Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une application simple de la détection de fluorescence par microfluidique de gouttelettes à l’aide de fibres optiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le criblage biologique à haut débit, telles que l’identification de phénotypes rares et l’évolution dirigée des enzymes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une application simple et peu coûteuse de la détection de fluorescence dans la microfluidique des gouttelettes.

Pour commencer, placez une plaquette de silicium pré-nettoyée de trois pouces de diamètre sur le mandrin à vide d’une machine à revêtir. Ensuite, appliquez un millilitre de SU-8 3050 au centre de la plaquette et faites tourner la plaquette pour fournir une couche de résine photosensible de 80 micromètres d’épaisseur. Retirez la plaquette enrobée de la machine à revêtir et placez-la sur une plaque chauffante préchauffée à 135 degrés Celsius.

Après 30 minutes, retirez la gaufrette et laissez-la refroidir à température ambiante. Ensuite, placez la plaquette sur une surface plane et alignez le premier masque de couche sur la plaquette. Exposez la plaquette sous une LED collimatée de 190 milliwatts, 365 nanomètres pendant trois minutes.

Après l’exposition, placez la plaquette sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant une minute, puis laissez-la refroidir à température ambiante. Une fois refroidie, remettez la gaufrette sur la machine à essorer et fixez-la sur le mandrin. Appliquez un millilitre supplémentaire de SU-8 3050 au centre de la plaquette et faites tourner pendant 20 secondes à 500 tr/min.

suivi de 30 secondes à 5 000 tr/min. Ensuite, faites cuire la gaufrette sur une plaque chauffante. Laissez-le refroidir à température ambiante, puis replacez-le sur la surface d’alignement du masque.

Utilisez l’oscilloscope de dissection pour aligner manuellement le deuxième masque de calque avec les marques d’alignement à motifs sur la plaquette. Une fois correctement alignée, exposez la plaquette enrobée pendant 4 1/2 minutes en utilisant les mêmes conditions que précédemment. Après l’exposition, placez la plaquette sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant une minute, puis refroidissez la plaquette et fixez-la à nouveau sur l’essoreuse.

Appliquez un millilitre de SU-8 3050 sur la plaquette une troisième fois et tournez pour ajouter 100 micromètres supplémentaires de résine photosensible. Retirez la gaufrette et faites-la cuire sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, refroidissez-le à température ambiante et placez-le sur la surface d’alignement.

Alignez le troisième masque de couche sur la géométrie précédente et exposez la plaquette revêtue dans les conditions précédentes pendant neuf minutes. Après l’exposition, placez la plaquette sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant une minute, puis refroidissez-la à température ambiante. Une fois refroidis, développez les masques en immergeant la gaufrette dans un bain agité de révélateur pendant 30 minutes.

Enfin, lavez la gaufrette à l’isopropanol, puis faites-la cuire une dernière fois pendant une minute sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius. Conservez le master développé dans une boîte de Pétri de 100 millimètres jusqu’à ce qu’il soit moulé. Préparez un mélange 10:1 de PDMS en combinant 50 grammes de base de silicium avec cinq grammes d’agent de durcissement dans un gobelet en plastique.

Mélangez le contenu avec un outil rotatif, puis dégazez le mélange à l’intérieur du dessiccateur pendant 30 minutes, ou jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées. Versez le PDMS dégazé sur le master préparé pour donner une épaisseur de trois millimètres. Ensuite, remettez la boîte de Pétri dans le dessiccateur pour un dégazage supplémentaire.

Une fois toutes les bulles éliminées, faites cuire l’appareil à 80 degrés Celsius pendant 80 minutes. Une fois refroidi, démoulez l’appareil à l’aide d’un scalpel afin que les télégéométries de 120 micromètres et de 220 micromètres soient accessibles depuis le côté de l’appareil. Ensuite, poinçonnez les entrées et les sorties fluidiques avec un poinçon de biopsie de 0,75 mm.

Traitez l’appareil au plasma avec la fonction vers le haut avec une lame de verre pré-nettoyée et un plasma d’oxygène de 1 millibar pendant 20 secondes dans un nettoyeur plasma de 300 watts. Collez l’appareil en plaçant fermement le côté à motifs de l’appareil PDMS sur le côté traité au plasma de la lame de verre. Ensuite, placez l’appareil dans un four à 80 degrés Celsius et soutenez l’appareil assemblé pendant 40 minutes.

Une fois cuit, à l’aide d’une seringue, rincez l’appareil avec un liquide de traitement de surface fluoré pour rendre les canaux hydrophobes. Ensuite, faites cuire immédiatement l’appareil à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes pour évaporer le solvant. Préparez deux fibres d’excitation laser en retirant l’isolant des cinq derniers millimètres des fibres optiques.

Préparez également la fibre pour la collecte du signal fluorescent en retirant l’isolation des cinq derniers millimètres d’une fibre optique plus grande. Inspectez les extrémités de toutes les fibres au microscope. Si les pointes ne se terminent pas par une surface plane, fixez les extrémités avec une bande dessinée.

Ensuite, fixez un coupleur de fibre laser à un laser de 50 milliwatts et 405 nanomètres et fixez l’une des fibres à noyau de 105 micromètres au laser. Dirigez l’extrémité dénudée du capteur d’un wattmètre laser et utilisez les réglages fins du coupleur laser pour maximiser la puissance laser. Effectuez le même processus pour régler l’autre fibre à l’aide d’un laser de 50 milliwatts, 473 nanomètres.

Ensuite, montez un filtre passe-bande quadruple sur le tube photomultiplicateur à l’aide de tubes d’objectif pour bloquer la lumière laser et transmettre la fluorescence émise. Fixez un coupleur de fibre pour que la lumière traverse les filtres avant de frapper le tube multiplicateur photo. Ensuite, fixez la fibre collectrice au coupleur de fibre.

Placez la puce microfluidique fabriquée sur la platine d’un microscope inversé couplé à un appareil photo numérique capable d’une vitesse d’obturation d’au moins 100 microsecondes. En travaillant soigneusement sur les côtés, insérez la fibre couplée au laser de 473 nanomètres dans le canal de 120 micromètres le plus en amont le plus éloigné. Veillez à ne pas percer le canal d’écoulement principal.

Ensuite, insérez la fibre couplée au laser de 405 nanomètres dans le canal latéral de 120 micromètres le plus en aval le plus éloigné, en fournissant un espacement des fibres de 300 micromètres. Enfin, insérez la fibre couplée au tube photomultiplicateur plus grand dans le canal de 220 micromètres de haut normal aux deux fibres d’excitation laser. Remplissez une seringue de cinq millilitres remplie de HFE 7500 contenant un tensioactif fluoroionique à 2 % et montez-la sur l’entrée d’huile d’espacement du dispositif de détection à l’aide d’un tube PE2.

Ensuite, remplissez une seringue avec un mélange d’émulsion FITC et de colorant bleu et montez-la sur une pompe à seringue orientée verticalement couplée au dispositif en tant qu’entrée de réinjection de gouttelettes à l’aide d’un tube PE2. Connectez une longueur de tube en PE de la sortie de l’appareil à un conteneur à déchets. Ensuite, amorcez l’appareil en faisant fonctionner chacune des pompes à 1 000 microlitres par heure jusqu’à ce que l’huile et les gouttelettes se combinent régulièrement dans l’appareil et s’écoulent en aval.

Ajustez les débits de sorte que l’huile d’espacement fonctionne à 6 000 microlitres par heure et les gouttelettes à 100 microlitres par heure, en fournissant un espacement significatif entre les gouttelettes traversant la zone de détection. Ensuite, allumez les lasers et lancez le programme d’acquisition de données. Ensuite, ajustez le gain du tube photomultiplicateur pour fournir des signaux plus de 100 fois supérieurs au bruit de fond de base.

Enfin, ajustez la puissance du laser de sorte que tous les pics du doublet soient clairement visibles sur une seule trace temporelle à l’échelle linéaire. Une gouttelette circulant dans le canal de détection rencontre des régions d’excitation discrètes devant chacune des fibres optiques couplées au laser. La fibre de détection enregistre la fluorescence émise avec un décalage temporel avec une séparation des pics qui correspond au temps qu’il faut à une gouttelette pour se déplacer d’une région d’excitation à l’autre.

Il n’est donc plus nécessaire de filtrer davantage la lumière et de séparer les tubes photomultiplicateurs. L’efficacité du schéma de détection a été testée en détectant une émulsion mixte de gouttelettes contenant des colorants qui excitent à 405 nanomètres et à 473 nanomètres. Ce graphique montre une séparation claire entre les quatre types de gouttelettes réinjectées lorsqu’elles sont écoulées à environ 50 hertz.

La plage dynamique et la sensibilité absolue du détecteur ont été étudiées en mesurant les gouttelettes de fluorescéine uniquement. Les données montrent la capacité du système à détecter des concentrations de colorants allant de 0,1 à 100 nanomolaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre d’un système de détection de fluorescence simple et compact en utilisant un réseau de fibres optiques insérées et un seul photodétecteur.