiquitine 35 avec le même nombre de mâle (ou femelle) G-TRACE mouches, qui ont le deuxième équilibreur chromosome CYO pour éviter la létalité de la combinaison homozygote G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP et UBI&gt; Stop&gt; GFP-NLS) 34. Placer les mouches dans un flacon de nourriture fraîche avec de la pâte de levure fraîche comme une source de protéines. </li><li> Incuber fichiers à 18 ° C pendant 5 à 7 jours (maximum 2 semaines) puis retirez le parent vole du flacon pour éviter la surpopulation avec une nouvelle progéniture, et de mettre en place de nouveaux flacons d&#39;élevage. </li><li> Continuer l&#39;incubation à 18 ° C jusqu&#39;à ce que la progéniture mouches éclosent. Sélectionnez le non-CYO [non-cURLy aile] progéniture du génotype correct de CaspaseTracker, qui sont transgéniques pour CaspaseTracker et G-TRACE éléments 35. </li><li> En même temps, générer contrôle parental mouches W118 non transgéniques et caspase-insensible (DQVA) vole en parallèle pour vérifier RFP CaspaseTracker spécifique et fluorescence de la GFP. </li><li> Effectuer le génotypage par PCR pour confirmer les fichiers avec CaspaseTracker en utilisant les amorces: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produisant un produit 3.897 pb. Pour le génotypage du locus G-Trace, utilisez les amorces suivantes pour la GFP (474 ​​pb), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; pour RFP (258 pb), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; et Flpase (655 pb), 5&#39;CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Pour génotypage Gal4 dans le vecteur pUWR (554 pb), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CCG, 3&#39;-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Préparation des tissus, Coloration et montage <ol><li> Pour les dissections de mouches, de prévenir les tissus disséqués de coller aux pointes de pipette en plastique et des tubes de centrifugation, des conseils de manteau et des tubes avec de l&#39;albumine 1% de sérum bovin (BSA) dissous dans l&#39;eau. </li><li> Disséquer vole sur un coussin de silicone en utilisant une pince. <ol><li> Pour éviter d&#39;endommager les pointes des pinces sur une surface dure lors de l&#39;exécution de la dissection des tissus, effectuer la dissection sur une surface de silicium. Pour la fabrication de plaques de silicone de dissection, faire fondre le silicium dans le kit commercial selon les instructions du fabricant (Liste des matériaux). Après la fonte de la silicone, ajouter 3 à 4 ml d&#39;une boîte de culture tissulaire de 60 mm de diamètre. plats de silicium peuvent être réutilisés. </li><li> Anesthésier une mouche avec du CO 2, et le transférer sur une plaque de silicone avec 1 ml de PBS froid. Introduire le CO 2 à un flacon contenant la volée en utilisant une sarbacane, puis transférer la mouche anesthésiés toa Pad qui a une alimentation de CO 2. </li><li> Utilisez une paire de pinces pour tenir la tête de mouche, et une seconde paire de pinces pour tirer le thorax dans la direction opposée à déconnecter la tête de la mouche du corps couvrant sans endommager la connexion entre la tête et foregut. </li><li> Utiliser 2 paires de pinces pour enlever les ailes et les pattes du thorax. </li><li> Utilisez une paire de pinces pour tenir le thorax, et une autre paire de pinces pour tirer l&#39;abdomen pour le séparer du thorax à nouveau sans endommager la connexion entre l&#39;intestin antérieur et l&#39;intestin moyen. </li><li> Disséquer organes internes y compris le cerveau, l&#39; intestin, les tubules de Malpighi et des ovaires comme démontré précédemment. 39-41 </li><li> Retirez tous les morceaux de la cuticule et les corps gras avec une pince que ces tissus produisent une forte autofluorescence. La patience et la pratique sont nécessaires pour préparer un système d&#39;organe complet comme indiqué. </li></ol></li><li> Transfert des tissus disséqués à 1,5 tubes à centrifuger ml, et fixer les tissus wie 0,5 ml de paraformaldehyde à 4% dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) à température ambiante pendant 20 à 30 minutes avec rotation dans l&#39;obscurité pour éviter le blanchiment DP et GFP dans les tissus. Éviter la fixation prolongée qui peut compromettre les résultats de coloration ultérieures. </li><li> Retirez le paraformaldéhyde par pipetage doux et laver 3 fois avec 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) à la température ambiante. </li><li> Perméabiliser les tissus avec 0,5 ml de PBST à 4 ° C pendant une nuit sous agitation douce. incubations plus courts peuvent provoquer perméabilisation et de compromis coloration des résultats incomplets. <ol><li> Si cela est nécessaire pour réduire la coloration de fond, envisager l&#39;incubation de tissus dans 0,5 ml de PBST contenant 1% de BSA, au lieu de PBS. </li></ol></li><li> Laver les tissus 3 fois avec 0,5 ml de PBST. </li><li> Pour colorer les noyaux et l&#39;actine filamenteuse (F-actine), appliquer 0,5 mL PBST avec 10 pg / ml de colorant Hoechst 33342 nucléaire bleu et 0,3 uM Alexa Fluor tache 633 phalloïdine F-actine et incuber simultanément avec les tissus pendant 1 h à température ambiante wvec une légère rotation dans l&#39;obscurité. Évitez coloration prolongée car cela va augmenter l&#39;arrière-plan. <ol><li> Pour une immunocoloration, incuber fixées et perméabilisées tissus avec 0,1% de Triton X-100 dans 0,5 ml de PBS pendant une nuit à 4 ° C, la tache avec dilution 1: 100 d&#39;anticorps anti-ELAV ou dilution 1: 200 d&#39;anticorps anti-caspase-3 pendant une nuit à 4 ° C (300 pi). Suivi par l&#39;anticorps secondaire correspondant dilué à 1: 100 et on incube pendant 1 à 3 h à température ambiante. Voir la liste des matériaux d&#39;information anticorps spécifique. </li></ol></li><li> Laver les tissus 3 fois, chacune pendant 5 min dans 0,5 ml PBST avec une légère rotation. </li><li> Avec une pipette, enlever tous les PBST, puis ajouter 200 ul anti-eau de Javel agent de montage (voir matériaux) pour couvrir complètement les tissus pour les 1-3 h à température ambiante, ou 4 ° C pendant la nuit. tissus optimales qui ont entièrement absorbé l&#39;agent de montage va couler au fond du tube. </li><li> Pré-nettoyer la lame de verre avec de l&#39;eau ou de 70% d&#39;éthanol et de transférer les tissus avec un agent de fixation aux glass diapositive. </li><li> Placez délicatement une lamelle de verre sur les tissus. Appliquer de la vaseline sur la lame de verre et la lamelle pour éviter de détruire le tissu par surcompression. Retirer l&#39;agent de montage supplémentaire avec du papier de soie. </li><li> Sceller la lamelle en appliquant le vernis à ongles tout le long des bords de la lamelle pour éviter les fuites d&#39;agents de fixation des tissus. </li></ol> 3. Microscopie confocale <ol><li> Utilisez un confocal épi-fluorescence microscope inversé. Cependant, les microscopes en haut à droite peuvent être également utilisés. Pour les tissus d&#39;image en utilisant le carrelage, de maintenir stable la température ambiante pour éviter toute dérive de focalisation et le déplacement du plan xy en raison de l&#39;expansion et la contraction thermique des composants. systèmes de contrôle de l&#39;environnement et des systèmes de compensation de la dérive de mise au point permettent d&#39;éviter ce problème en raison de la perte de thermo-équilibre du système de microscope. </li><li> Placer la lame sur la platine du microscope. Prenez quelques images de test en utilisant une faible résolution (125 x 125 pixels) d&#39;uned déterminer le nombre approprié de tuiles nécessaires pour couvrir l&#39;ensemble de la région d&#39;intérêt (ROI). </li><li> Régler le système de balayage du microscope pour capturer des images avec une résolution telle que 500 x 500 pixels à balayage. Sélectionnez l&#39;objectif tel qu&#39;un 20X NA 0,8 ou un objectif 63X NA 1.4 Plan-Apochromat pour analyser les tissus grâce à des lamelles de verre, de sorte que chacune des images (tuiles) recouvre de 20% sur tous les côtés. </li><li> Mettre en place la séquence d&#39;images de la plus longue à la plus courte longueur d&#39;onde d&#39;excitation, comme la lumière de longue longueur d&#39;onde provoque inférieure photo-blanchiment. La séquence du plus long au plus court d&#39;onde d&#39;excitation est la suivante: (i) 633 nm pour la phalloïdine F-actine et des anticorps dirigés contre les caspases activées, (ii) 561 nm pour DP, (iii) 488 nm pour la GFP, et (iv) 405 nm pour Hoechst tache nucléaire. </li><li> Au cours de l&#39;imagerie, de minimiser l&#39;exposition des cellules à fluorescence excitation laser au cours du processus d&#39;imagerie afin d&#39;éviter la photo-blanchiment en réduisant l&#39;intensité du laser pour obtenir des images de haute qualité des tissus. </li><li> Après jemages sont collectées, fusionner les images en utilisant le logiciel de microscope. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous illustrons la construction et le fonctionnement interne de CaspaseTracker qui facilitent la détection de l&#39;activité de la caspase base largement répandue dans les tissus sains. Les étapes essentielles pour détecter l&#39; activité de la caspase non-apoptotique in vivo sont: 1) la génération de mouches avec le transgène biocapteur, 2) la vérification de la fonction de rapporteur spécifique-caspase avec des contrôles appropriés, 3) la pratique des techniques de dissection pour observer tous les syst...

Les caspases sont des protéases cystéines qui médient la mort cellulaire par apoptose par clivage de nombreuses protéines intracellulaires après les résidus aspartate clés. Par exemple, les caspases initiatrices activent les caspases effectrices, des nucléases d&#39;ADN déréprimer, les composants du cytosquelette cliver et modifient la composition lipidique des membranes cellulaires à démonter rapidement les cellules et stimuler leur reconnaissance et phagocytose par les cellules qui se débarrassent des corps cellulaires voisins. 1-4 On estime que des milliards de cellules meurent par jour dans le corps humain, et l&#39; apoptose est un mécanisme important de la mort des cellules tumorales induite par la chimiothérapie. 5 un ensemble différent de caspases peut provoquer la mort cellulaire par des procédés non-apoptotiques distincts pour stimuler l&#39; immunité innée. 6 par conséquent, la plupart des recherches sur les caspases a mis l&#39;accent sur leurs fonctions pro-mort. Fait intéressant, la preuve précoce dans le domaine a révélé que les mêmes caspases responsables de la promotion de la mort cellulaire ont aussi non-mort fonctions. Des études pionnières ont démontré que les caspases sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires dans les cellules saines, y compris la régulation de la prolifération cellulaire et la migration au cours de l&#39; embryogenèse. 7-9 caspases sont nécessaires pour individualiser spermatid chez la drosophile 10,11, pour bloquer une voie de mort cellulaire nécroptose alternatif chez les souris 12,13, et pour le traitement des microARN en C. . elegans 14,15 Dans peut-être les plus longue durée de vie des cellules, les neurones, les caspases et d&#39; autres machines apoptotique sont impliqués dans la régulation de l&#39; activité neuronale par la taille des terminaisons synaptiques, un processus considéré comme essentiel pour renforcer d&#39; autres synapses pour l&#39; apprentissage et la mémoire 16-. 18 Il est possible que les caspases faciliter l&#39; élagage synaptique par un type de mini-apoptose neuronale de petites saillies , sans mort cellulaire entier. 19 Cependant, les caspases peuvent avoir d&#39; autres fonctions sans rapport avec les événements de l&#39; apoptose analogue. 20,21 double rôles dans la vie et la mort ne sont pas uniques à caspases; BCL-2 protéines de la famille et du cytochrome c ont des rôles en energetique cellulaires dans les cellules saines , mais font également partie de la voie apoptotique de base qui est activé par de nombreux types de stress cellulaire. 22-25 Bien que pas prouvé, il semble logique que l&#39; évolution a lié jour -jobs à mort-emplois dans les mêmes molécules pour assurer l&#39;élimination rapide des cellules impropres ou indésirables. À l&#39;heure actuelle, les mécanismes moléculaires de l&#39;activité de la caspase non apoptotiques ne sont pas comprises, et le degré d&#39;activité de la caspase non apoptotique pendant le développement embryonnaire et dans les tissus adultes sont également inconnus. Un défi majeur est la difficulté de distinguer jour-emploi de mort-emploi de caspases. Contrairement à l&#39;apoptose et pyroptosis, lorsque l&#39;activité de la caspase est amplifié par une cascade protéolytique, le jour-emploi de caspases devraient se produire beaucoup plus faibles niveaux d&#39;activité enzymatique, probablement ci-dessous la détection par beaucoup techn disponibleslogies. Avant le travail présenté ici, d&#39;autres ont développé une variété de biocapteurs de caspases à des fins différentes. Les biocapteurs SCAT (par exemple, ECFP-DEVD-Vénus) détectent rapidement l&#39; activité de la caspase en temps réel dans des cellules cultivées et les tissus animaux en utilisant FRET. 26,27 Sur caspase clivage, la GFP fraction nucléaire ciblée de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subit une re - localisation subcellulaire quelques minutes lorsque sa membrane plasmique attache est clivée par les caspases. 28 de même, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-SLN) relocalise du cytosol vers le noyau lors de la caspase clivage. 29,30 Plus récemment, le chromophore dans iCasper est habilement conçu pour émettre une fluorescence lorsqu&#39;il est clivé par des caspases, ce qui permet la détection de l&#39; activité de biodétecteur en temps réel dans les neurones d&#39;embryons de Drosophila, mais surtout en association avec la mort cellulaire développementale. mort 31 caspase-dépendante des neurones olfactifs au cours du vieillissement était demonstévalué par immuno-détection de la forme de biocapteurs CPV (par exemple, mCD8-PARP-Vénus) caspase-clivée. 32,33 Surtout, la forme activée de la caspase-3 a été détectée en l&#39;absence de mort cellulaire par immunocoloration sensible dans les épines de neurones en culture, et dans le soma en utilisant la fluorescence de la caspase-dépendante du nucléaire colorant CellEvent rapporteur, mais des difficultés ont été rencontrées en raison de photo-toxicité, bien que la mort cellulaire a été retardée jusqu&#39;à ce que la colonne vertébrale élimination. 19 Ainsi, de nouveaux biocapteurs de caspases sont nécessaires pour détecter et de suivre les cellules ayant une activité caspase basale in vivo. Pour surmonter ces difficultés, nous avons généré un roman à double biocapteur couleur de caspase, désigné CaspaseTracker. Cette stratégie combine une version modifiée de la drosophile sensible à la caspase Apoliner biocapteur 28 avec la drosophile G-TRACE système de recombinase 34 FRT pour marquer de manière permanente et le suivi des cellules in vivo. &lt;sup&gt; 35 Le système G-TRACE Gal4 activé permet de très faibles niveaux de caspases pour activer CaspaseTracker, résultant dans l&#39; expression de la DP dans le cytoplasme et l&#39; expression permanente de la GFP nucléaire ciblée dans une cellule qui a jamais connu l&#39; activité de la caspase 35 Ce système peut étiqueter. cellules tout au long de la vie chez les animaux entiers à l&#39; aide de Drosophila melanogaster, un système modèle traitable et largement utilisé pour l&#39;étude des caspases et la mort cellulaire. 36-38

<table><tr><tbody><td colspan="4">Consommables et réactifs</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Support de montage</td></tr><tr><td></td><td>Pince Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Pince à épiler Dumont de qualité biologique, acier inoxydable</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Lames en verre</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondes</td> <td>moléculairesH1399</td><td>Coloration à l’ADN</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633</td><td>Sondes moléculaires</td> de phalloïdine <td>A22284</td><td>Coloration à l’actine</td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 Anticorps anti-elav</td><td>Études sur le développement Banque d’hybridomes (DSHB)</td><td>ID du registre des anticorps :&nbsp ; AB_528218&nbsp ;</td><td>Coloration pour la drosophile pan-neuronale ELAV</td></tr><tr><td>Anticorps anti-caspase-3 clivé (Asp175)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Coloration pour le fragment actif de la caspase-3</td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>pour préserver les fluorophores&nbsp ;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant Life</td><td>Technologies</td><td>P36961</td><td>pour préserver les fluorophores&nbsp ;</td></tr><tr><td>SylGard 182 Kit Élastomère de Silicone</td><td>Dow Corning&nbsp ;</td><td>Code du produit : 0001023934</td><td>pour plaques</td></tr><tr> de dissection <td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 microscope confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissection</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150&nbsp ; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Source lumineuse</td></tr></tbody></table>

in vivo biocapteur tracks apoptotique non-activité caspase chez la drosophile

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Les caspases sont les médiateurs clés de la mort cellulaire apoptotique via leur activité protéolytique. Lorsque les caspases sont activées dans les cellules à des niveaux détectables par les technologies disponibles, on suppose généralement que l’apoptose se produit peu de temps après. Les caspases peuvent cliver de nombreux composants fonctionnels et structurels pour provoquer une destruction cellulaire rapide et complète en quelques minutes. Cependant, de plus en plus de preuves indiquent que dans les cellules saines normales, les mêmes caspases ont d’autres fonctions, probablement à des niveaux enzymatiques inférieurs. Les études sur l’activité non apoptotique des caspases ont été entravées par les difficultés à détecter de faibles niveaux d’activité des caspases et à suivre le destin cellulaire ultime in vivo. Ici, nous illustrons l’utilisation d’un rapporteur de caspase ultrasensible, CaspaseTracker, qui marque de manière permanente les cellules qui ont subi une activité de caspase chez des animaux entiers. Ce biocapteur CaspaseTracker bicolore in vivo pour Drosophila melanogaster exprime transitoirement la protéine fluorescente rouge (RFP) pour indiquer une activité récente ou en cours de la caspase, et exprime de manière permanente la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules qui ont connu une activité de caspase à un moment donné dans le passé mais qui ne sont pas mortes. Il est important de noter que ce biocapteur in vivo dépendant des caspases révèle facilement la présence d’une activité de caspase non apoptotique dans les tissus des systèmes d’organes de la mouche adulte. Ceci est démontré à l’aide de dissections de montures entières de mouches individuelles pour détecter l’activité des biocapteurs dans les cellules saines du cerveau, de l’intestin, des tubules de Malpighian, du cardia, des canaux ovariens et d’autres tissus. CaspaseTracker détecte l’activité non apoptotique de la caspase dans les cellules à longue durée de vie, tandis que l’activité du biocapteur est détectée dans les neurones adultes et dans d’autres tissus au moins 10 jours après l’activation de la caspase. Ce biocapteur sert d’outil important pour découvrir les rôles et les mécanismes moléculaires de l’activité des caspases non apoptotiques chez les animaux vivants.

Il y a deux éléments clés qui permettent CaspaseTracker de détecter l&#39; activité des caspases dans les cellules saines normales (Figure 1a). Le premier d&#39; entre eux est un polypeptide de la caspase-clivable 146 acides aminés calquée sur la caspase biocapteur Apoliner (figure 1b) 28 Ce polypeptide est dérivé d&#39;DIAP1 (inhibiteur de Drosophila de l&#39; apoptose) contenant un seul site de la caspase d&#39; origine naturelle qu...

Pour détecter les cellules saines chez des animaux entiers qui contiennent de faibles niveaux d&#39;activité de la caspase, le biocapteur très sensible désigné CaspaseTracker a été générée pour la drosophile. Biocapteur activité caspase-dépendante est détectée dans les cellules saines longue durée de vie à travers les organes internes des animaux adultes élevés dans des conditions optimisées en l&#39;absence de stimuli de mort.

In Vivo Biocapteur Tracks apoptotique non-activité Caspase chez la drosophile

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

L'objectif général de cette expérience est de détecter et de suivre l'activité des caspases non apoptotiques chez des animaux vivants en utilisant Drosophila Melanogaster comme modèle. Les caspases sont des protéases qui clivent de nombreux composants cellulaires, entraînant la mort cellulaire apoptotique. Par conséquent, la présence de caspases actives dans les cellules est souvent considérée comme un signe de mort cellulaire imminente.Cependant, des preuves croissantes indiquent que les mêmes caspases responsables de la mort cellulaire jouent également des rôles normaux dans les cellules saines. Ces fonctions physiologiques des caspases incluent la régulation de l'activité neuronale, des fonctions mitochondriales, voire la suppression de voies alternatives de mort cellulaire. L'étude de ces fonctions physiologiques des caspases présente deux difficultés majeures.Tout d'abord, les niveaux basaux normaux d'activité des caspases se situent généralement en dessous des limites de détection des technologies disponibles. Deuxièmement, même lorsque l'activité basale des caspases est détectable, il est difficile de la distinguer de l'activité des caspases qui entraînera la mort cellulaire dans un avenir proche. Pour résoudre ce problème, nous avons mis au point un traceur de caspase : un biocapteur de caspase plus sensible, capable de marquer de façon permanente les cellules ayant survécu à l'activation de la caspase.Ce biocapteur nous permettra de détecter et de suivre les cellules présentant une activité de caspase non apoptotique, ainsi que d'étudier ses fonctions chez des animaux vivants. Le système de biocapteur in vivo pour le traçage de l'activité de la caspase chez Drosophila se compose de deux éléments : le transcriteur Gal4 activable par la caspase et le rapporteur fluorescent activé par Gal4, connu sous le nom de G-Trace.Des mouches portant un biocapteur de caspase sont croisées avec des mouches G-Trace afin de générer des mouches CaspaseTracker qui signalent l'activité des caspases par une fluorescence rouge et verte. L'activité des caspases est détectée chez les descendants lorsque le biocapteur est clivé par des caspases actives au niveau de la séquence DQVD, libérant Gal4 de la membrane plasmique. Gal4 libéré transloque vers le noyau et induit l'expression de la protéine fluorescente rouge, RFP, jusqu'à ce que les caspases deviennent inactives.Cependant, Gal4 induit également l'expression de la recombinase FLP, entraînant une expression continue de la GFP ciblée vers le noyau pendant toute la durée de vie de la cellule. Un biosenseur de contrôle présente une mutation, DQVA, au niveau du site de clivage par la caspase. Pour commencer, croisez des mouches transgéniques portant le biosenseur Gal4 sensible à la caspase avec des mouches portant le rapporteur de fluorescence G-Trace.Associer sept à 10 femelles vierges porteuses du biocapteur avec sept à 10 mâles G-Trace récemment éclos dans un flacon contenant un milieu frais. Un contrôle négatif important est la version insensible aux caspases de ce biocapteur, qui présente une mutation ponctuelle unique au niveau du résidu d'aspartate nécessaire au clivage par les caspases. Utiliser la même procédure d'accouplement pour ces mouches témoins.Après avoir mis en place les croisements, conserver les tubes à 18 degrés Celsius. Lorsque les larves se développent et avant que de nouvelles mouches descendants n'émergent, transférer les mouches parentales dans de nouveaux tubes afin de continuer à produire de nouvelles progénitures. Lorsque les mouches descendants émergent, collecter celles possédant des ailes droites, non recourbées.Ce phénotype indique que ces mouches portent des transgènes pour le capteur de caspase et pour le marqueur fluorescent G-Trace. Ensuite, selon des protocoles établis, disséquer les mouches afin d'isoler les tissus mous internes intacts provenant à la fois des mouches témoins et des mouches porteuses du capteur de caspase. Pour commencer, préparer des embouts de pipette et des tubes de centrifugation qui ne colleront pas aux tissus disséqués.Pour ce faire, recouvrez les embouts et les tubes avec un pour cent d'albumine sérique bovine dissoute dans de l'eau. Pour fixer les tissus disséqués, remplissez les tubes transparents recouverts avec zéro virgule cinq millilitre de paraformaldéhyde frais à quatre pour cent dans du PBS, puis transférez-y les tissus fraîchement disséqués. Ensuite, placez les tissus à température ambiante à l'abri de la lumière afin d'éviter la photodégradation, et incubez-les de 20 à 30 minutes avec une rotation douce pour baigner les tissus dans le fixateur tout en évitant de les endommager.Des fixations plus longues peuvent entraîner une coloration sous-optimale des tissus. Pour éliminer le paraformaldéhyde et amorcer la perméabilisation membranaire des tissus fixés, retirer délicatement la solution de paraformaldéhyde à l’aide d’une pipette à embout revêtu et laver les tissus trois fois avec 0,5 mL de PBST. Pour terminer la perméabilisation des tissus et bloquer les liaisons non spécifiques lors des étapes suivantes de coloration, incuber les tissus dans 0,5 mL de PBST contenant 1 % de BSA à 4 °C pendant la nuit, à l’abri de la lumière, avec une rotation douce.Le lendemain, retirez la solution de PBST contenant l'albumine de sérum bovin en lavant les tissus perméabilisés trois fois avec 0,5 mL de PBST. Afin de visualiser les différentes structures tissulaires, effectuez une double coloration de l'ADN nucléaire et de l'F-actine cytoplasmique en incubant les tissus préparés dans 0,5 mL de PBST contenant le colorant nucléaire bleu Hoechst 33342 et le phalloïdine marquée Alexa Fluor 633 pour l'F-actine, pendant une heure à température ambiante sous agitation douce. Éliminez l'excès de colorant en lavant les tissus trois fois avec 0,3 mL de PBST.Incuber chaque lavage pendant cinq minutes à température ambiante avec une rotation douce. Retirer soigneusement toute la solution des tissus dans le tube à l’aide d’une micro-pipette. Pour préserver le signal fluorescent pendant l’imagerie, ajouter 200 microlitres d’agent de montage anti-décoloration recouvrant complètement les tissus.Incuber les tissus de une à trois heures à température ambiante, ou à quatre degrés Celsius toute la nuit. Idéalement, les tissus qui ont complètement absorbé l'agent de montage couleront au fond du tube. Avant de monter les tissus, nettoyer la lame de verre avec de l'eau ou de l'éthanol à 70 %.Appliquez de la vaseline sur la lame de verre et sur la lamelle afin d'éviter de détruire les tissus par une compression excessive. Ensuite, transférez les tissus avec l'agent de montage sur la lame de verre. Éliminez tout excès d'agent de montage à l'aide d'un papier absorbant.Enfin, scellez la lamelle en appliquant du vernis à ongles sur tout le pourtour. Pour commencer, placez la lame sur la platine d'un microscope inversé. Puis capturez les images des cellules à l'aide d'un objectif Plan-Apochromat 20x avec une ouverture de 0,8.Prenez quelques images de test à faible résolution afin de vérifier un plan de tuilage d'image qui couvrira la région d'intérêt, qui correspond dans ce cas au système complet des organes internes de la mouche. Configurez la séquence d'images en commençant par la longueur d'onde d'excitation la plus longue et en terminant par la longueur d'onde d'excitation la plus courte. Cela permettra de minimiser la photodégradation, qui augmente aux courtes longueurs d'onde.Ensuite, acquérez des images avec une résolution suffisamment élevée. Chaque image doit chevaucher l'image suivante de 10 % afin d'assurer un assemblage correct. Collectez de deux à huit balayages d'imagerie par tuile pour réduire le bruit de fond.Pour éliminer l'ombre entre les tuiles d'images provenant du contraste interférentiel différentiel (DIC), prendre une image de référence en mode DIC dans une région vide. Ensuite, effectuer une correction d'ombre sur l'image en tuiles à l'aide de l'image de référence en mode DIC. Il s'agit d'une mouche transgénique marquée pour les caspases, récemment éclosée, disséquée, montrant les pièces buccales, le préœsophage, le jabot, l'intestin moyen, l'intestin postérieur, l'anus, l'oviducte et les ovaires.Par microscopie confocale, l'activité des caspases est visualisée sous forme de fluorescence RFP, indiquant une activité caspase récente, et de fluorescence GFP, indiquant une activité caspase passée. Des images agrandies révèlent l'activité des biocapteurs RFP et GFP dans le lobe optique, la cardie, le tube digestif moyen, le tube digestif postérieur et l'oviducte. Des cellules spécifiques le long des tubules de Malpighien montrent de manière marquée à la fois la RFP et la GFP, indiquant une activité caspase persistante.En revanche, aucune activité de biosenseur RFP ou GFP n'était exprimée dans les chambres œufs, bien que le biosenseur soit exprimé dans les cellules musculaires situées entre les chambres œufs, comme en témoigne une double coloration avec la coloration de l'actine F. Toutefois, les cellules des chambres œufs sont capables d'activer les caspases si les mouches sont soumises à un stimulus de mort cellulaire tel qu'une privation de nourriture ou un choc thermique, ce qui provoque la destruction du noyau et une activation massive des caspases, selon les résultats d'immunohistochimie. Le traceur de caspase apparaît probablement précocement, puis est ultérieurement détruit au cours de la mort cellulaire.Dans le lobe optique du cerveau de drosophile porteur du traceur de caspase en bonne santé, une activité du biocapteur est détectée dans des cellules saines qui semblent être des neurones, selon une double coloration avec un marqueur pan-neuronal, l'anticorps anti-ELAVI. Cela suggère un rôle de l'activité des caspases non apoptotiques dans les neurones. D'autres stratégies peuvent être utilisées pour démontrer la survie à long terme de cellules présentant une activité caspase, comme l'extinction de l'expression du biocapteur à l'aide d'outils génétiques.Par exemple, GalADTS qui inhibe Gal4. Le traceur de caspase signale spécifiquement l'activité de la caspase, tandis que le capteur biologique témoin non clivable, DQVA, n'est pas activé. Le seul signal observé sur les témoins est dû à l'autofluorescence provenant du cuticule résiduel au niveau des pièces buccales et de l'anus, ainsi que de la nourriture ingérée, les levures, présentes dans le jabot et le cardia.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser le capteur biologique de caspase pour suivre l'activité des caspases non apoptotiques chez la drosophile. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'inclure des contrôles négatifs afin de distinguer les signaux du capteur biologique de la fluorescence intrinsèque. Par exemple, la cuticule et les corps gras produisent une forte fluorescence intrinsèque chez les mouches, qu'elles expriment ou non le capteur.La version actuelle du biocapteur de suivi des caspases est conçue pour détecter la caspase active DRICE. D'autres applications pourraient inclure des biocapteurs spécifiques à différentes caspases, en remplaçant le site de clivage reconnu par DRICE par le site de clivage reconnu par d'autres caspases.

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