Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l'étude Therapeutics Anti-cancer

L’objectif global de cette procédure est d’observer la réponse thérapeutique anticancéreuse dans des cellules uniques en culture. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, notamment la réponse thérapeutique hétérogène et le destin cellulaire. Pour commencer, sous une hotte à flux laminaire stérile certifiée, préparez les cellules HT1080 dans des boîtes certifiées pour la culture selon le protocole textuel et incubez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié.

Deux jours avant l’imagerie, plaquez 50 000 cellules HT1080 FuGENE par puits dans le nombre souhaité de puits d’une parabole à fond de verre n° 1,5 de 12 puits. Ajustez le nombre de cellules plaquées en fonction de leur taux de croissance et de la parabole utilisée afin d’obtenir une confluence d’environ 60 % pour le début de l’expérience.

Réglez la chambre environnementale à environ 80 % d’humidité avec la température à la position de l’échantillon réglée à 37 degrés Celsius. Assurez-vous que le réservoir d’eau est rempli d’eau distillée stérile en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, allumez la chambre environnementale à la température souhaitée, positionnez-la dans la platine et le réglage du microscope.

S’il y a un espace libre entre la chambre supérieure de la scène et l’insert de la scène, posez des morceaux de film de paraffine sur les bords de l’ouverture de l’insert de la scène, avant d’y insérer la chambre, pour coupler la chambre à la scène. Assurez-vous qu’aucune connexion ne tire sur la chambre, ce qui peut introduire des artefacts de mouvement. Insérez un plat factice avec de l’eau dans la chambre et laissez la chambre s’équilibrer à 37 degrés Celsius, puis maintenez une température stable.

Pour configurer l’imagerie, allumez le microscope, l’ordinateur et tous les périphériques requis. Selon la source lumineuse, attendez de l’allumer jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Avec la tourelle d’objectif en position basse, sélectionnez l’objectif à ouverture numérique 20x 0,7.

Positionnez ensuite l’échantillon au-dessus de l’objectif, ce qui facilitera la recherche des cellules lorsque l’échantillon est dans la chambre. Après avoir transféré les cellules à imager dans la chambre environnementale, selon le protocole de texte, scellez la chambre pour maintenir un environnement stable et allumez le gaz atmosphérique. Ensuite, choisissez les conditions d’imagerie qui empêcheront la phototoxicité en limitant les temps d’exposition et en utilisant une lumière de faible intensité.

Pour trouver les plans X, Y et Z et les longueurs d’onde souhaitées pour chaque position à imager. Pour un laps de temps à long terme de la plupart des processus cellulaires, acquérez une image toutes les dix à vingt minutes. Une résolution temporelle plus élevée fournit plus de points de données et un suivi de cellule plus robuste, mais entraîne une exposition à la lumière plus intégrée et des ensembles de données plus volumineux.

Comme HT1080 FuGENE a des protéines phlorescentes vertes et rouges dynamiques, utilisez les temps d’exposition suivants et utilisez un bac deux par deux. Sous les paramètres avancés, activez la mise au point automatique contrôlée par logiciel à l’aide des paramètres par défaut. Définissez une plage de mise au point automatique de 10 micromètres avec la taille de pas recommandée.

Dans la boîte expérimentale, pour réduire la dérive thermique, remplacez la moitié du milieu par un milieu contenant le médicament souhaité qui a été chauffé à 37 degrés Celsius. Enfin, lancez le time lapse et acquérez des images selon le protocole texte. Ces films montrent des exemples d’une paire de lignées cellulaires MCF7 dérivées du cancer du sein appariées qui ne diffèrent que par leur statut p53 et qui ont été traitées avec un médicament anticancéreux qui inhibe la kinésine-5, entraînant un arrêt mitotique.

Comme le montre cette figure, lorsque p53 est éliminé par un knockdown stable de p53, au lieu de s’arrêter après avoir quitté la mitose, les cellules passent par des cycles répétés où elles entrent dans un deuxième cycle de mitose plutôt que de s’arrêter, et quittent la mitose sans division. On voit ici des cellules Hela dérivées d’un carcinome cervical exprimant de manière stable le marqueur de chromatine Histone 2b fusionné à mCherry et la bêta-tubuline fusionnée à EGFP. Lorsqu’il est traité avec le paclitaxol, un médicament stabilisateur de microtubules, l’alignement et la ségrégation des chromosomes sont perturbés pendant la mitose, ce qui entraîne la formation de renflements nucléaires et de micronoyaux sujets aux dommages à l’ADN.

Cette lignée cellulaire coexprime de manière stable les deux indicateurs phlorescents du cycle cellulaire de l’ubiquitine pour CDT1, en orange, et la géminine en vert, et progresse normalement dans le cycle cellulaire. Lorsque les mêmes cellules sont traitées avec l’inhibiteur de CDK46, les cellules progressent à travers la phase G2 et se divisent normalement, puis s’arrêtent fortement en phase G1, indiquant le potentiel d’effets cytostatiques affectifs dans les tumeurs en croissance. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez suivre la réponse d’une seule cellule, directement, en temps réel sur plusieurs jours plutôt que de déduire ces réponses.