Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les événements dynamiques au sein du microenvironnement tumoral à l'aide de la microscopie multiphoton intravitale à haute résolution. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le microenvironnement tumoral, telles que les événements dynamiques impliqués dans la perméabilité vasculaire et les interactions multicellulaires. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer et de mesurer la cinétique des événements survenant dans le microenvironnement tumoral.

Avant de commencer la procédure, allumez tous les composants du microscope et du laser, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs. Réglez la boîte de chauffage sur 30 degrés Celsius pour préchauffer la platine. Essuyez la platine du microscope et l'insert de platine avec de l'éthanol à 70 %.

Lorsque la platine est sèche, déposez une grande goutte d'eau sur l'objectif microscopique 25 x 1,05 NA afin de maintenir le contact optique avec la lame couvre-objet, puis placez une lame couvre-objet d'épaisseur n° 1,5 sur le port d'imagerie de l'insert. Ensuite, coupez un morceau de tube en polyéthylène de 30 centimètres de longueur. Placez le tampon en caoutchouc au-dessus de la lame couvre-objet.

À l’aide de pinces, détacher une aiguille de calibre 31 de son embout en plastique et insérer l’extrémité émoussée de la canule dans le tube. Insérer puis fixer une aiguille de calibre 31 à l’autre extrémité du tube en PE. Ensuite, remplir une seringue d’un cc de PBS stérile et fixer la seringue à l’aiguille de calibre 31.

Utilisez le PBS pour chasser tout l'air hors du tube et de l'aiguille. Ensuite, chargez une seringue d'un cc avec 200 microlitres du marqueur vasculaire approprié et une autre avec la protéine injectable appropriée. Avant de commencer la chirurgie, vérifiez l'anesthésie adéquate par l'absence de réponse à une pincée des orteils et appliquez des pommades oculaires à la souris anesthésiée.

Ensuite, placez l'animal sur une plateforme chirurgicale sous une lampe chauffante afin d'augmenter la circulation sanguine dans la queue. Après deux minutes, stérilisez la queue avec de l'éthanol à 70 % et insérez l'extrémité du cathéter de calibre 31, de deux à trois millimètres dans la veine latérale de la queue. Puis, fixez un morceau de ruban adhésif de laboratoire d'un centimètre de longueur sur le cathéter afin de maintenir l'aiguille parallèle à la veine sur toute la longueur de la queue.

Une fois le cathéter fixé, passez de l'éthanol à 70 % sur les surfaces ventrale et tumorale. Ensuite, soulevez la peau au-dessus de l'abdomen et utilisez des ciseaux stériles pour pratiquer une incision sous-cutanée d'environ un centimètre le long de la ligne médiane ventrale de l'abdomen, en prenant soin d'éviter de percer le péritoine. Coupez délicatement les tissus conjonctifs reliant la glande mammaire et la tumeur au péritoine afin d'exposer la tumeur.

Ensuite, à l’aide des ciseaux et de la pince, retirer délicatement la fascia et la graisse de la surface exposée de la tumeur. Une fois la tumeur exposée, transférer la souris sur la platine d’imagerie préchauffée. Utiliser du ruban adhésif de laboratoire pour fixer le couvre-objet, puis placer la tumeur dans le trou d’un tampon en caoutchouc recouvrant le couvre-objet au-dessus de l’objectif du microscope.

Lorsque l'animal est en position, remplir la chambre du coussin en caoutchouc avec du PBS afin de maintenir l'hydratation du tissu et d'assurer un contact optique avec la lame de couverture. Placer un capteur de collier de pulsioxymètre autour du cou pour surveiller les signes vitaux de l'animal et positionner la boîte chauffante au-dessus de l'animal. Ensuite, utiliser les IP du microscope pour focaliser sur les cellules tumorales fluorescentes situées à la surface de la tumeur et identifier une zone présentant des vaisseaux sanguins avec écoulement sanguin.

Une fois qu'une région d'intérêt a été sélectionnée, passez le microscope en mode d'imagerie multiphotonique et utilisez le réglage de focalisation pour déplacer l'objectif à l'endroit de départ souhaité. Ensuite, cliquez sur le bouton supérieur de position Z pour définir la limite supérieure de la série en z et visualiser le réseau de fibres de collagène à la surface de la tumeur dans le canal de génération de seconde harmonique. Puis, déplacez l'objectif à la profondeur d'imagerie souhaitée et cliquez sur le bouton inférieur de position Z pour définir la limite inférieure de la série en z.

Ensuite, saisissez la valeur souhaitée dans les champs de taille de pas. Puis, passez au panneau de prise de vue temporelle et entrez le temps de pause approprié. Une fois les paramètres d'acquisition déterminés, remplacez la seringue fixée au cathéter par une seringue contenant un colorant de marquage vasculaire et administrez lentement un maximum de 200 microlitres de la solution colorante, en veillant à ce que la solution pénètre dans la veine.

Après l'injection, remettez la seringue de PBS sur le cathéter et commencez l'acquisition en laps de temps selon l'axe z. Une fois toutes les images obtenues, remplacez la seringue de PBS par celle contenant la protéine injectable, en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans la ligne. Ensuite, injectez lentement la suspension protéique dans la souris et remplacez la seringue par une seringue contenant du PBS.

Les macrophages peuvent être suivis à l'aide de dextran marqué par un fluorochrome de 70 kilodaltons, qui s'accumule dans les micromacrophages phagocytaires. Le double marquage des cellules tumorales et des micromacrophages permet de visualiser en temps réel l'interaction directe entre ces deux types cellulaires. Pour visualiser les changements de perméabilité vasculaire tumorale, des points quantiques peuvent également être utilisés pour marquer l'espace vasculaire.

Étant donné leur taille suffisamment importante pour qu'ils ne diffusent pas facilement à travers les espaces interartériels. L'imagerie continue à haute résolution permet de capturer les événements de perméabilité vasculaire et de quantifier la cinétique de l'extravasation et de l'élimination du dextran. Dans ce champ d'observation exemple, le pic d'extravasation vasculaire double est observé entre 29 et 34 minutes, comme en témoigne le signal TMR extravasculaire.

L'injection de colorants ou de protéines vasculaires supplémentaires afin d'induire une perméabilité vasculaire peut fournir des informations sur les événements de signalisation régulant cette perméabilité. En effet, durant les premières secondes suivant l'injection, on observe l'extravasation du dextran marqué par la FITC de 10 kilodaltons à partir du réseau vasculaire, tandis que le dextran marqué par le TMR de 155 kilodaltons reste confiné à l'espace vasculaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'ôter délicatement le tissu conjonctif sans endommager la surface de la tumeur et de maintenir l'hydratation de la surface tumorale. En suivant cette procédure d'étude de la dynamique cellulaire, la migration des cellules tumorales peut être visualisée afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la directionnalité de la migration des cellules tumorales et l'intravasation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser des événements cellulaires dynamiques dans un microenvironnement tumoral par microscopie multiphoton intravitale.