Name: Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Découvrez une méthode de détection de fluorescence multicolore compacte pour la microfluidique à gouttes utilisant des fibres optiques. Cette technique simplifiée et économique facilite le criblage biologique à haut débit et l'évolution dirigée d'enzymes.

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Ce travail a été soutenu par le numéro de subvention DARPA 84389.01.44908, une bourse NSF CAREER (DBI-1253293), une subvention de recherche exploratoire/développementale des NIH (CA195709), et NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), et une subvention New Directions du programme d’allocation des ressources de l’UCSF.

1. SU8 Fabrication Master <ol><li> Concevoir les structures microfluidiques pour trois couches de fabrication à l&#39;aide de logiciels de conception et ont les dessins imprimés par un fournisseur sur le film de carte de circuit avec 10 um résolution. Les détails de la conception de l&#39; appareil sont données dans une référence attachée 6 et les géométries de canaux sont présentés dans la figure 1. Les couches doivent inclure des repères d&#39;alignement pour aider colocaliser caractéristiques de chaque couche de fabrication 8. </li><li> Placez une tranche de diamètre de silicium de 3 pouces préalablement nettoyé sur une tournette et allumez le vide pour l&#39;apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30 secondes à 1750 tours par minute, offrant une épaisseur de couche de 80 um. </li><li> Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 min. Permettre à la plaquette de se refroidir à la température ambiante avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Exposer la tranche revêtue au 1 er masque de calque sous un collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l&#39;exposition, placer la plaquette sur une C plaque 135 ° C pendant 1 min, puis refroidir à la température ambiante avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Placez la plaquette sur la tournette et tourner sur le vide pour l&#39;apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30 secondes à 5000 tours par minute, ce qui entraîne une couche qui fournit une épaisseur supplémentaire de 40 um. </li><li> Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Alignez le masque de calque 2 e sur la géométrie à motifs en 1.3 et exposer la plaquette revêtu à une collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l&#39;exposition, placer sur une plaque de cuisson C 135 ° C pendant 4 min 30 sec, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Placez la plaquette sur la tournette et tourner sur le vide pour l&#39;apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30s à 1000 tours par minute, ce qui entraîne une couche qui fournit une surépaisseur de 100 um. </li><li> Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Alignez le masque de calque 3 ème sur la géométrie à motifs en 1.3 et exposer la plaquette revêtu à une collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l&#39;exposition, placer sur une plaque de cuisson C 135 ° C pendant 9 min, puis refroidir à la température ambiante avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Développer les masques par immersion dans un bain agité de propylèneglycol acétate de monométhyléther pendant 30 min. Laver la plaque dans de l&#39;isopropanol et cuire au four sur une plaque chauffante à 135 ° C pendant 1 min. Placez le maître développé dans un plat de 100 mm de Pétri pour polydiméthylsiloxane (PDMS) moulage. </li></ol> 2. PDMS de fabrication de l&#39;appareil <ol><li> Préparer 10: 1 PDMS en combinant 50 g de base de silicone avec 5 g d&#39;agent de durcissement dans une coupelle en plastique. Mélanger le contenu avec un outil rotatif équipé d&#39;un bâtonnet. Degle mélange dans un dessicateur pendant 30 minutes ou jusqu&#39;à ce que toutes les bulles d&#39;air sont éliminées. </li><li> Verser le PDMS pour donner une épaisseur de 3 mm au-dessus du maître et de placer de nouveau dans le dessiccateur pour plus de dégazage. Une fois que toutes les bulles sont enlevées, cuire le dispositif à 80 ° C pendant 80 min. </li><li> Couper l&#39;appareil du moule à l&#39;aide d&#39;un scalpel et le placer sur une surface propre avec le côté à motifs et perforer les entrées et sorties fluidiques avec une biopsie poinçon de 0,75 mm. Le dispositif doit être coupé de façon à ce que les 120 um et 220 um hautes géométries sont accessibles depuis le côté de l&#39;appareil. </li><li> Traiter Plasma le dispositif, avec le côté fonctionnalité jusqu&#39;à, avec un pré-nettoyés 2 pouces par 3 pouces lame de verre à 1 mbar plasma O 2 pendant 20 secondes dans un nettoyeur à plasma de 300 W. Coller le dispositif de PDMS en plaçant la face à motifs du dispositif PDMS sur le côté traité au plasma de la lame de verre. Placez l&#39;appareil dans un four à 80 ° et cuire le dispositif assemblé pendant 40 min. </li><li> Rendre les canauxhydrophobe en utilisant une seringue pour rincer le dispositif avec un fluide de traitement de surface fluoré. cuire immédiatement le dispositif à 80 ° C pendant 10 min pour évaporer le solvant. </li></ol> 3. Préparation des composants optiques <ol><li> Préparer la fibre d&#39;excitation laser en enlevant l&#39;isolation du 5 derniers millimètres de 105 um noyau 125 um gaine, NA = 0,22 fibre optique. </li><li> Préparer le laser couleur fibre d&#39;excitation 2 e en répétant 3.1 pour une fibre identique 2 e. </li><li> Préparer la fibre pour collecter le signal de fluorescence en répétant 3,1 à 200 um noyau 225 um gaine, NA = 0,39 fibre optique. </li><li> Inspecter les conseils de toutes les fibres - si les conseils ne se terminent pas par une surface plane, re-cliver les extrémités avec une pointe en fibre. </li><li> Fixer un agent de couplage de la fibre laser à 50 mW, 405 nm laser et attacher une des 105 pm base de fibres au laser. Diriger l&#39;extrémité dénudée au niveau du capteur de la puissance du laserm et utiliser les réglages fins du coupleur laser afin de maximiser la puissance du laser. </li><li> Répétez 3,5 pour un laser nm 50 mW, 473. </li><li> Monter un 446/510/581/703 nm filtres passe-bande quad sur le PMT en utilisant des tubes de lentilles pour bloquer la lumière laser et transmettre la fluorescence émise. Fixer coupleur de fibres de telle sorte que la lumière se déplace à travers les filtres avant de frapper le PMT. </li><li> Fixer la fibre de 3,3 à l&#39;unité assemblée en 3.7. </li></ol> 4. Offline Mixed Generation Emulsion <ol><li> Obtenir un dispositif microfluidique de dropmaker de mise au point d&#39;écoulement avec un 60 um x 60 um orifice. </li><li> Remplir une seringue de 1 ml avec HFE 7500 huiles avec 2% fluoré ionique 9. </li><li> Remplir une série de seringues de 1 ml avec les combinaisons suivantes de fluorescéine (FITC) et les colorants bleu dextran conjugué (CB) dans du PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nm CB, et 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Monter le dispositif de dropmaker sur la scène d&#39;un micros inverséesfaire face et aqueuse et huileuse seringues sur les pompes à seringue. Couple les seringues aux appareils utilisant PE-2 tubes. </li><li> Exécution de pompes à seringue à 500 pl / h pour l&#39;huile et 250 pi / h pour les solutions aqueuses, de créer un mélange de 80 um gouttelettes contenant les solutions de 4,3. Pour chaque type d&#39;échantillon aqueux, utiliser un dispositif de dropmaker frais pour éliminer la contamination croisée. Recueillir ~ 200 pi d&#39;émulsion de chaque combinaison de colorant dans une seringue vide. </li><li> Après les gouttelettes types 4 ont été rassemblées dans une seule seringue de collecte, mélanger l&#39;émulsion en faisant tourner plusieurs fois sur la seringue. </li><li> Répéter les étapes 4.2 à 4.6 avec des solutions aqueuses contenant 0,1, 1, 10 et 100 nM FITC dans du PBS. </li></ol> 5. Fibre optique Insertion <ol><li> Placez la puce microfluidique fabriqué à l&#39;étape 2 sur la scène d&#39;un microscope inversé couplé avec un appareil photo numérique capable de &lt;100 microsecondes vitesses d&#39;obturation. </li><li> Travailler soigneusement de côté, insert la fibre couplée au laser nm 473 dans le canal amont um 120 plus loin, en prenant soin de ne pas percer à travers le canal d&#39;écoulement principal. </li><li> Insérez la fibre couplée au laser nm 405 dans le canal um côté haut le plus en aval 120, fournissant un espacement de fibre de 300 um. </li><li> Insérez la fibre PMT-couplée dans le grand canal normal aux deux fibres d&#39;excitation laser de 220 nm. </li></ol> 6. Fluorescence Détection de Emulsions mixtes <ol><li> Monter une seringue de 5 ml remplie de HFE 7500 avec 2% de tensioactif fluoré ionique à l&#39;entrée d&#39;huile d&#39;écartement du dispositif de détection avec un tube PE-2. </li><li> Monter la seringue contenant le FITC / CB émulsion mixte sur une pompe à seringue orienté verticalement et deux à l&#39;entrée de gouttelettes de réinjection de l&#39;appareil en utilisant PE-2 tubes. Connecter une longueur de tube PE-2 de la sortie de l&#39;appareil à un conteneur de déchets. </li><li> Premier dispositif en exécutant chacune des pompes à 1000 pi / h jusqu&#39;à ce que lesl&#39;huile et les gouttelettes sont visibles à combiner régulièrement dans le dispositif et qui coule en aval. </li><li> Ajuster les débits d&#39;écoulement tels que l&#39;huile d&#39;espacement exécute à 6000 ul / h et les gouttelettes à 100 ul / h, en fournissant un espacement important entre les gouttelettes qui traversent la zone de détection. </li><li> Allumez les lasers, démarrez le programme d&#39;acquisition de données, et d&#39;ajuster le gain du PMT pour fournir des signaux qui sont plus que 100x le plancher de bruit de fond. Régler la puissance du laser de telle sorte que tous les pics du doublet sont clairement visibles sur une seule timetrace linéairement à l&#39;échelle. </li><li> Acquérir 60 sec de l&#39;timetrace de tension de PMT à au moins 20 kHz. Importez les données dans le programme informatique tels que Matlab et mesurer les hauteurs des pics des doublets enregistrées en utilisant le script de programme informatique personnalisé. NOTE: Ceci est fourni à titre d&#39;information complémentaire. </li><li> Répétez les étapes 06.02 à 06.07 en utilisant le FITC seule émulsion mixte créée en 4.7, avec le laser nm 405 éteint. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
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<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

détection de fibre optique nécessite l&#39;alignement des fibres optiques par rapport aux canaux de fluide. Parce que notre dispositif utilise des canaux de guidage fabriqués avec photolithographie multicouche, le placement des masques par rapport à l&#39;autre est d&#39;une grande importance. Si les canaux de guidage des fibres sont trop proches du canal de fluide, il existe un risque de fuite de fluide; si les canaux de guidage sont situés trop loin ou mal alignée, le signal de fluorescence recueillie par la fibre de ...

Microfluidique Droplet fournissent une plate - forme pour une grande biologie de débit par compartimenter expériences dans un grand nombre de gouttelettes aqueuses en suspension dans une huile de support 1. Les gouttelettes ont été utilisées pour des applications aussi variées que la simple analyse de cellules 2, la réaction en chaîne par polymérase numérique (PCR) , 3 et 4 l&#39; évolution enzymatique. dosages fluorescents sont le mode standard de détection pour la microfluidique de gouttelettes, comme leurs signaux lumineux et temps de réponse rapide sont compatibles avec la détection de volumes de gouttelettes sous-nanolitre à taux de kilohertz. De nombreuses applications nécessitent une détection par fluorescence d&#39;au moins deux couleurs simultanément. Par exemple, notre laboratoire effectue couramment PCR-activé expériences de gouttelettes de tri qui utilisent un canal de détection pour le résultat d&#39;un essai, et utilise un fond de colorant secondaire pour faire test négatif gouttelettes dénombrable 5. stations de détection typiques pour la microfluidique de gouttelettes sont based sur les microscopes à épifluorescence, et nécessitent des manipulations régimes de lumière compliqué à introduire de la lumière d&#39;excitation des lasers d&#39;espace libre dans un microscope à se concentrer sur l&#39;échantillon. Après que la fluorescence est émise à partir d&#39;une goutte, la lumière émise fluoresce est filtré de telle sorte que chaque canal de détection utilise un tube photomultiplicateur (PMT) centré sur une bande de longueur d&#39;onde. systèmes de détection optique épifluorescence à base microscope fournissent une barrière à l&#39;entrée en raison de leurs frais, la complexité et la nécessité d&#39;entretien. Les fibres optiques fournissent les moyens pour construire un système de détection simplifiée et robuste, étant donné que les fibres peuvent être introduites manuellement dans des dispositifs microfluidiques, en supprimant la nécessité d&#39;un routage de lumière intégrée au rétroviseur, et en permettant des chemins de lumière pour être interfacé avec des connecteurs à fibres optiques. Dans cet article, nous décrivons l&#39;assemblage et la validation d&#39;un système compact et modulaire pour effectuer une détection de fluorescence multicolore en utilisant un réseau de fibres optiques d&#39;unda photodétecteur unique 6. Les fibres optiques sont couplées à des lasers individuels et sont insérés perpendiculairement à un canal d&#39;écoulement en forme de L avec des décalages spatiaux réguliers. Une fibre de collecte de fluorescence est orienté parallèlement aux régions d&#39;excitation et est reliée à une seule PMT. Parce qu&#39;une goutte passe à travers les faisceaux laser à des moments différents, les données enregistrées par le PMT indique un décalage temporel qui permet à l&#39;utilisateur de faire la distinction entre la fluorescence émise après la gouttelette est excitée par chaque faisceau laser distinct. Ce décalage temporel élimine la nécessité de séparer la lumière émise à PMT séparés en utilisant une série de miroirs dichroïques et filtres passe-bande. Pour valider l&#39;efficacité du détecteur, on quantifier la fluorescence dans les populations de gouttelettes d&#39;encapsulation des colorants de couleur différente et la concentration. La sensibilité du système est étudiée pour la détection de couleur unique à la fluorescéine, et montre la capacité de détecter des gouttelettes ayant des concentrations jusqu&#39;à 0,1 nm, une sensibilité impr 200xOUVEMENT par rapport à des approches à base de fibres récentes rapportées dans la littérature 7.

<table><tbody><tr><td>Photomasques</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes de silicone 3", type P, vierge de qualité d’essai</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit d’élastomère de silicone</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>seringues de 1 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>seringues de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>aiguilles de 27 gaugues</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>tube en polyéthylène PE 2</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Communément appelé HFE 7500</td></tr><tr><td>Ionic Krytox Surfactant</td><td></td><td></td><td>Instructions de synthèse dans ref #10</td></tr><tr><td>Colorant bleu cascade conjugué au dextran</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de fluorescéine</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Filtre</td> <td>passe-bande quadrupleSemrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Port fibre</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>Tube</td><td>d’objectif Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Câble de raccordement avec 200 &#956 ; noyau m / 225 &#956 ; fibre optique de gainage m avec une extrémité dénudée et un connecteur FC/PC</td> Câble de raccordement <td>personnalisé</td><td></td><td>Thorlabs</td></tr><tr><td>avec 105 &#956 ; noyau m / 125 &#956 ; m cladding fibre optique avec une extrémité dénudée et un connecteur FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956 ; outil de dénudage de fibres m</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956 ; m outil de dénudage de fibre</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>adaptateur de fibre laser</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adaptateur</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW laser à 50&nbsp ; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distributeur pour lasers CNI</td></tr><tr><td>Laser CW 473 nm à 50&nbsp ; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolor détection fluorescence pour droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Les tests de fluorescence sont les lectures les plus couramment utilisées en microfluidique des gouttelettes en raison de leurs signaux brillants et de leur réponse rapide. Des applications telles que les tests multiplexes, l’évolution enzymatique et le tri cellulaire amélioré par la biologie moléculaire nécessitent la détection de deux ou plusieurs couleurs de fluorescence. Les systèmes de détection multicolore standard qui couplent les lasers spatiaux libres aux microscopes à épifluorescence sont encombrants, coûteux et difficiles à entretenir. Dans cet article, nous décrivons un schéma permettant d’effectuer une détection multicolore en excitant des régions discrètes d’un canal microfluidique avec des lasers couplés à des fibres optiques. La lumière émise est collectée par une fibre optique couplée à un seul photodétecteur. Étant donné que l’excitation se produit à différents endroits dans l’espace, l’identité de la lumière émise peut être codée sous la forme d’un décalage temporel, éliminant ainsi le besoin de schémas de filtrage de la lumière plus complexes. Le système a été utilisé pour détecter des populations de gouttelettes contenant quatre combinaisons uniques de colorants et pour détecter des concentrations subnanomolaires de fluorescéine.

Fabrication d&#39;un dispositif PDMS qui permet l&#39;insertion de fibres optiques nécessite une procédure en plusieurs étapes de photolithographie pour créer des canaux de hauteur variable (figure 1). Tout d&#39;abord, une couche 80 um de hauteur de SU-8 est mis en rotation sur une tranche de silicium et modelée en utilisant un masque pour créer la géométrie de manipulation de fluide. Ensuite, un 40 um couche supplémentaire de SU-8 est filée sur la plaquette, et modelé ...

La détection de fluorescence multicolore dans la microfluidique de gouttelettes implique généralement des systèmes de détection basés sur un microscope à épifluorescence encombrants et complexes. Nous décrivons ici un schéma de détection multicolore compact et modulaire qui utilise un réseau de fibres optiques pour coder temporellement des données multicolores collectées par un seul photodétecteur.

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une application simple de la détection de fluorescence en microfluidique à gouttelettes à l'aide de fibres optiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le criblage biologique à haut débit, telles que l'identification de phénotypes rares et l'évolution dirigée d'enzymes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une application simple et peu coûteuse de la détection de fluorescence en microfluidique à gouttelettes.Pour commencer, placez une plaquette de silicium d'un diamètre de trois pouces préalablement nettoyée sur le mandrin à vide d'un appareil de dépôt par rotation. Ensuite, appliquez un millilitre de SU-8 3050 au centre de la plaquette, puis faites tourner la plaquette afin d'obtenir une couche de résine photosensible d'une épaisseur de 80 micromètres. Retirez la plaquette recouverte de l'appareil de dépôt par rotation et placez-la sur une plaque chauffante préchauffée à 135 degrés Celsius.Après 30 minutes, retirez la plaquette et laissez-la refroidir à température ambiante. Ensuite, placez la plaquette sur une surface plane et alignez le masque de la première couche sur la plaquette. Exposez la plaquette sous une LED collimatée de 190 milliwatts à 365 nanomètres pendant trois minutes.Après l'exposition, placez la plaquette sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant une minute, puis laissez-la refroidir jusqu'à la température ambiante. Une fois refroidie, replacez la plaquette sur le spin coater et fixez-la sur le mandrin. Appliquez un millilitre supplémentaire de SU-8 3050 au centre de la plaquette et faites-la tourner pendant 20 secondes à 500 tr/min.suivi de 30 secondes à 5 000 tr/min. Ensuite, faire durcir la plaquette sur une plaque chauffante. Laisser refroidir jusqu'à la température ambiante, puis la replacer sur la surface d'alignement du masque.Utilisez le microscope stéréo pour aligner manuellement le masque de la deuxième couche avec les marques d'alignement imprimées sur la plaquette. Une fois correctement aligné, exposez la plaquette recouverte pendant 4 minutes et demie dans les mêmes conditions qu'auparavant. Après l'exposition, placez la plaquette sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant une minute, puis refroidissez-la et remettez-la sur le dispositif de dépôt par rotation.Appliquez un millilitre de SU-8 3050 sur la plaquette pour la troisième fois et faites-la tourner afin d'ajouter 100 micromètres supplémentaires de résine photosensible. Retirez la plaquette et faites-la cuire sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, laissez-la refroidir à température ambiante et placez-la sur la surface d'alignement.Aligner le masque de la troisième couche avec la géométrie précédente et exposer la plaquette enduite selon les conditions précédentes pendant neuf minutes. Après l'exposition, placer la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 135 degrés Celsius pendant une minute, puis la refroidir à température ambiante. Une fois refroidie, révéler les masques en immergeant la plaquette dans un bain d'agent révélateur agité pendant 30 minutes.Enfin, lavez la plaquette à l'isopropanol, puis faites-la cuire une dernière fois pendant une minute sur une plaque chauffante à 135 degrés Celsius. Conservez le moule maître développé dans une boîte de Pétri de 100 millimètres jusqu'au moulage. Préparez un mélange de PDMS à un rapport de 10:1 en combinant 50 grammes de base de silicium avec cinq grammes d'agent de réticulation dans un gobelet en plastique.Mélangez le contenu à l’aide d’un outil rotatif, puis dégazez le mélange dans un dessiccateur pendant 30 minutes, ou jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées. Versez le PDMS dégazé sur le moule préparé afin d’obtenir une épaisseur de trois millimètres. Ensuite, replacez la boîte de Pétri dans le dessiccateur pour un dégazage supplémentaire.Une fois toutes les bulles éliminées, faire durcir le dispositif à 80 degrés Celsius pendant 80 minutes. Après refroidissement, découper le dispositif à partir du moule à l’aide d’un scalpel afin que les télégéométries de 120 micromètres et de 220 micromètres soient accessibles sur le côté du dispositif. Ensuite, percer les entrées et sorties fluidiques à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 mm.Traitez le dispositif au plasma en plaçant le côté structuré vers le haut, ainsi qu'une lame de verre préalablement nettoyée, sous un plasma d'oxygène à 1 millibar pendant 20 secondes dans un nettoyeur à plasma de 300 watts. Assemblez le dispositif en apposant fermement le côté structuré du dispositif en PDMS sur le côté traité au plasma de la lame de verre. Ensuite, placez le dispositif dans une étuve réglée à 80 degrés Celsius et faites durcir l'ensemble pendant 40 minutes.Une fois cuit, utilisez une seringue pour rincer l'appareil avec un fluide de traitement de surface fluoré afin de rendre les canaux hydrophobes. Ensuite, faites cuire immédiatement l'appareil à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes pour évaporer le solvant. Préparez deux fibres d'excitation laser en retirant l'isolation des cinq derniers millimètres des fibres optiques.Préparez également la fibre destinée à la collecte du signal fluorescent en retirant l'isolation des cinq derniers millimètres d'une fibre optique plus grande. Examinez les extrémités de toutes les fibres au microscope. Si les extrémités ne se terminent pas par une surface plane, recoupez-les à l'aide d'un stylet pour fibre optique.Ensuite, fixez un coupleur de fibre laser à un laser de 50 milliwatts à 405 nanomètres et reliez-y l'une des fibres à âme de 105 micromètres. Dirigez l'extrémité dénudée du capteur d'un wattmètre laser et utilisez les réglages fins du coupleur laser pour maximiser la puissance laser. Effectuez le même processus pour ajuster l'autre fibre à l'aide d'un laser de 50 milliwatts à 473 nanomètres.Ensuite, montez un filtre quadri-bandes sur le tube photomultiplicateur à l'aide de tubes pour objectifs afin de bloquer la lumière laser et transmettre la fluorescence émise. Fixez un coupleur de fibre optique de manière à ce que la lumière traverse les filtres avant d'atteindre le tube photomultiplicateur. Puis, reliez la fibre de collecte au coupleur de fibre optique.Placez la puce microfluidique fabriquée sur la platine d'un microscope inversé couplé à une caméra numérique capable d'obtenir des vitesses d'obturation d'au moins 100 microsecondes. En travaillant soigneusement depuis les côtés, insérez la fibre couplée au laser de 473 nanomètres dans le canal de 120 micromètres le plus en amont. Veillez à ne pas percer jusqu'au canal d'écoulement principal.Ensuite, insérez la fibre couplée au laser de 405 nanomètres dans le canal latéral le plus en aval, haut de 120 micromètres, assurant un espacement des fibres de 300 micromètres. Enfin, insérez la fibre couplée au plus grand tube photomultiplicateur dans le canal de 220 micromètres de hauteur, perpendiculaire aux deux fibres de laser d'excitation. Remplissez une seringue de cinq millilitres avec du HFE 7500 contenant 2 % de fluorosurfactant ionique, puis fixez-la à l'entrée d'huile d'espacement du dispositif de détection à l'aide d'un tube PE2.Ensuite, remplir une seringue avec une émulsion mixte de FITC et de colorant bleu, puis la monter sur une pompe à seringue verticale reliée au dispositif comme entrée de réinjection de gouttelettes, à l'aide d'un tube PE2. Connecter un tronçon de tube PE de la sortie du dispositif à un récipient de déchets. Amorcer ensuite le dispositif en faisant fonctionner chacune des pompes à 1 000 microlitres par heure jusqu'à ce que l'huile et les gouttelettes soient observées se combinant régulièrement dans le dispositif et s'écoulant en aval.Réglez les débits de sorte que l'huile d'espacement circule à 6 000 microlitres par heure et que les gouttelettes circulent à 100 microlitres par heure, assurant ainsi un espacement significatif entre les gouttelettes traversant la zone de détection. Ensuite, allumez les lasers et démarrez le programme d'acquisition de données. Ajustez ensuite le gain du tube photomultiplicateur afin d'obtenir des signaux supérieurs à 100 fois le bruit de fond de la ligne de base.Enfin, ajustez la puissance du laser de manière à ce que tous les pics en doublet soient clairement visibles sur un tracé temporel unique à échelle linéaire. Une gouttelette circulant dans le canal de détection traverse des régions d'excitation discrètes situées devant chacune des fibres optiques couplées au laser. La fibre de détection enregistre la fluorescence émise avec un décalage temporel dont la séparation des pics correspond au temps nécessaire à une gouttelette pour passer d'une région d'excitation à la suivante.Cela élimine la nécessité de filtrer davantage la lumière et d'utiliser des tubes photo-multiplicateurs séparés. L'efficacité du dispositif de détection a été testée en détectant une émulsion mixte de gouttelettes contenant des colorants excités à 405 nanomètres et à 473 nanomètres. Ce graphique montre une séparation nette entre les quatre types de gouttelettes réinjectées lorsqu'elles sont acheminées à environ 50 hertz.La plage dynamique et la sensibilité absolue du détecteur ont été étudiées en mesurant les gouttelettes contenant uniquement de la fluorescéine. Les données montrent la capacité du système à détecter des concentrations de colorant allant de 0,1 à 100 nanomolaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en œuvre un système de détection de fluorescence simple et compact en utilisant un réseau de fibres optiques insérées et un unique photodétecteur.

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