Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l'étude Therapeutics Anti-cancer

L'objectif général de cette procédure est d'observer la réponse thérapeutique anti-cancéreuse au niveau de cellules individuelles en culture. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer, notamment la réponse thérapeutique hétérogène et le destin cellulaire. Pour commencer, sous une hotte à flux laminaire stérile certifiée, préparer les cellules HT1080 dans des boîtes de culture conformes au protocole écrit et incuber les cellules dans une étuve à culture cellulaire humidifiée.

Deux jours avant l'imagerie, ensemencer 50 000 cellules HT1080 FuGENE par puits dans le nombre souhaité de puits d'une plaque de 12 puits avec fond en verre no 1,5. Ajuster le nombre de cellules ensemencées en fonction de leur taux de croissance et de la plaque utilisée afin d'obtenir environ 60 % de confluence au début de l'expérience.

Configurer la chambre environnementale à environ 80 % d'humidité, avec une température au niveau de l'échantillon fixée à 37 degrés Celsius. S'assurer que le réservoir d'eau est rempli d'eau distillée stérile conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, allumer la chambre environnementale en la réglant à la température souhaitée, la positionner sur la platine du microscope et effectuer les réglages nécessaires.

S'il reste un espace libre entre la chambre supérieure de la platine et l'emplacement de la platine, placer des morceaux de film en paraffine sur les bords de l'ouverture de l'emplacement avant d'insérer la chambre, afin de coupler la chambre à la platine. Veiller à ce qu'aucun raccordement ne tire sur la chambre, car cela pourrait introduire des artefacts de mouvement. Insérer une boîte témoin contenant de l'eau dans la chambre, puis laisser la chambre s'équilibrer à 37 degrés Celsius et maintenir une température stable.

Pour préparer l'acquisition d'images, allumez le microscope, l'ordinateur et tous les périphériques nécessaires. Selon la source lumineuse, attendez de l'allumer uniquement lorsque cela est nécessaire. Avec le porte-objectifs en position basse, sélectionnez l'objectif 20x d'ouverture numérique 0,7.

Ensuite, positionnez l'échantillon au-dessus de l'objectif, ce qui facilitera la localisation des cellules lorsque l'échantillon sera dans la chambre. Après avoir transféré les cellules à imager dans la chambre environnementale conformément au protocole décrit, scellez la chambre afin de maintenir un environnement stable et activez le gaz atmosphérique. Choisissez ensuite des conditions d'acquisition qui préviendront la phototoxicité en limitant les durées d'exposition et en utilisant une lumière d'intensité réduite.

Pour déterminer les plans X, Y et Z ainsi que les longueurs d'onde souhaitées pour chaque position à imager. Pour un laps de temps prolongé de la plupart des processus cellulaires, acquérir une image toutes les dix à vingt minutes. Une résolution temporelle plus élevée fournit davantage de points de données et un suivi cellulaire plus robuste, mais entraîne une exposition cumulée à la lumière plus importante et des ensembles de données plus volumineux.

Étant donné que les HT1080 FuGENE expriment des protéines fluorescentes vertes et rouges dynamiques, utilisez les temps d'exposition suivants et un binning 2 par 2. Dans les paramètres avancés, activez la mise au point automatique contrôlée par logiciel en utilisant les paramètres par défaut. Définissez une plage de mise au point automatique de 10 micromètres avec la taille de pas recommandée.

Dans la boîte expérimentale, pour réduire la dérive thermique, remplacez la moitié du milieu par un milieu contenant le médicament désiré préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius. Enfin, démarrez l'acquisition en laps de temps et recueillez les images conformément au protocole décrit dans le texte. Ces films montrent des exemples d'une paire de lignées cellulaires de cancer du sein dérivées de MCF7, appariées, qui ne diffèrent que par leur statut de p53 et qui ont été traitées avec un médicament anticancéreux inhibant la kinésine-5, entraînant un arrêt mitotique.

Comme on le voit sur cette figure, lorsque la protéine p53 est éliminée par une inhibition stable de p53, les cellules, au lieu de s'arrêter après la sortie de la mitose, effectuent des cycles répétés au cours desquels elles entrent dans un second tour de mitose plutôt que de s'arrêter, puis sortent de la mitose sans division. Sont représentées ici des cellules de carcinome du col de l'utérus (Hela) exprimant de façon stable le marqueur de chromatine Histone 2b fusionné à la mCherry et la bêta-tubuline fusionnée à l'EGFP. Lorsqu'elles sont traitées avec le médicament stabilisateur des microtubules, le paclitaxel, l'alignement et la ségrégation des chromosomes sont perturbés pendant la mitose, ce qui entraîne la formation de bourrelets nucléaires et de micronoyaux sujets aux lésions de l'ADN.

Cette lignée cellulaire exprime de façon stable les deux indicateurs fluorescents du cycle cellulaire basés sur l'ubiquitine, CDT1 en orange et la geminine en vert, et progresse normalement au cours du cycle cellulaire. Lorsque les mêmes cellules sont traitées avec un inhibiteur de CDK46, elles progressent normalement en phase G2 et se divisent, puis s'arrêtent fortement en phase G1, indiquant un potentiel d'effets cytostatiques efficaces dans les tumeurs en croissance. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de suivre directement, en temps réel et sur plusieurs jours, la réponse d'une cellule unique, plutôt que d'inférer ces réponses.