De cellules souches Basé Immunité Engineered contre l'infection à VIH dans le modèle humanisé Souris

L’objectif global de cette procédure est de créer une souris humanisée modifiée avec un récepteur antigénique chimérique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du VIH et de l’immunologie en ce qui concerne l’évaluation de l’efficacité de l’immunité artificielle à base de cellules souches contre l’infection par le VIH et d’autres infections chroniques et tumeurs malignes. Comme un mécanisme d’échec immunitaire et des moyens d’améliorer le système immunitaire et de développer une thérapie pour créer une meilleure immunité antivirale ou antitumorale.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est capable d’un grand nombre de manipulations expérimentales. Le modèle de souris BLT humanisées imite l’immunité humaine et, dans ce cas, permet des essais précliniques de thérapies géniques cellulaires contre l’infection par le VIH. Valerie Rezek et Brianna Lam, techniciennes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Commencez par utiliser des scalpels pour couper le thymus en petits morceaux d’environ un millimètre cubes dans un plat contenant du milieu RPMI supplémenté. Ensuite, à l’aide d’une pince émoussée incurvée, placez chaque morceau de thymus dans un seul puits sur une plaque de 96 puits. Ajoutez 100 à 200 microlitres de média dans tous les puits afin que le tissu ne sèche pas.

Visualisez le tissu au microscope pour éliminer tout tissu qui n’est peut-être pas du thymus ou qui a du tissu conjonctif attaché. Ensuite, retirez les morceaux de thymus confirmés, combinez-les dans une fiole de culture cellulaire T25. Ajoutez sept millilitres de milieu RPMI supplémenté en antibiotiques dans le flacon et secouez doucement pour mélanger.

Placez ensuite le ballon dans l’incubateur de culture tissulaire. Cette étape empêche la contamination bactérienne des tissus. Commencez l’isolement des CSH CD34 positives du foie fœtal à l’aide de deux scalpels pour couper le foie en petits morceaux d’environ trois millimètres cubiques dans une boîte contenant de l’IMDM.

Retirez et jetez tout tissu conjonctif blanc. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille émoussée de calibre 16 pour retirer les morceaux de foie et les supports et transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres. Prélevez doucement et expulsez cinq à sept fois de plus pour homogénéiser complètement le tissu.

Après avoir préparé 10 millilitres de milieu IMDM, complétez-le avec de la collagénase, de l’hyaluronidase, des antibiotiques, de la Dnase et des antifongiques. Passez le média à travers un filtre de 0,22 micron. Ajoutez ensuite le média filtré à la suspension hépatique.

Après avoir bouché le tube conique de 50 millilitres contenant la suspension hépatique, fermez hermétiquement avec un film auto-obturant tel que le parafilm pour éviter les fuites. Faites pivoter un rotateur de tube dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après l’incubation, filtrez la suspension cellulaire digérée à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un tube frais de 50 millilitres.

Ajoutez du PBS à la suspension pour porter le volume total à 50 millilitres. Divisez-le en deux tubes de 50 millilitres, contenant chacun 25 millilitres de suspension cellulaire. Ralentir et sous-couche doucement les cellules de chaque tube avec 10 millilitres d’un milieu de centrifugation de densité, tel que Ficoll.

Essorer à 1200 fois g pendant 20 minutes sans pause. Après la centrifugation, retirez soigneusement l’interface de chaque tube et transférez-la dans deux tubes séparés de 50 millilitres. Portez le volume de chaque tube d’interface jusqu’à 50 millilitres avec PBS.

Et puis centrifuger à 300 fois g pendant sept à 10 minutes. Combinez et lavez les granulés cellulaires trois fois avec 50 millilitres de PBS contenant deux pour cent de FBS, en essorant à 300 fois g pendant sept à 10 minutes à chaque fois. Après l’essorage final, remettez la pastille en suspension dans 50 millilitres de média RPMI plus 10 % de FBS.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, triez immédiatement les cellules CD34 positives à l’aide d’un kit de tri CD34 selon le protocole du fabricant, et enregistrez les fractions CD34 positives et CD34 négatives. Versez les morceaux de thymus et le milieu de la fiole dans un plat de 60 millimètres.

Refroidissez quelques pointes de pipette à déplacement positif en les plaçant dans des tubes à vis stériles ouverts de 1,5 millilitre sur de la glace. Placez également les granules de cellules et un volume de mélange de protéines gélatineuses tel que le matrigel sur de la glace. Anesthésie les souris receveuses avec un anesthésique injectable selon un protocole animal approuvé.

Vérifiez le niveau d’anesthésie de la souris en serrant une patte. L’absence de réaction au pincement indique un plan chirurgical de l’anesthésie. Rasez le côté gauche de chaque souris de la hanche à l’épaule entre le centre du dos et le ventre.

Injectez par voie sous-cutanée six milligrammes par kilogramme de carprofène dilué dans l’épaule ou le triangle inguinal de l’animal. Rincer la canule du trocart avec du PBS dans une parabole de 60 millimètres. À l’aide d’une paire de pinces incurvées émoussées, placez un morceau de thymus de la boîte de 60 millimètres juste à l’intérieur de l’ouverture de la canule, puis tirez sur le trocart pour aspirer le tissu dans la canule.

Ensuite, à l’aide d’une pipette à déplacement positif et d’une pointe réfrigérée, ajoutez cinq microlitres de mélange de protéines gélatineuses froides dans le tube contenant la pastille cellulaire. Et remuez doucement pour générer la suspension cellulaire. Pipetez la suspension cellulaire dans l’ouverture de la canule et tirez lentement sur le trocart pour charger l’aiguille.

Frottez la zone rasée de la souris avec de la povidone iodée suivie d’isopropényle trois fois. Déterminez la tache la plus foncée sous la peau qui indique l’emplacement de la rate. Le rein mesure environ cinq millimètres dorsal par rapport à la rate.

Après avoir assuré un niveau d’anesthésie approprié par l’absence de réaction du pincement de la patte, utilisez des pinces incurvées pour soulever la peau et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision de 15 millimètres dans la peau parallèlement à la rate. Faites ensuite une coupe similaire dans la couche de péritoine ci-dessous. Chez les mâles, le rein est facilement visible, donc extrudé simplement en appuyant sur l’abdomen.

Soutenez le rein à l’aide d’un hémostatique ou d’une paire de pinces émoussées incurvées. Chez les femelles, les ovaires ont tendance à bloquer le rein pour faciliter l’extraction. À l’aide d’un hémostat, prélevez l’ovaire et exposez soigneusement le rein.

À l’aide d’une pince à pointe d’aiguille, percez un petit trou à l’extrémité postérieure de la capsule rénale. Faites glisser le trocart dans ce trou et le long du rein jusqu’à ce que l’ouverture de la canule soit complètement recouverte par la capsule rénale. Extrudez doucement le tissu sous la capsule rénale et tirez le trocart vers l’extérieur.

Utilisez la pince incurvée pour vous assurer que le morceau de thymus ne ressort pas avec l’aiguille. Ensuite, soulevez le péritoine à l’aide de la pince et utilisez doucement l’hémostat pour remettre le rein en place. Faites un point de suture double avec une suture chirurgicale dans le péritoine.

Placez également deux clips Autoclips Wound pour fermer la peau. Mélangez maintenant les cellules CD34 positives transduites et aspirez 0,5 fois 10 aux six cellules d’un volume de 100 microlitres dans une seringue à insuline. Injectez ces cellules dans la souris par injection de veine rétro-orbitale.

Après l’injection, appliquez une petite goutte de lubrifiant pour les yeux sur chaque œil et allongez la souris sur le côté dans une cage. Après avoir implanté toutes les souris, confirmez que les animaux ont retrouvé la conscience et qu’ils sont ambulatoires avant de les ramener dans la salle d’hébergement. Des souris ont été sacrifiées 10 semaines après l’opération et du sang, de la rate, du thymus et de la moelle osseuse ont été prélevés.

Les cellules résultantes ont été colorées avec des anticorps CD45 et CD4 humains et analysées par cytométrie en flux. Comme on le voit ici, les cellules modifiées par le récepteur antigénique chimérique CD4 peuvent être détectées dans plusieurs tissus lymphoïdes par cytométrie en flux. Les cellules modifiées par le récepteur antigénique chimérique CD4 peuvent se différencier en plusieurs lignées.

Ici, des splénocytes de souris modifiées par le récepteur antigénique chimérique CD4 ont été récoltés et colorés pour les marqueurs des lymphocytes T et B. Les cellules négatives pour les marqueurs des lymphocytes T et B étaient positives pour les marqueurs des monocytes et des macrophages et pour les cellules tueuses naturelles. Les splénocytes de souris infectées par le VIH ayant un récepteur antigénique chimérique CD4 ont été stimulés avec des cellules T 1 infectées ou non infectées par le VIH, et leur production intracellulaire de cytokines est démontrée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire des souris BLT humanisées modifiées avec des récepteurs antigéniques chimériques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 heures si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler à un rythme régulier et de porter une attention particulière à l’état de la souris opérée.

Pour les débutants, il est important de pratiquer la chirurgie et les injections oculaires avant de travailler avec des tissus et des cellules souches plus précieux. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du VIH et d’autres maladies infectieuses pour explorer la pathogenèse des maladies et les thérapies immunitaires dans le modèle murin humanisé.