Name: Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez l'imagerie intravitale par microscopie multiphoton pour visualiser les dynamiques multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. Cette méthode permet d'observer la perméabilité vasculaire en temps réel.

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Cette recherche a été soutenue par le programme d&#39;imagerie intégrée Programme de recherche sur le cancer du sein Département de la Défense sous le numéro d&#39;attribution (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, et.

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et réglementations relatives à l&#39;utilisation des animaux vertébrés, y compris l&#39;approbation préalable de l&#39;Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care et utilisation Comité. 1. Génération de fluorescence Tumeurs Labellisées et Macrophages associés aux tumeurs <ol><li> Générer des cellules tumorales marquées par fluorescence en traversant le autochthonous modèle spontané, une souris transgénique mammaire cancer , où le virus de la tumeur longue répétition terminale mammaire de la souris entraîne l&#39;antigène polyome du milieu T (MMTV PyMT) avec des souris transgéniques avec des rapporteurs fluorescents [ à savoir, une meilleure fluorescente verte protéines (EGFP), amélioré la protéine fluorescente cyan (ECFP) ou Dendra2] 8,9. </li><li> Macrophages de l&#39; étiquette par fluorescence chez les animaux PyMT avec marquées par fluorescence des cellules tumorales par le croisement des modèles de souris génétiquement modifiées avec des journalistes fluorescents spécifiques myeloid- et macrophages [ie, MacGreen 15 ou souris MacBlue CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16]. </li><li> En variante, de générer des tumeurs marquées par fluorescence par la transplantation orthotopique de cellules marquées par fluorescence (PyMT tumorales syngéniques), de lignées cellulaires de cancer du sein humain ou de tumeurs primaires patient humain dérivées (11,17) xénogreffes. <ol><li> Implant marqué par fluorescence des cellules tumorales dans des souris syngéniques PyMT avec des cellules myéloïdes de la protéine marquée par fluorescence pour générer des animaux avec des cellules tumorales marquées par fluorescence et les cellules myéloïdes 13. </li></ol></li><li> Injecter 100 ul de 10 mg / kg fluorescent 70 kDa dextran par voie intraveineuse (iv) veine de la queue des souris déficit immunitaire combiné sévère (SCID) avec des tumeurs de xénogreffes de lignées cellulaires humaines ou de tumeurs primaires provenant de patients à macrophages d&#39;étiquettes par fluorescence 2 heures avant le début de l&#39;imagerie intravitale. </li></ol> 2. Installation de Microscope et imagerie Préparation Remarque: Cette procédure décrit la mise en placepour l&#39; imagerie intravitale sur un microscope multiphoton 8. <ol><li> Allumez tous microscope laser et composants, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs. </li><li> Mettre en marche le moteur de chauffage à 30 ° C pour préchauffer la scène. Cette étape est essentielle pour le maintien de la température physiologique de l&#39;animal. </li><li> Pour une utilisation sur un microscope inversé lieu l&#39;insert de scène sur mesure sur la platine du microscope. L&#39;insert personnalisé est une feuille de 1/8 &quot;aluminium épais usiné pour tenir dans l&#39;espace d&#39;insertion de la scène et avec un diamètre de 1&quot; trou traversant dans le centre d&#39;imagerie. <ol><li> Essuyez la platine du microscope et l&#39;insert de scène avec 70% d&#39;éthanol et de l&#39;air sec. </li><li> Placez une grosse goutte d&#39;eau sur le NA objectif 20X, 1,05 microscope pour maintenir le contact optique avec le verre de protection. </li><li> verre Lieu de couverture (# 1.5 d&#39;épaisseur) sur le port d&#39;imagerie sur l&#39;insert de platine du microscope. Fixez en place avec du ruban adhésif de laboratoire. </li><li> Utilisez un poinçon pour percer un trou x 2 cm 2 cmdans un tampon de caoutchouc flexible et placez le coussin en caoutchouc sur la platine du microscope avec le trou dans le tampon aligné avec le trou dans l&#39;insert de scène personnalisée. </li></ol></li></ol> 3. Préparation de la veine de la queue Catheter et réactifs pour injection lors de l&#39;imagerie <ol><li> Couper une longueur de 30 cm de polyéthylène (PE) tubes. </li><li> En utilisant des pinces, déplacer l&#39;aiguille métallique d&#39;un G aiguille 31 avant et en arrière jusqu&#39;à ce qu&#39;il se détache du raccord en plastique. </li><li> En utilisant des pinces, insérer l&#39;extrémité émoussée de l&#39;aiguille détaché dans le tube PE. </li><li> Insérer une aiguille de calibre 31 dans l&#39;autre extrémité du tuyau en PE. </li><li> Remplir une seringue de 1 cc avec du phosphate stérile saline tamponnée (PBS) et l&#39;insérer dans le G aiguille 31 et rincer tout l&#39;air du tube et de l&#39;aiguille avec du PBS. PBS est utilisé pour maintenir l&#39; hydratation et l&#39; osmolarité du sang 9,18, une solution saline isotonique , mais peut également être utilisé. </li><li> Remplir une seringue de 1 ml avec 200 ul de 3 mg / kg 155 kDa dextrane tétraméthylrhodamine (TMR) Ou des points quantiques pour l&#39;étiquetage vasculaire. </li><li> Préparer toutes les autres protéines injectables tel qu&#39;un isoforme de 165 acides aminés de facteur de croissance de l&#39; endothélium vasculaire A (VEGFA 165) dans une seringue de 1 ml et placer sur de la glace. Injecter 0,2 mg / kg VEGFA 19 165 à une concentration de 0,05 mg / ml. </li></ol> 4. Insertion de la queue Indwelling Vein Catheter <ol><li> Placer l&#39;animal sous anesthésie à l&#39; aide d&#39; une chambre d&#39;induction avec 5% d&#39; isoflurane avec O 2 en tant que gaz porteur. </li><li> Transférer la souris pour la plate-forme chirurgicale une fois qu&#39;il est complètement anesthésié et ne répond pas à une pincée d&#39;orteil. </li><li> Ligne ouverte de l&#39;isoflurane à la plate-forme chirurgicale, fermer la ligne d&#39;anesthésie à la chambre d&#39;induction et placez le cône de nez sur le museau de l&#39;animal. Réduire l&#39;isoflurane de 5% à 2,5%. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse pendant l&#39;anesthésie. </li><li> Chauffer l&#39;animal sous la lampe chauffantependant 2 min pour augmenter la circulation dans la queue que la circulation ralentit avec l&#39;anesthésie profonde. </li><li> Stériliser la souris veine de la queue avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Insérer la pointe du G aiguille du cathéter construit dans la section 3 dans la veine caudale latérale de l&#39;animal 31 et pousser l&#39;aiguille dans 2-3 mm. </li><li> Tirez sur la seringue pour voir le sang, assurant le cathéter est placé dans la veine de la queue. </li><li> Utilisez une longueur de 1 cm de ruban de laboratoire placé sur l&#39;aiguille pour maintenir l&#39;aiguille en place parallèlement à la veine le long de la longueur de la queue. </li></ol> 5. Flap de la peau Procédure chirurgicale pour exposer la tumeur mammaire <ol><li> Avec l&#39;animal sur la plate-forme chirurgicale tamponner la tumeur et la surface ventrale avec 70% d&#39;éthanol. Remarque: Comme indiqué, ce procédé n&#39;a pas été complètement exécutée de manière aseptique. Pour les sessions d&#39;imagerie longues où l&#39;infection peut devenir un facteur de confusion, il est recommandé d&#39;utiliser une technique aseptique appropriée. </li><li> Utilisation de steriLe forceps, soulever la peau ventrale et avec des ciseaux stériles faire une incision sous-cutanée le long de la ligne médiane ventrale d&#39;environ 1 cm de longueur. Évitez de perforer le péritoine lors de l&#39;incision. </li><li> couper en douceur le tissu conjonctif fixation de la glande mammaire et la tumeur loin du péritoine pour exposer la tumeur mammaire. </li><li> Avec des ciseaux et des pinces, retirez délicatement et couper le fascia et la graisse de la surface exposée de la tumeur tout en préservant l&#39;intégrité de la vascularisation de la tumeur et de minimiser les saignements. Cette étape est essentielle pour le maintien de l&#39;architecture de la tumeur et le système vasculaire d&#39;alimentation de la tumeur. </li></ol> 6. Préparation des animaux pour Microscopie <ol><li> Transférer l&#39;animal au stade d&#39;imagerie préchauffée avec la tumeur exposée placée sur la lamelle couvre-objet sur l&#39;insert de phase au-dessus de l&#39;objectif du microscope pour l&#39;imagerie. Prenez soin de transférer le cathéter dans la veine caudale doucement avec l&#39;animal afin de ne pas déloger l&#39;aiguille. </li><li> La place enez e anesthésie cône sur le museau de l&#39;animal pour maintenir ensemble l&#39;anesthésie à 3% d&#39;isoflurane. </li><li> Positionner l&#39;animal de telle sorte que la tumeur repose dans le trou de la garniture en caoutchouc et en contact avec la lamelle couvre-objet en verre. </li><li> Utilisez deux tampons en caoutchouc pour tenir doucement la tumeur en place et les fixer à la platine du microscope avec du ruban de laboratoire pour réduire le mouvement lors de l&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Remplir la chambre du coussin en caoutchouc avec du PBS pour maintenir le tissu hydraté et maintenir le contact optique avec la lamelle. </li><li> Commencez à surveiller les signes vitaux de l&#39;animal avec une sonde d&#39;oxymètre de pouls. Fixer un capteur à pince à la cuisse de l&#39;animal. En variante, un collier qui est configuré pour s&#39;adapter autour du cou peut être utilisé. </li><li> Placer la boîte de chauffage au- dessus de l&#39;animal pour maintenir 30 ° C 20. </li><li> diminuer progressivement le niveau de l&#39;isoflurane à 0,5-1% pour maintenir l&#39;anesthésie et de maintenir le flux sanguin. </li></ol> Acquisition et Injection de Fluoresc 7. imageent Colorants et protéines injectables <ol><li> Mise au point à l&#39;aide du microscope oculaire sur les cellules tumorales fluorescentes sur la surface de la tumeur. </li><li> Sélectionnez une zone d&#39;intérêt en trouvant des zones où affluent les vaisseaux sanguins. La sélection d&#39;une zone d&#39;intérêt avec écoulement des vaisseaux sanguins est essentielle pour l&#39;évaluation de la vascularisation tumorale. </li><li> Une fois qu&#39;une région d&#39;intérêt a été sélectionné commuter le microscope en mode multiphotonique d&#39;imagerie. </li><li> Fixer les limites supérieure et inférieure d&#39;une série Z. Régler la limite supérieure de la z-série en utilisant le réglage de mise au point pour déplacer l&#39;objectif à l&#39;emplacement de départ souhaité et en cliquant sur le bouton de position Z &quot;Top&quot;. Déterminer la limite supérieure de la série Z en visualisant le réseau de fibres de collagène à la surface de la tumeur dans le canal de génération de second harmonique (SHG) et en observant en l&#39;absence de cellules, mais seules les fibres de collagène sont visibles. <ol><li> Réglez la limite inférieure de la z-série en déplaçant l&#39;objectif à la profondeur d&#39;imagerie désirée (typically 50-150 um) et en cliquant sur la position Z bouton &quot;Bas&quot;. </li><li> Définissez la taille de l&#39;étape en tapant la valeur souhaitée dans le champ de taille de pas. Déterminer la taille de l&#39;étape fondée sur des considérations de résolution et le temps d&#39;acquisition (généralement de 2 pm est utilisé pour la reconstruction 3D de haute résolution et 5 um autrement). </li></ol></li><li> Définissez l&#39;intervalle time-lapse par le passage à l&#39;écran Time-Lapse et en entrant le temps écoulé désiré dans le champ Time-Lapse. Pour une résolution temporelle optimale définir l&#39;intervalle de temps de 0 sec pour l&#39;imagerie en continu. Remarque: Pour une longue imagerie time-lapse il est recommandé de définir l&#39;intervalle de temps de 10 secondes entre les acquisitions pour reconstituer le liquide d&#39;immersion objectif. </li><li> Une fois les paramètres pour l&#39;imagerie ont été déterminés, injecter lentement 155 kDa dextran-TMR. <ol><li> Retirez la seringue avec du PBS dans le cathéter veine de la queue et le remplacer par la seringue contenant 155 kDa dextran-TMR en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans le line. </li><li> Lentement injecter 155 kDa dextran-TMR dans la souris, avec un volume maximum de 200 pi, et remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS. ÉTAPE CRITIQUE: Effectuer l&#39;injection lentement et prendre des précautions pour éviter d&#39;avoir une solution en dehors de la veine. </li></ol></li><li> Démarrer l&#39;acquisition de la Z-stack imagerie time-lapse en cliquant sur les boutons Time-Lapse Z-Stack et de les appuyer et puis en cliquant sur le bouton d&#39;enregistrement. </li><li> Si d&#39; autres dextranes fluorescents, à savoir, isothiocyanate 10 kDa dextran-fluorescéine (FITC), ou des protéines, à savoir, VEGFA 165, ont été préparés à l&#39; avance, les injecter après le début de l&#39; acquisition d&#39;images pour au = 0 min début. <ol><li> Retirez la seringue avec du PBS dans la veine cathéter de queue et le remplacer par la seringue contenant 10 kDa dextran-FITC ou VEGFA 165 en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans la ligne. </li><li> Injecter lentement injectables dans la souris à travers le cathéter dans la veine caudaleet remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS. </li></ol></li><li> Chaque 30 à 45 minutes, injecter lentement 50 ul de PBS ou de solution saline pour maintenir l&#39;hydratation de l&#39;animal. </li></ol> 8. euthanasie <ol><li> A la fin de l&#39;acquisition d&#39;images, euthanasier l&#39;animal. <ol><li> Augmenter le isoflurane à 5%. </li><li> Gardez l&#39;animal de moins de 5% d&#39;isoflurane jusqu&#39;au 30 sec après qu&#39;il cesse de respirer et enlever l&#39;animal de la scène. </li><li> Effectuer la dislocation cervicale pour assurer l&#39;euthanasie complète. </li></ol></li></ol> Traitement 9. Image <ol><li> Acquérir des images à des fichiers TIFF 16 bits pour chaque canal individuel à chaque point de temps et économiser de manière séquentielle. </li><li> Effectuer la séparation de chevauchement spectral (c. -à- GFP et PCP), l&#39; élimination de la dérive xy et la génération de films à partir de séquences de time-lapse en utilisant des méthodes établies dans ImageJ 9. Effectuer 3D reconstructions de surface des images à haute résolution 13. </li></ol>

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<li>Yano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+FUCCI+imaging+of+each+cell+in+a+tumor+demonstrates+locational+dependence+of+cell+cycle+dynamics+and+chemoresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness.</a> Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).</li>
<li>Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+subcellular+multicolor+imaging+of+tumor-host+interaction+and+drug+response+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time.</a> Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).</li>
<li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+conversion+between+distinct+tumor+vascular+morphologies+and+localized+vascular+response+to+Sunitinib%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib.</a> Intravital. 2 (1), 24790(2013).</li>
<li>Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cancer+growth+and+invasion%3A+a+modified+skin-fold+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model.</a> Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

les interactions cellulaires qui se produisent spontanément dans le microenvironnement tumoral peut conduire à des modifications de la motilité des cellules tumorales et intravasculaire. Haute résolution intravitale imagerie du tissu tumoral en temps réel permet de visualiser la dynamique multicellulaire qui peut être très 10,13,24 transitoire. Point final dans des essais in vivo ou images time-lapse acquises avec des points de temps discrets peuvent fournir des informations essentielles sur...

Dissémination des cellules tumorales de la tumeur mammaire primaire a été montré que des cellules tumorales implique non seulement, mais les cellules hôtes stromales, y compris les macrophages et les cellules endothéliales. En outre, le système vasculaire tumoral est anormale avec une augmentation de la perméabilité. Ainsi, la détermination de la façon dont les cellules tumorales, les macrophages et les cellules endotheliales interagissent pour médier la perméabilité vasculaire et intravasculaire de cellules tumorales dans le microenvironnement de la tumeur primaire est importante pour la compréhension des métastases. La compréhension de la cinétique de la perméabilité vasculaire, intravasculaire de cellules tumorales et le mécanisme de signalisation sous-jacente des interactions multicellulaires dans le microenvironnement tumoral peut fournir des informations cruciales dans le développement et l&#39;administration des traitements anti-cancéreux. Le moyen principal de l&#39; étude de la perméabilité vasculaire tumorale in vivo a été la mesure des colorants extravasculaires tels que le bleu d&#39; Evans 2, les dextrans de haut poids moléculaire (155 kDa)3 et fluorophore ou des protéines de radiotraceurs conjugués (y compris l&#39; albumine) 4 en des points fixes de temps après l&#39; injection du colorant. Les progrès de la microscopie, des modèles animaux et des colorants fluorescents ont permis la visualisation des processus cellulaires et la perméabilité vasculaire chez les animaux vivants par microscopie intravitale 5. Imagerie animale en direct avec l&#39;acquisition d&#39;images statiques ou de courtes séquences time-lapse sur plusieurs points de temps ne permet pas à la compréhension complète des événements dynamiques dans le microenvironnement de la tumeur 6,7. En effet, l&#39; acquisition d&#39;image statique au cours de 24 heures a montré que le système vasculaire tumoral est non étanche, mais la dynamique de la perméabilité vasculaire n&#39;a pas été observée 6. Ainsi, l&#39;imagerie en continu prolongé le temps écoulé jusqu&#39;à 12 heures capture la cinétique d&#39;événements dynamiques dans le microenvironnement tumoral. Ce protocole décrit l&#39;utilisation de longue time-lapse multiphotla microscopie intravitale pour étudier les événements dynamiques multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. plusieurs types de cellules dans le microenvironnement tumoral sont marquées avec des colorants injectables ou en utilisant des animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes. Au moyen d&#39;un cathéter veine de la queue des colorants ou des protéines vasculaires peuvent être injectées après le début de formation d&#39;image pour acquérir des données d&#39;événements cinétique multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. Pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de la tumeur mammaire est exposée à travers la préparation chirurgicale d&#39;un lambeau de peau. Les images sont acquises jusqu&#39;à 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé de tubes photomultiplicateurs multiples (PMT) détecteurs 8. À l&#39;aide de filtres appropriés, un algorithme de soustraction permet de 4 détecteurs pour acquérir PMT 5 signaux fluorescents dans le microenvironnement tumoral simultanément 9. La microscopie à haute résolution multiphotonique intravitale capture seule résolution cellulaire imagerie des interactions tumeur-stroma dans le microenvironnement de la tumeur, ce qui conduit à une meilleure uCOMPRENDRE de la perméabilité vasculaire et des cellules tumorales intravasation 10-13. Plus précisément, l&#39; imagerie intravitale révélés très localisés, les accidents vasculaires transitoires étendues de perméabilité sélective qui se produisent au niveau des sites d&#39;interaction entre une cellule tumorale, un macrophage et une cellule endothéliale (défini comme le microenvironnement tumoral des métastases, TMEM 14) 13. En outre, intravasculaire de cellules tumorales se produit uniquement à TMEM et est spatialement et temporellement corrélée avec la perméabilité vasculaire 13. résolution cellulaire unique de la dynamique de ces événements a été rendue possible grâce à l&#39;utilisation de longue time-lapse multiphoton microscopique des cellules marquées par fluorescence dans le microenvironnement de la tumeur.

<table><tbody><tr><td>155 kDa dextran-tétraméthylrhodamine isothiocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td>reconstituent à 20 mg/ml dans 1x PBS</td></tr><tr><td>70 kDa dextran-Texas</td><td>Red Life Technologies</td><td>D-1830</td><td>reconstituent à 10 mg/ml dans 1x PBS</td></tr><tr><td>10 kDa dextran-fluorescéine isothyocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S</td><td>reconstituent à 20 mg/ml dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td><td>Life Technologies</td><td>Q21561MP</td><td>Diluer 25 &#956 ; l sur 175 &#956 ; l de 1x PBS pour injection</td></tr><tr><td>MMTV-PyMT souris</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-ECFP souris (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Csf1r-EGFP</td><td>souris Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurane)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>Seringue de 250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 1 ml, embout à tuberculine</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1 (0,3 mm x 25) mm) aiguille</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène micro tube médical&nbsp ;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>0,28 mm de diamètre intérieur x 0,64 mm de diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Verre de protection pour microscope</td><td>Corning</td><td>2980-225</td><td>épaisseur 1,5, 22 x 50 °C ; mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseOxymètre de pouls STAT, logiciel et capteurs</td> Ruban de laboratoire <td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>tampon en caoutchouc souple</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>Film de polyuréthane ultra-doux, 3/16" Épais, 12 po x 12 po, duromètre 40 oo,</td></tr><tr><td>dos uni Tampon en caoutchouc dur</td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>Feuille de caoutchouc néoprène haute résistance 1/4 po d’épaisseur, 12 po x 12 po, 50 po ; Un microscope durométrique</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>Le microscope est un microscope multiphotonique à deux lasers construit sur mesure, basé sur un support Olympus IX-71 utilisant un objectif 20X 1.05NA.</td></tr>Jeu <tr><td>de 7 poinçons</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td><td>Diamètre de trou de 1/4 » à 1 », pour perforatrice à percussion</td></tr></tbody></table>

time-lapse extended imagerie intravitale du temps réel multicellulaire dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Dans le microenvironnement tumoral, les cellules stromales de l’hôte interagissent avec les cellules tumorales pour favoriser la progression tumorale, l’angiogenèse, la dissémination des cellules tumorales et les métastases. Les interactions multicellulaires dans le microenvironnement tumoral peuvent entraîner des événements transitoires, notamment la motilité directionnelle des cellules tumorales et la perméabilité vasculaire. La quantification de la perméabilité vasculaire tumorale a souvent utilisé des expériences finales pour mesurer l’extravasation des colorants vasculaires. Cependant, en raison de la nature transitoire des interactions multicellulaires et de la perméabilité vasculaire, la cinétique de ces événements dynamiques ne peut pas être discernée. En marquant les cellules et le système vasculaire avec des colorants injectables ou des protéines fluorescentes, la microscopie intravitale à haute résolution a permis de visualiser directement et en temps réel les événements transitoires dans le microenvironnement tumoral. Nous décrivons ici une méthode d’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie intravitale étendue chez des souris vivantes afin de visualiser directement la dynamique multicellulaire dans le microenvironnement tumoral. Cette méthode détaille les stratégies de marquage cellulaire, la préparation chirurgicale d’un lambeau de peau mammaire, l’administration de colorants ou de protéines injectables par cathéter de veine caudale et l’acquisition d’images en time-lapse. Les séquences time-lapse obtenues à partir de cette méthode facilitent la visualisation et la quantification de la cinétique des événements cellulaires de motilité et de perméabilité vasculaire dans le microenvironnement tumoral.

La microscopie Extended time-lapse intravitale permet seule résolution cellulaire imagerie des processus multicellulaires dans le microenvironnement de la tumeur. Par les cellules tumorales marquage par fluorescence, les macrophages, l&#39;espace vasculaire et de visualiser le réseau de fibres de collagène en utilisant le deuxième signal de génération d&#39;harmoniques, de multiples compartiments dans le microenvironnement tumoral sont simultanément suivis au cours de l&#39;imagerie. Les...

Ce protocole décrit l&#39;utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d&#39;interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d&#39;une seule cellule.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les événements dynamiques au sein du microenvironnement tumoral à l'aide de la microscopie multiphoton intravitale à haute résolution. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le microenvironnement tumoral, telles que les événements dynamiques impliqués dans la perméabilité vasculaire et les interactions multicellulaires. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer et de mesurer la cinétique des événements survenant dans le microenvironnement tumoral.Avant de commencer la procédure, allumez tous les composants du microscope et du laser, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs. Réglez la boîte de chauffage sur 30 degrés Celsius pour préchauffer la platine. Essuyez la platine du microscope et l'insert de platine avec de l'éthanol à 70 %.Lorsque la platine est sèche, déposez une grande goutte d'eau sur l'objectif microscopique 25 x 1,05 NA afin de maintenir le contact optique avec la lame couvre-objet, puis placez une lame couvre-objet d'épaisseur n° 1,5 sur le port d'imagerie de l'insert. Ensuite, coupez un morceau de tube en polyéthylène de 30 centimètres de longueur. Placez le tampon en caoutchouc au-dessus de la lame couvre-objet.À l’aide de pinces, détacher une aiguille de calibre 31 de son embout en plastique et insérer l’extrémité émoussée de la canule dans le tube. Insérer puis fixer une aiguille de calibre 31 à l’autre extrémité du tube en PE. Ensuite, remplir une seringue d’un cc de PBS stérile et fixer la seringue à l’aiguille de calibre 31.Utilisez le PBS pour chasser tout l'air hors du tube et de l'aiguille. Ensuite, chargez une seringue d'un cc avec 200 microlitres du marqueur vasculaire approprié et une autre avec la protéine injectable appropriée. Avant de commencer la chirurgie, vérifiez l'anesthésie adéquate par l'absence de réponse à une pincée des orteils et appliquez des pommades oculaires à la souris anesthésiée.Ensuite, placez l'animal sur une plateforme chirurgicale sous une lampe chauffante afin d'augmenter la circulation sanguine dans la queue. Après deux minutes, stérilisez la queue avec de l'éthanol à 70 % et insérez l'extrémité du cathéter de calibre 31, de deux à trois millimètres dans la veine latérale de la queue. Puis, fixez un morceau de ruban adhésif de laboratoire d'un centimètre de longueur sur le cathéter afin de maintenir l'aiguille parallèle à la veine sur toute la longueur de la queue.Une fois le cathéter fixé, passez de l'éthanol à 70 % sur les surfaces ventrale et tumorale. Ensuite, soulevez la peau au-dessus de l'abdomen et utilisez des ciseaux stériles pour pratiquer une incision sous-cutanée d'environ un centimètre le long de la ligne médiane ventrale de l'abdomen, en prenant soin d'éviter de percer le péritoine. Coupez délicatement les tissus conjonctifs reliant la glande mammaire et la tumeur au péritoine afin d'exposer la tumeur.Ensuite, à l’aide des ciseaux et de la pince, retirer délicatement la fascia et la graisse de la surface exposée de la tumeur. Une fois la tumeur exposée, transférer la souris sur la platine d’imagerie préchauffée. Utiliser du ruban adhésif de laboratoire pour fixer le couvre-objet, puis placer la tumeur dans le trou d’un tampon en caoutchouc recouvrant le couvre-objet au-dessus de l’objectif du microscope.Lorsque l'animal est en position, remplir la chambre du coussin en caoutchouc avec du PBS afin de maintenir l'hydratation du tissu et d'assurer un contact optique avec la lame de couverture. Placer un capteur de collier de pulsioxymètre autour du cou pour surveiller les signes vitaux de l'animal et positionner la boîte chauffante au-dessus de l'animal. Ensuite, utiliser les IP du microscope pour focaliser sur les cellules tumorales fluorescentes situées à la surface de la tumeur et identifier une zone présentant des vaisseaux sanguins avec écoulement sanguin.Une fois qu'une région d'intérêt a été sélectionnée, passez le microscope en mode d'imagerie multiphotonique et utilisez le réglage de focalisation pour déplacer l'objectif à l'endroit de départ souhaité. Ensuite, cliquez sur le bouton supérieur de position Z pour définir la limite supérieure de la série en z et visualiser le réseau de fibres de collagène à la surface de la tumeur dans le canal de génération de seconde harmonique. Puis, déplacez l'objectif à la profondeur d'imagerie souhaitée et cliquez sur le bouton inférieur de position Z pour définir la limite inférieure de la série en z.Ensuite, saisissez la valeur souhaitée dans les champs de taille de pas. Puis, passez au panneau de prise de vue temporelle et entrez le temps de pause approprié. Une fois les paramètres d'acquisition déterminés, remplacez la seringue fixée au cathéter par une seringue contenant un colorant de marquage vasculaire et administrez lentement un maximum de 200 microlitres de la solution colorante, en veillant à ce que la solution pénètre dans la veine.Après l'injection, remettez la seringue de PBS sur le cathéter et commencez l'acquisition en laps de temps selon l'axe z. Une fois toutes les images obtenues, remplacez la seringue de PBS par celle contenant la protéine injectable, en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans la ligne. Ensuite, injectez lentement la suspension protéique dans la souris et remplacez la seringue par une seringue contenant du PBS.Les macrophages peuvent être suivis à l'aide de dextran marqué par un fluorochrome de 70 kilodaltons, qui s'accumule dans les micromacrophages phagocytaires. Le double marquage des cellules tumorales et des micromacrophages permet de visualiser en temps réel l'interaction directe entre ces deux types cellulaires. Pour visualiser les changements de perméabilité vasculaire tumorale, des points quantiques peuvent également être utilisés pour marquer l'espace vasculaire.Étant donné leur taille suffisamment importante pour qu'ils ne diffusent pas facilement à travers les espaces interartériels. L'imagerie continue à haute résolution permet de capturer les événements de perméabilité vasculaire et de quantifier la cinétique de l'extravasation et de l'élimination du dextran. Dans ce champ d'observation exemple, le pic d'extravasation vasculaire double est observé entre 29 et 34 minutes, comme en témoigne le signal TMR extravasculaire.L'injection de colorants ou de protéines vasculaires supplémentaires afin d'induire une perméabilité vasculaire peut fournir des informations sur les événements de signalisation régulant cette perméabilité. En effet, durant les premières secondes suivant l'injection, on observe l'extravasation du dextran marqué par la FITC de 10 kilodaltons à partir du réseau vasculaire, tandis que le dextran marqué par le TMR de 155 kilodaltons reste confiné à l'espace vasculaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'ôter délicatement le tissu conjonctif sans endommager la surface de la tumeur et de maintenir l'hydratation de la surface tumorale. En suivant cette procédure d'étude de la dynamique cellulaire, la migration des cellules tumorales peut être visualisée afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la directionnalité de la migration des cellules tumorales et l'intravasation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de visualiser des événements cellulaires dynamiques dans un microenvironnement tumoral par microscopie multiphoton intravitale.

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Nous présentons une nouvelle approche pour quantifier la localisation des nanoparticules dans le système vasculaire des tumeurs humaines xénogreffées aide dynamique, imagerie en temps réel intravitale dans un modèle d'embryon aviaire.

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Nous décrivons une méthode d'imagerie de la réponse à un traitement...

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

La matrice extracellulaire subit un remodelage important lors de la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la tumorigenèse. Nous présentons une nouvelle approche de microscopie par immunofluorescence intravitale de visualiser la dynamique des fibrillaire ainsi que maille-comme composants de la matrice avec une résolution spatiale et temporelle en utilisant épifluorescence ou la microscopie à deux photons.

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Ici nous décrivons une méthode pour l'imagerie multiphoton de time-lapse de haute résolution des cellules de tumeur de cerveau avant et après l'intervention chirurgicale invasive (par exemple, biopsie) dans le même animal vivant. Cette méthode permet d'étudier l'impact de ces procédures chirurgicales invasives sur le comportement migratoire, invasif et proliférant des cellules tumorales à un seul niveau cellulaire.

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Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

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Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

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Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

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