Name: Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour létude Therapeutics Anti-cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Découvrez la microscopie time-lapse pour suivre les réponses thérapeutiques anti-cancéreuses au niveau des cellules individuelles HT1080 et HeLa. Cette méthode révèle l'hétérogénéité des réponses cellulaires en temps réel.

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Nous remercions Joshua Marcus pour son soutien technique et Jolien Tyler, Ph.D., directrice de la plateforme de microscopie optique Richard J. McIntosh, pour ses conseils techniques. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Université du Colorado à Boulder et de l’Université du Colorado à Boulder Graduate School à J.D.O. R.T.B. est partiellement soutenu par une subvention de formation pré-doctorale du NIH (T32 GM008759). Nous remercions Karyopharm Therapeutics, Inc. pour le selinexor et Merck Serono pour l’inhibiteur de la kinésine-5. Les plasmides FUCCI proviennent d’Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japon) via MTA. mCherry-BP1-2 provenait d’Addgene. HeLa exprimant H2b-mCherry et β-tubuline-EGFP sont de Daniel Gerlich (IMBA, Académie autrichienne des sciences, Autriche).

Le protocole suivant utilise des paramètres définis par les expériences sur les figures 4 et 6 en ce qui concerne les paramètres d&#39;acquisition et les conditions expérimentales. Bon nombre de ces paramètres peuvent être modifiés pour adapter d&#39; autres expériences (c. -à- temps d&#39;exposition, binning, canaux fluorescents, etc.). Toutes les procédures doivent respecter les directives et les règlements institutionnels et être approuvé par le comité de biosécurité institutionnelle. sites fabricant de Microscope contiennent d&#39;excellentes informations pour l&#39;imagerie des cellules vivantes. 1. Microscopes et logiciel d&#39;imagerie <ol><li> Effectuer l&#39;imagerie cellulaire en direct sur une grande variété de microscopes inversés. Les microscopes les plus courants sont Widefield épifluorescence et filature disque confocale. Ici, utiliser un microscope automatisé et motorisé Widefield épifluorescence avec une source de lumière aux halogénures métalliques de 200 watts. </li><li> Obtenir un stade supérieur ou microscope chambre environnementale. Ici, utiliser une étape-tchambre environnementale op. </li><li> Utilisez un logiciel commercial pour faire fonctionner des microscopes avec des utilitaires pour exécuter la microscopie time-lapse. </li><li> Utilisez un logiciel disponible dans le commerce ou ImageJ pour l&#39;analyse d&#39;image. Beaucoup d&#39; autres outils d&#39;analyse sont disponibles dans le commerce, et il existe des programmes sur mesure dont beaucoup ont été publiées 8,18. </li></ol> 2. Visualisation des processus cellulaires et réponses phénotypiques <ol><li> Visualisez les cellules par microscopie en fond clair. Contraste d&#39;interférence différentiel et contraste de phase seul peut être très instructif d&#39;étudier les réponses aux réponses aux médicaments anti-cancer. Ces procédés peuvent comprendre la mitose, la motilité cellulaire et l&#39;apoptose. </li><li> Visualiser les structures cellulaires, les organelles et les procédés de biocapteurs fluorescents. Les sondes fluorescentes sont informatives dans le suivi des processus subcellulaires spécifiques. Ceux-ci peuvent inclure la dynamique des microtubules, des mitochondries et la dynamique du réticulum endoplasmique, l&#39;accumulation de protéines et la localisation, etsignalisation moléculaire (par exemple., la phosphorylation, le calcium). </li></ol> 3. Préparation des échantillons <ol><li> Cultiver des cellules en culture cellulaire plats certifiés par une norme, un incubateur de culture cellulaire humidifiée (par exemple 37 ° C, 5% de CO2, 80% d&#39; humidité relative). <ol><li> Cultiver les cellules HT1080 dans du MEM avec EBSS. Compléter le support avec 10% v / v de FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / pyruvate de sodium v ​​et 1% v / v d&#39;acides aminés non essentiels. </li></ol></li><li> Deux jours avant l&#39;imagerie, les cellules plaque 50.000 HT1080 Fucci dans 3 puits d&#39;un # 1.5 verre plat en bas de 12 puits dans une hotte laminaire d&#39;écoulement stérile certifié. Ajuster le nombre de cellules ensemencées pour atteindre ~ 60% de confluence pour le début de l&#39;expérience. En fonction de la lignée cellulaire et de la nature de l&#39;expérience, la densité cellulaire peut être inférieure. Remarque: La densité cellulaire peut avoir une influence profonde sur la croissance de la lignée cellulaire et les résultats expérimentaux. Compter les cellules afin de minimiser l&#39;expérience à l&#39;expérience variability en raison de la densité. <ol><li> Selon la chambre de l&#39;environnement et les conditions nécessaires à l&#39;expérience, les cellules de la plaque dans des boîtes à puits unique (typiquement 35- ou 60-mm), 4 bien des plats de 35 mm, 6, 12 ou 24 plaques de culture cellulaire, ou Coverslip diapositives dans divers formats. Utiliser des plaques de verre à fond avec # 1.5 verre comme la plupart des lentilles de l&#39;objectif sont optimisés pour cette épaisseur de verre, et de l&#39;imagerie par culture cellulaire en plastique est très pauvre. Remarque: Certaines lignées de cellules ne se développent pas et survivent sur le verre. Dans ces cas, le verre peut être revêtue afin d&#39;améliorer l&#39; adhérence des cellules (par ex., La poly-lysine ou de collagène). Certaines entreprises fabriquent optique culture cellulaire en plastique, il doit être déterminé de manière empirique si cela est une option viable. </li></ol></li></ol> 4. Chambre de l&#39;environnement Set-up <ol><li> Avant toute expérimentation, mise en place de la chambre de l&#39; environnement afin qu&#39;il fonctionne à ~ 80% d&#39; humidité et ainsi de la température à la position de l&#39; échantillon est de 37 o C. La plupart des cellules en culture croissent dans 5% de CO 2 / équilibre atmosphère d&#39;air due à un tampon de bicarbonate de sodium dans le milieu. En fonction de la mise en place, soit définir le contrôleur de l&#39; environnement à 5% de CO 2 et il se mélange à 100% de CO 2 avec de l&#39; air, ou pré-mélangé, certifié gaz de l&#39; air 5% de CO 2 / de l&#39; équilibre. Suivez les instructions du fabricant pour des débits de gaz. Remarque: Certaines lignées cellulaires se développent dans CO 2 moyen -indépendante auquel cas ils peuvent être maintenus sans CO 2. Spécialement conçu support de formation d&#39;image est également disponible, qui limite l&#39;addition de composés autofluorescentes. La croissance des thèses médiums pour le type cellulaire souhaité doit être déterminée empiriquement au préalable. </li><li> Avant imagerie, d&#39;assurer le réservoir d&#39;eau est rempli (en suivant les instructions du fabricant) avec de l&#39;eau distillée stérile. Allumez la chambre de l&#39;environnement à la température désirée et le placer dans l&#39;encart de platine du microscope. Pour économiser de l&#39;essence, ne commencez pas le débit à ce point. Remarque: S&#39;il y a un espace libre entre la chambre stade supérieur et encart de scène et / ou de toute tension sur la connexion des cordons à la chambre, il peut introduire des artefacts de mouvement dans l&#39;expérience. <ol><li> Lay morceaux de pellicule de paraffine sur les bords de l&#39;insert d&#39;ouverture de scène avant d&#39;insérer la chambre en elle pour coupler la chambre à l&#39;étage, et assurez-vous qu&#39;aucune connexion tirent sur la chambre. </li></ol></li><li> Laisser la chambre à équilibrer à 37 o C. Maintenir une température stable pour éviter les fluctuations de température lors de l&#39;imagerie qui peut affecter la physiologie cellulaire et d&#39;introduire la dérive. Atteindre l&#39;équilibre de température nécessite généralement 30 min à 1 h, en fonction de l&#39;environnement. <ol><li> Insérez un plat «factice» avec de l&#39;eau dans les puits dans la chambre tout en chauffant. Un plat d&#39;imagerie rempli d&#39;eau imite l&#39;échantillon, qui aidera à assurer la chambre est suffisamment réchauffé et stabilisé. Remplir la chambre avec de l&#39;eau stérile préchaufféeréduit le temps nécessaire à la stabilisation de la température et réduit au minimum la diminution de la température lors de l&#39;addition de l&#39;échantillon expérimental. </li></ol></li></ol> 5. Microscope Set-up <ol><li> Allumez le microscope, ordinateur associé, et tous les périphériques nécessaires. <ol><li> En fonction de la source de lumière, attendez pour l&#39; allumer jusqu&#39;à ce que nécessaire (par ex., LED). </li></ol></li><li> Avec la tourelle objectif dans une position basse, sélectionnez l&#39;objectif 20X 0,7 NA à utiliser. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur l&#39;objectif - ce sera plus facile de trouver les cellules lorsque l&#39;échantillon est dans la chambre. </li><li> Définir les paramètres d&#39;imagerie à ce moment si elles sont connues des expériences précédentes. </li></ol> 6. Le transport des cellules à Microscope et dans la chambre <ol><li> Transport des cellules à imager de l&#39;incubateur à la chambre de l&#39;environnement. Assurez -vous que cela soit fait rapidement pour limiter les effets d&#39;une relativement faible CO 2 </sub&gt; atmosphère et une diminution de la température sur les cellules. Suivez toutes les directives de biosécurité institutionnelles pour le transport des échantillons et de nettoyage en cas de déversement. <ol><li> Placez les cellules dans un récipient en polystyrène étanche ou un sac isolé pour éviter les grands changements environnementaux. </li></ol></li><li> Insérez le plat d&#39;imagerie de l&#39;échantillon dans la chambre en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Après que les cellules ont été fixés à l&#39;intérieur de la chambre de l&#39;environnement, sceller la chambre pour maintenir un environnement stable et tournez immédiatement à la source (s) de gaz atmosphérique. <ol><li> Comme certaines chambres environnementales n&#39;utilisent pas un virage serré, couvercle étanche, pour retarder l&#39;évaporation, la couche stérile, l&#39;huile minérale certifiée embryon au-dessus du milieu de croissance. Enveloppez film de paraffine perméant gaz autour du périmètre bords du plat de l&#39;échantillon en faisant attention à ne pas obstruer la zone d&#39;imagerie en verre. , les méthodes d&#39;humidification secondaires localisées peuvent être employées. Condensation sur le couvercle de la boîte d&#39;échantillon peut diminuer performance de la microscopie en fond clair. </li></ol></li><li> Afin de minimiser les effets de la dérive thermique tôt au cours de l&#39;expérience, attendez 30 minutes avant de commencer le time-lapse. Le temps nécessaire varie en fonction de la taille du plat d&#39;imagerie et d&#39;autres facteurs. Déterminer de façon empirique. </li></ol> 7. Configuration de l&#39;imagerie <ol><li> Sélectionnez les conditions d&#39;imagerie qui représenteront le mieux les données. Prendre des précautions pour éviter la phototoxicité en limitant les temps d&#39;exposition, en utilisant la lumière d&#39;intensité plus faible et la sélection des sondes qui sont excités par des longueurs d&#39;onde de la lumière. </li><li> Définir x, y et z plane et la longueur d&#39;onde souhaitée (s) pour chaque position à imager. La résolution temporelle est limitée par le nombre de positions et de longueurs d&#39;onde. Pour long terme time-lapse de la plupart des processus cellulaires, acquérir une image toutes les 10 - 20 min; de plus haute résolution temporelle (intervalles courts, par exemple., 1 min) fournit plus de points de données et le suivi des cellules donc plus robuste, mais entraîne également plus intégréeexposition à la lumière et de plus grands ensembles de données. <ol><li> Comme HT1080 FUCCI ont des protéines dynamiques fluorescentes vert et rouge (voir résultats représentatifs), utiliser les durées d&#39;exposition suivantes: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, fond clair - 20 msec. Utilisez un bac 2 x 2. </li></ol></li><li> Activer le logiciel autofocalisation contrôlé en utilisant les paramètres par défaut dans les paramètres avancés. Définir une plage de mise au point automatique de 10 pm avec la taille de l&#39;étape recommandée. Assurez-vous de le faire avant de commencer le time-lapse. Autofocus avec des images en fond clair et jamais avec fluorescence pour réduire la phototoxicité et photoblanchiment. <ol><li> Utilisez un logiciel contrôlé des systèmes de mise au point automatique sur un microscope avec une platine motorisée, et se concentrer directement sur l&#39;échantillon. Cependant, ils ne peuvent limiter la vitesse d&#39;acquisition de l&#39;expérience. Hardware contrôlé systèmes de focalisation en continu fonctionnent bien pour la microscopie time-lapse et d&#39;améliorer la vitesse, permettant plusieurs positions à imager ou un taux d&#39;acquisition plus élevé. Cependant, ilscompter sur la détection de l&#39;interface air-verre et peut perdre le focus de l&#39;échantillon avec des variations dans l&#39;épaisseur du verre à travers le puits. </li></ol></li><li> Remplacer la moitié du milieu par un milieu contenant la concentration de médicament désiré qui a été chauffé à 37 ° C le remplacement des médias partiel contribue à réduire la dérive thermique. Les conditions de cette expérience sont des véhicules (DMSO), 1 uM selinexor et 10 uM PD0332991. Remarque: Cette étape peut également être effectuée après le démarrage de l&#39;acquisition par une pause et de redémarrer l&#39;expérience. Cela permet un suivi longitudinal des réponses pré- et post-médicament de cellules individuelles. Si la stabilité ou le métabolisme drogue est une préoccupation, une pause et le remplacement des médias peut être fait avec la même méthode. Pour tester la dégradation du médicament ou du métabolisme, des médias à partir de cellules traitées peuvent également être placés sur des cellules naïves pour tester l&#39;action des médicaments. </li><li> Démarrez le time-lapse. </li><li> Comme le time-lapse fonctionne, vérifiez que les champs imagées restent au point et l&#39;chamber maintient une humidité de 37 o C. <ol><li> Réglez la mise au besoin en arrêtant l&#39;acquisition au cours de l&#39;intervalle de temps entre les points de temps. </li></ol></li><li> Si nécessaire, ajouter de l&#39;eau à la chambre lors des expériences plus longues. Éviter de refroidir la chambre en ajoutant de l&#39; eau distillée stérile préchauffée à 37 ° C. </li></ol> 8. Mettre fin à la Time-lapse <ol><li> Lorsque l&#39;expérience a exécuté jusqu&#39;à la fin, arrêtez l&#39;acquisition si elle n&#39;a pas été définie pour arrêter automatiquement. </li><li> Assurez-vous que le time-lapse a été enregistré correctement sur le disque dur, bien que la plupart des logiciels enregistrent automatiquement lors de l&#39;acquisition si pas fini correctement les données peuvent être perdues. </li><li> Retirer la chambre du microscope et de disposer des cellules dans les déchets biologiques en suivant les procédures de biosécurité institutionnelle approuvés. </li></ol> 9. Suivi longitudinal et analyse des données Time-lapse <ol><li> Choisissez la méthode d&#39;analyse qui estappropriés pour les processus biologiques d&#39;intérêt. De nombreux plugins pour ImageJ, les programmes utilisant MatLab, et les plates-formes personnalisées ont été produits pour des applications spécifiques. La méthodologie suivante concerne le suivi des noyaux et l&#39; analyse des sondes fluorescentes nucléaires , comme montré sur les figures 4 et 5. </li><li> Ouvrez les piles d&#39;images .tif pour les canaux utilisés dans ImageJ. Sinon, les fichiers natifs ouverts à partir du programme d&#39;acquisition directement dans ImageJ en utilisant le plugin Bioformats. </li><li> Dessinez une région d&#39;intérêt (ROI) dans le noyau d&#39;une cellule en utilisant l&#39;image de fond clair ou le canal d&#39;étiquette nucléaire (le cas échéant) et l&#39;ajouter au gestionnaire de ROI. Remarque: Si les cellules imagées ont une étiquette nucléaire (par exemple, histone H2B-EGFP.), Puis le suivi automatique des cellules peut être utilisé pour créer des régions d&#39;intérêt (ROI) représentant des noyaux individuels à travers le temps. </li><li> Passer au prochain point de temps et de positionner le retour sur investissement dans le même nucleus. Ajouter le retour sur investissement pour le gestionnaire de ROI. </li><li> Continuer de suivre et de faire ROIs pour la cellule individuelle jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est un événement cellulaire (mitose, apoptose, etc.) Ou la cellule ne peut plus être suivi (ie., Se déplace hors du cadre ou l&#39;expérience se termine). </li><li> Lorsque ROIs ont été établies pour les cellules à travers le temps, ils sont sur le terrain, les superposer sur les canaux fluorescents d&#39;intérêt. Mesurer l&#39;intensité moyenne de la fluorescence dans chaque canal pour chaque point temporel. Enregistrer la liste de retour sur investissement pour une utilisation ultérieure. <ol><li> Diverses mesures peuvent être effectuées à l&#39;intérieur de la ROI pour des applications dans différentes expériences. Cliquez sur Analyse → Set mesures ... pour faire apparaître un menu pour choisir la méthode d&#39; analyse (par exemple., L&#39; intensité dans le retour sur investissement, d&#39;intensité intégrée, etc signifie.). </li></ol></li><li> Notez le destin des cellules pour les cellules individuelles (par exemple., L&#39; apoptose, la division, la survie) , tandis que le suivi. Ceci permet la création de courbes de survie et furtheanalyse de la population de r. </li><li> Avec l&#39;intensité moyenne pour les deux canaux, créer un nuage de points pour afficher la dynamique du cycle cellulaire en réponse à la thérapeutique (figure 5B, C). Note: Les parcelles peuvent être créées pour des cellules individuelles dans le temps ou en moyenne sur une population de cellules chenillés. l&#39;imagerie quantitative peut être critique pour l&#39;établissement des réponses complexes et des relations de cellule en réponse à la thérapeutique du cancer. Vidéomicroscopie à long terme, le suivi longitudinal et l&#39; analyse des données est un processus en plusieurs étapes, avec de nombreuses options pour le type d&#39;outils de microscopie et d&#39; analyse, et suit le schéma général présenté à la figure 1. </li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Avantages de Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal Le microscope est un instrument idéal pour des études longitudinales de la réponse aux médicaments car il permet aux enquêteurs de suivre les cellules individuelles et leurs destins ainsi que l&#39;ensemble de la population. Variabilité dans la réponse aux médicaments au sein d&#39;une population de cellules est un enjeu majeur pour la conception thérapeutique anti-cancer. Le suivi longitudinal des...

La microscopie des cellules vivantes et le suivi longitudinal des cellules individuelles ne sont pas une nouvelle technique. Dès les premiers microscopes, les amateurs et les scientifiques ont observé et étudié des cellules individuelles et les organismes, leurs comportements, et le développement 1-3. Un exemple célèbre de la fin David Rogers à l&#39; Université Vanderbilt dans les années 1950 montre un neutrophile humaine dans un frottis sanguin chassant une bactérie Staphylococcus aureus et éventuellement le processus de phagocytose 4. Ce film live-cellule est une excellente illustration de la façon dont les processus multiples peuvent être observés et corrélées en une seule expérience: détection d&#39;un gradient chimique, mécanique et de la vitesse de la motilité cellulaire, cellule façonne la dynamique, l&#39;adhérence et la phagocytose d&#39;un agent pathogène. L&#39;avènement des microscopes entièrement automatisés et des caméras numériques très sensibles a donné lieu à un nombre croissant de chercheurs en utilisant la microscopie à poser des questions fondamentales en biologie cellulaire allant from comment les cellules se déplacent 5,6 et 7,8 à diviser organite dynamique et le trafic membranaire 9-11. Non-fluorescent, la microscopie en fond clair, y compris à contraste de phase (PC), qui a recueilli le prix Nobel de Frits Zernike en 1953, et le contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) permettre l&#39;observation des cellules et des noyaux, mais aussi des structures sous-cellulaires, y compris les faisceaux de microtubules , les chromosomes, les nucléoles, la dynamique des organites et des fibres d&#39;actine épaisses 12. Génétiquement codés protéines fluorescentes et le développement des colorants fluorescents contre organites ont considérablement influencé time-lapse microscopie 13-15. Bien que pas l&#39;objet de cet article, l&#39; imagerie en sphéroïdes cellulaires et in situ (microscopie intravitale) en utilisant la microscopie confocale et multiphotonique représentent une autre expansion de l&#39;approche, et il y a des articles en suspens qui utilisent et traitent de ces approches 16-19. Les réponses des cellules à l&#39;anti-cancmédicaments er ou de produits naturels sont déterminés à l&#39;échelle moléculaire et cellulaire. Comprendre le traitement des réponses cellulaires et sorts suivants implique souvent la population (par exemple , des analyses moyennes., Immunoblot, des mesures entières de puits), ou points de temps fixes avec détection par immunofluorescence et la cytométrie de flux, qui mesurent des cellules individuelles. Hétérogénéité dans les réponses des cellules individuelles à des médicaments au sein d&#39;une population, en particulier dans les tumeurs, peut expliquer en partie la variabilité de la réponse observée dans les lignées cellulaires et les tumeurs qui sont traités avec le même médicament à saturation. À long terme des approches longitudinales de suivre une seule cellule donnée ou une population de cellules est une approche moins commune , mais très puissant qui permet l&#39;étude directe des voies de réponse moléculaire, différents phénotypes (par exemple., La mort cellulaire ou la division cellulaire), l&#39; observation de la variabilité de cellule à cellule dans une population, et comment ces facteurs contribuent à la dynamique de la réponse de la population 20-22. Optimiste, pouvoird&#39;observer et de quantifier les réponses des cellules individuelles contribuera à améliorer notre compréhension de la façon dont les médicaments fonctionnent, pourquoi ils ne parviennent pas toujours, et comment les utiliser au mieux. La technique de la microscopie à long terme time-lapse, suivi longitudinal, et l&#39; analyse des réponses des médicaments est disponible pour de nombreux chercheurs et peut être simple, en utilisant la lumière uniquement transmis à observer le phénotype des réponses 20,21. Les principales composantes de l&#39;approche comprennent: la préparation appropriée des cellules d&#39;intérêt, un microscope automatisé avec la chambre de l&#39;environnement, un appareil photo intégré à un ordinateur pour acquérir et stocker les images, et le logiciel pour examiner le time-lapse et de mesurer et d&#39;analyser les cellules et tous les biocapteurs fluorescents. Nous fournissons un protocole détaillé avec de nombreux conseils pour la conduite Vidéomicroscopie des cellules cultivées aussi longtemps que plusieurs jours en utilisant clair et / ou microscopie épifluorescence widefield. Ce protocole peut être utilisé pour toute lignée cellulaire qui peut être cultivée dans une culturepour étudier les réponses aux traitements anti-cancéreux. Nous fournissons des exemples de données acquises et analysées en utilisant plusieurs différents biocapteurs fluorescents génétiquement codés et un exemple de la microscopie à contraste de phase, discuter brièvement les différents types de sondes, les avantages et les inconvénients à long terme time-lapse et le suivi longitudinal, ce qui peut être appris pour cette approche qui est difficile à comprendre des approches non-directes, et quelques variations que nous espérons être d&#39;intérêt et de la valeur pour les chercheurs inexpérimentés qui ne l&#39;ont pas envisagé d&#39;utiliser l&#39;approche et à des chercheurs expérimentés.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>médicament stabilisateur des microtubules</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>inhibiteur de la topoisomérase II</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1 inhibiteur, cadeau</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la kinésine-5</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>cadeau, également disponible auprès de American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Milieu de croissance cellulaire</td><td>HyClone (Fisher) ou Mediatech</td><td></td><td>de nombreuses entreprises disponibles</td></tr><tr><td>5 % de CO2/air d’équilibre, certifié</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>Antenne de 35 mm, fond en verre de 20 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>de nombreuses entreprises disponibles</td></tr><tr><td>Antenne de 35 mm à 4 puits, fond en verre de 20 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>de nombreuses entreprises disponibles</td></tr><tr><td>Antenne parabolique de 35 mm, fond en verre quadrillé</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>de nombreuses entreprises disponibles</td></tr><tr><td>Multi-puits, fond en verre</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>de nombreuses entreprises disponibles</td></tr><tr><td>Olympus IX81 microscope à épifluorescence inversée</td><td>Olympus Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB contrôleur</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Platine motorisée Proscan III</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>Chambre STEV</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ÉCU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Unité de contrôle de l’environnement</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ÉCU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD avec contrôleur</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon lancement laser</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHAMBRE D’INCLUBATION TOKAI HIT</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

through the looking glass: time-lapse microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l&#39;étude therapeutics anti-cancer

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

La réponse des cellules individuelles aux médicaments anti-cancer contribue de manière significative dans la détermination de la réponse de la population, et est donc un facteur important dans le résultat global. Immunoblotting, la cytométrie en flux et les expériences cellulaires fixes sont souvent utilisés pour étudier comment les cellules répondent aux médicaments anti-cancéreux. Ces méthodes sont importants, mais ils ont plusieurs lacunes. Variabilité dans les réponses de la drogue entre le cancer et les cellules normales, et entre les cellules d&#39;origine du cancer différents, transitoires et réponses rares sont difficiles à comprendre en utilisant des tests population de moyenne et sans être en mesure de suivre et de les analyser longitudinalement directement. Le microscope est particulièrement bien adapté à des cellules vivantes d&#39;image. Les progrès réalisés dans la technologie permettent de routinière les cellules d&#39;image à une résolution qui permet non seulement le suivi des cellules, mais également l&#39;observation d&#39;une variété de réponses cellulaires. Nous décrivons une approche en détail qui permet l&#39;imagerie en continu time-lapse deles cellules au cours de la réponse à un médicament pour l&#39;essentiel aussi longtemps que souhaité, typiquement jusqu&#39;à 96 h. Utilisation de variations de l&#39;approche, les cellules peuvent être surveillés pendant des semaines. Avec l&#39;emploi des codés génétiquement biocapteurs fluorescents de nombreux processus, les voies et les réponses peuvent être suivies. Nous montrons que des exemples comprennent le suivi et la quantification de la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire, la dynamique des chromosomes, des lésions de l&#39;ADN et la mort cellulaire. Nous discutons également des variations de la technique et de sa flexibilité, et mettre en évidence certains pièges courants.

À long terme de la microscopie time-lapse et le suivi longitudinal directe permet l&#39;étude de nombreux effets anti-cancer pendant la réponse aux médicaments. Après les grandes lignes de la figure 1, plusieurs exemples de cellules sont présentés exprimant reporters fluorescents validés traités avec des médicaments anti-cancéreux, suivis et analysés en utilisant des approches différentes. Phase microscopie à ...

Ici, nous décrivons une méthode de microscopie à intervalle de temps à long terme pour suivre longitudinalement des cellules uniques en réponse à des traitements anticancéreux.

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l&#39;étude Therapeutics Anti-cancer

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

L'objectif général de cette procédure est d'observer la réponse thérapeutique anti-cancéreuse au niveau de cellules individuelles en culture. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, notamment la réponse thérapeutique hétérogène et le destin cellulaire. Pour commencer, sous une hotte à flux laminaire stérile certifiée, préparer les cellules HT1080 dans des boîtes de culture conformes au protocole écrit et incuber les cellules dans une étuve à culture cellulaire humidifiée.Deux jours avant l'imagerie, ensemencer 50 000 cellules HT1080 FuGENE par puits dans le nombre souhaité de puits d'une plaque de 12 puits avec fond en verre no 1,5. Ajuster le nombre de cellules ensemencées en fonction de leur taux de croissance et de la plaque utilisée afin d'obtenir environ 60 % de confluence au début de l'expérience.Configurer la chambre environnementale à environ 80 % d'humidité, avec une température au niveau de l'échantillon fixée à 37 degrés Celsius. S'assurer que le réservoir d'eau est rempli d'eau distillée stérile conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, allumer la chambre environnementale en la réglant à la température souhaitée, la positionner sur la platine du microscope et effectuer les réglages nécessaires.S'il reste un espace libre entre la chambre supérieure de la platine et l'emplacement de la platine, placer des morceaux de film en paraffine sur les bords de l'ouverture de l'emplacement avant d'insérer la chambre, afin de coupler la chambre à la platine. Veiller à ce qu'aucun raccordement ne tire sur la chambre, car cela pourrait introduire des artefacts de mouvement. Insérer une boîte témoin contenant de l'eau dans la chambre, puis laisser la chambre s'équilibrer à 37 degrés Celsius et maintenir une température stable.Pour préparer l'acquisition d'images, allumez le microscope, l'ordinateur et tous les périphériques nécessaires. Selon la source lumineuse, attendez de l'allumer uniquement lorsque cela est nécessaire. Avec le porte-objectifs en position basse, sélectionnez l'objectif 20x d'ouverture numérique 0,7.Ensuite, positionnez l'échantillon au-dessus de l'objectif, ce qui facilitera la localisation des cellules lorsque l'échantillon sera dans la chambre. Après avoir transféré les cellules à imager dans la chambre environnementale conformément au protocole décrit, scellez la chambre afin de maintenir un environnement stable et activez le gaz atmosphérique. Choisissez ensuite des conditions d'acquisition qui préviendront la phototoxicité en limitant les durées d'exposition et en utilisant une lumière d'intensité réduite.Pour déterminer les plans X, Y et Z ainsi que les longueurs d'onde souhaitées pour chaque position à imager. Pour un laps de temps prolongé de la plupart des processus cellulaires, acquérir une image toutes les dix à vingt minutes. Une résolution temporelle plus élevée fournit davantage de points de données et un suivi cellulaire plus robuste, mais entraîne une exposition cumulée à la lumière plus importante et des ensembles de données plus volumineux.Étant donné que les HT1080 FuGENE expriment des protéines fluorescentes vertes et rouges dynamiques, utilisez les temps d'exposition suivants et un binning 2 par 2. Dans les paramètres avancés, activez la mise au point automatique contrôlée par logiciel en utilisant les paramètres par défaut. Définissez une plage de mise au point automatique de 10 micromètres avec la taille de pas recommandée.Dans la boîte expérimentale, pour réduire la dérive thermique, remplacez la moitié du milieu par un milieu contenant le médicament désiré préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius. Enfin, démarrez l'acquisition en laps de temps et recueillez les images conformément au protocole décrit dans le texte. Ces films montrent des exemples d'une paire de lignées cellulaires de cancer du sein dérivées de MCF7, appariées, qui ne diffèrent que par leur statut de p53 et qui ont été traitées avec un médicament anticancéreux inhibant la kinésine-5, entraînant un arrêt mitotique.Comme on le voit sur cette figure, lorsque la protéine p53 est éliminée par une inhibition stable de p53, les cellules, au lieu de s'arrêter après la sortie de la mitose, effectuent des cycles répétés au cours desquels elles entrent dans un second tour de mitose plutôt que de s'arrêter, puis sortent de la mitose sans division. Sont représentées ici des cellules de carcinome du col de l'utérus (Hela) exprimant de façon stable le marqueur de chromatine Histone 2b fusionné à la mCherry et la bêta-tubuline fusionnée à l'EGFP. Lorsqu'elles sont traitées avec le médicament stabilisateur des microtubules, le paclitaxel, l'alignement et la ségrégation des chromosomes sont perturbés pendant la mitose, ce qui entraîne la formation de bourrelets nucléaires et de micronoyaux sujets aux lésions de l'ADN.Cette lignée cellulaire exprime de façon stable les deux indicateurs fluorescents du cycle cellulaire basés sur l'ubiquitine, CDT1 en orange et la geminine en vert, et progresse normalement au cours du cycle cellulaire. Lorsque les mêmes cellules sont traitées avec un inhibiteur de CDK46, elles progressent normalement en phase G2 et se divisent, puis s'arrêtent fortement en phase G1, indiquant un potentiel d'effets cytostatiques efficaces dans les tumeurs en croissance. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de suivre directement, en temps réel et sur plusieurs jours, la réponse d'une cellule unique, plutôt que d'inférer ces réponses.

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