Name: Létude de lOrganisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Découvrez l'organisation supramoléculaire des membranes photosynthétiques dans les tissus foliaires par cryo-microscopie électronique à balayage. Cette méthode de cryofracturation à haute pression permet d'imager les thylakoïdes dans leur contexte cellulaire natif.

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Nous remercions Andres Kaech (Université de Zurich) pour ses conseils utiles sur la numérisation imagerie par microscopie électronique. Ce travail a été soutenu par le Fonds des États-Unis-Israël binationale de recherche agricole et le développement (subvention no. US-4334-10, ZR), la Science Foundation Israël (subvention no. 1034/12, ZR) et le Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Les études de microscopie électronique ont été réalisées à l&#39;Irving et le Centre Moskowitz Cherna pour Nano et Bio-Nano Imaging à l&#39;Institut Weizmann des Sciences.

1. Cryo-fixation de feuilles Tissues par haute pression de congélation Remarque: Cette section décrit comment effectuer la congélation à haute pression des tissus foliaires pour une expérience de fracture par congélation. Pour des raisons liées à des échantillons de plantes voir 29. Ceci peut être adapté à d&#39;autres types de tissus ou des échantillons avec quelques modifications. <ol><li> En utilisant l&#39;angle d&#39;une lame de rasoir, gratter le fond de la cavité de 0,1 mm d&#39;une plaquette d&#39;aluminium de 0,1 / 0,2 mm (figure 1). Préparer au moins une douzaine de plaquettes (6 échantillons). Prenez garde de ne pas créer des marques de couteau sur le pourtour du disque. <ol><li> Après avoir gratté, laver les disques dans l&#39;éthanol absolu, laissez-les sécher et conserver dans un plat propre. </li></ol></li><li> Préparer la machine de congélation à haute pression selon les instructions du fabricant. Remplir la chambre d&#39;alcool de la machine de congélation à haute pression avec de l&#39;isopropanol. </li><li> Préparer un vide-assisté infiltratio fait maisonn dispositif pour remplacer le gaz trouvé dans le tissu de la feuille avec du liquide. <ol><li> Étroitement connecter une pointe de pipette 200 pi à l&#39;extrémité d&#39;une seringue de 10 ml. Coupez ~ 1 cm de la pointe. Faire un trou dans le bouchon d&#39;un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml pour adapter étroitement la pointe de coupe. Le vide peut être créé à l&#39;intérieur du tube en tirant le piston de la seringue. </li></ol></li><li> Coupez un petit morceau de feuille de la plante à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir et avec des pincettes placer la feuille dans un tube de microcentrifugeuse à moitié rempli avec 1-hexadécène. Infiltrer les espaces intercellulaires de la feuille avec le liquide en tirant doucement sur le piston pour créer le vide, maintenez pendant environ 30 secondes, puis relâchez lentement le piston. </li><li> Retirez la pièce du tube en utilisant des pinces de feuilles. Coupez la feuille avec une lame de rasoir dans le cas où il est plus épais que 0,2 mm et couper un petit morceau qui rentre dans une plaquette. </li><li> Placez une plaquette propre avec le côté rayé vers le haut dans le support de la machine de congélation, puis placez le morceau de le coupeaf dans la plaquette. Remplir l&#39;espace restant autour de la feuille avec le 1-hexadécène. Refermer le sandwich en utilisant une autre plaquette, avec les rayures face à la feuille. </li><li> Fermez et serrez le support et l&#39;insérer dans la chambre de la machine. Appuyez ensuite sur le bouton &#39;Jet&#39; à geler (~ 2.100 bars pour 300-500 msec), et transférer rapidement le support dans l&#39;azote liquide. Retirez délicatement le sandwich congelé du support en utilisant des pinces pré-refroidi, en prenant soin de ne pas rompre le sandwich. Remarque: sandwichs congelés peuvent être fermés gel fracturé immédiatement ou conservés dans l&#39;azote liquide pour une utilisation ultérieure. Utiliser des vêtements de protection et des lunettes lors de la manipulation de l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. Geler-fracture et double couche de revêtement 27,28 <ol><li> Préparer la machine de rupture de gel destiné à être utilisé, y compris les pistolets pour l&#39;évaporation du platine / carbone (Pt / C) et de carbone, selon les instructions du fabricant. Placez le pistolet Pt / C à 45 degrés une pistolet de carbone à 90 degrés. <ol><li> Pré-programme un système de revêtement d&#39;une couche de 2 nm de Pt / C (taux de revêtement de 0,02 à 0,04 nm / sec) et une couche de 6 nm de carbone (à ~ 0,1 nm / sec). <ol><li> Entrez la configuration sur l&#39;écran de la machine-gel de fracture. Sélectionnez un numéro d&#39;utilisateur où le système de revêtement sera sauvé. </li><li> Choisissez Pt / C pour &#39;la couche 1&#39;. Sélectionnez un laps de temps, par exemple., 5 min (à dépasser le temps nécessaire requis pour compléter le revêtement). Utilisez les flèches haut-bas pour définir une épaisseur de 2 nm. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;Layer&#39; pour passer à la couche 2. Répétez l&#39;étape 2.1.1.2, à l&#39;exception de sélection du carbone et de définir une épaisseur de 6 nm. </li></ol></li><li> Testez et régler le fonctionnement des armes à feu. <ol><li> Sélectionnez &#39;Couche 1&#39;. Sélectionnez le / C gun Pt en appuyant sur le bouton &#39;GUN1&#39; et appuyez sur le bouton «ON» sur l&#39;unité de la machine-gel de fracture contrôle de l&#39;évaporation. Surveiller le taux d&#39;évaporation et de l&#39;ajuster en utilisant la tension et d&#39;émission boutons until atteint un taux de de 0,02 à 0,04 nm / sec. Appuyez sur &#39;OFF&#39; pour désactiver le pistolet Pt / C. </li><li> Sélectionnez &#39;Layer 2&#39;. Répétez 2.1.2.1, sauf sélectionnez &#39;GUN2&#39; et ajuster pour un taux de ~ 0,1 nm / sec évaporation. </li></ol></li></ol></li><li> Refroidir le stade du système de fractures de gel à -140 ° C ou -160 ° C (pour les feuilles hydratées ou déshydratées, respectivement). Fixer la navette de transfert de cryo sous vide à la machine et remplir sa chambre avec de l&#39;azote liquide. Pression dans la chambre cryofracturation refroidie est généralement comprise entre 1 - 8 x 10 -7 mbar. </li><li> Insérez un porte-échantillon de gel de fracturation (adapté pour 3 mm plaquettes) dans la station de chargement. Inonder la chambre de poste de chargement avec de l&#39;azote liquide. </li><li> Chargez deux sandwichs surgelés sur la seule porte par un à l&#39;aide des pinces de qualité de haute précision. Serrer le premier sandwich dans le support et puis retourner le support sur pour vérifier qu&#39;il correspond bien en place. Répétez l&#39;opération pour le deuxième sandwich. </li><li> réEtach la navette refroidie de la machine de rupture de gel et de le connecter à la station de chargement. Ouvrez la vanne de navette, introduire le bras de rétraction dans le support et le verrouiller en place. Re-introduire le bras avec le support dans la navette et fermer le robinet de la navette en utilisant le bouton de la station de chargement. Fixer la navette à la machine cryofracture et d&#39;introduire le support dans la chambre avec le bras de rétraction. Détachez la navette de la machine. </li><li> Alignez le couteau de microtome gel de fracture à une hauteur telle qu&#39;elle délogeant les meilleurs plaquettes des sandwiches. </li><li> Avec le couteau microtome, briser rapidement les sandwiches, puis immédiatement le relever pour éviter la contamination des échantillons par des débris accroché au couteau, et tourner le volet refroidi au-dessus du plan nouvellement exposée pour protéger les échantillons de la contamination possible par des molécules d&#39;eau dans la chambre. </li><li> Enduire les échantillons avec le platine et le carbone. <ol><li> Entrez «couche 1» sur la screen. Allumez le / C gun Pt en appuyant sur le bouton «GUN1» suivie du bouton &#39;ON&#39;. Examiner le taux d&#39;évaporation et une fois qu&#39;il atteint de 0,02 à 0,04 nm / sec, exposer simultanément les échantillons et appuyez sur le bouton &#39;Mesure&#39; pour contrôler l&#39;épaisseur de la couche déposée. Remarque: Gun sera éteint automatiquement lorsque l&#39;épaisseur a atteint la valeur pré-sélectionnée. </li><li> Couvrir les échantillons avec l&#39;obturateur lorsque Pt / C évaporation est terminée. </li><li> Appuyez sur le bouton &#39;Layer&#39; pour passer à «couche 2». Répéter les étapes 2.8.1 et 2.8.2, à l&#39;exception de la sélection &quot;GUN2 &#39;(pour le carbone) et un taux de ~ 0,1 nm / s évaporation. </li></ol></li><li> Chauffer la phase du système de fractures de gel à -120 ° C. </li></ol> 3. Cryo-microscopie électronique à balayage <ol><li> Préparer le microscope électronique à balayage pour les travaux de cryo. <ol><li> Sélectionnez Étape / Stage Initialisation dans le menu principal et validez. </li><li> Sélectionnez Outils / Goto Panel, et ouvrez le panneau &#39;Airlock&#39; en le sélectionnant dans la liste. Cliquez sur le bouton «Fermer Colonne Chambre Valve. Purger la chambre de microscope en cliquant sur le bouton de ventilation sous l&#39;onglet «à vide». </li><li> Sélectionnez Outils / Panneau de Goto, et ouvrez le panneau &quot;Liste des points d&#39;étape». Sélectionner la position de cryo-échange pour déplacer la scène aux coordonnées adéquates pour recevoir le support d&#39;échantillon. Remarque: La position «cryo-échange» est réglé pour être en alignement avec la position de l&#39;unité de transfert sous vide. </li><li> Ouvrez la chambre de l&#39;échantillon avec une paire de gants propres et insérez le cryo-étape sur la scène principale du microscope. Fermez la chambre et cliquez sur le bouton de la pompe sous l&#39;onglet &#39;vide&#39;. </li><li> Refroidir le microscope à -120 ° C. Remplir le microscope Dewar d&#39;azote liquide. Activez la fonction de la chaleur sur l&#39;unité de commande cryo-transfert à -120 ° C lorsque la température de l&#39;étape descend en dessous de -120 ° C. </li></ol></li><li> attach la navette cryo-transfert au microscope et transférer le porte-échantillon à l&#39;aide du bras rétractable dans l&#39;étape microscope cryo (comme à l&#39;étape 2.5). Détachez la navette du microscope. </li><li> Cliquez sur le bouton &#39;Ouvrir la colonne Chambre Valve »dans le panneau de Airlock. </li><li> Déplacez doucement le porte-échantillon proche de l&#39;objectif (travail à distance 1 - 2 mm) à l&#39;aide du joystick. Sélectionnez une ouverture de 10 pm dans l&#39;onglet &#39;Apertures&#39;. Double-cliquez sur le champ EHT dans l&#39;onglet &#39;Gun&#39;. Entrez 10 (kV) pour la cible EHT et cliquez sur OK. Cliquez sur l&#39;onglet EHT bas et sélectionnez &#39;EHT On&#39;. </li><li> Sélectionnez &#39;InLens&#39; dans la liste déroulante Détecteurs dans l&#39;onglet &#39;Détecteurs&#39;. Optimiser les conditions d&#39;imagerie (mise au point, la luminosité et le contraste, l&#39;alignement du faisceau, astigmatisme), le cas échéant. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &#39;Numérisation&#39;. Choisissez un balayage rapide ( &#39;Vitesse de numérisation = 1&#39;, correspondant à un temps de séjour de 100 nanosecondes par pixel) pour minimiser les dommages de faisceau, etune «résolution de magasin» de 1.024 x 768 pixels. Sélectionnez &#39;Ligne Avg&#39; dans la liste déroulante &#39;Réduction du bruit ». Réglez la valeur de N à 20 - 30 lignes pour la recherche. Déplacer l&#39;échantillon en utilisant la fonction &#39;Centre Point&#39; (en appuyant sur ​​la languette de commande sur le clavier) pour rechercher des régions avec des cellules fracturées et les chloroplastes (Figures 2A et 2B). </li><li> Acquérir les images de chloroplastes fracturées à faible grossissement (50 - 70 kX) (Figure 2C et 2D). Utilisez la fonction «Centre d&#39;entité &#39;(en appuyant sur-shift-onglet de contrôle sur le clavier) pour zoomer sur les visages intéressants chloroplaste de fracture et d&#39; acquérir des images à des grossissements élevés (100 - 200 kX, les figures 3 et 4). Utilisez les mêmes paramètres que dans l&#39; étape 3.6 pour l&#39; acquisition d&#39;image, mais changer la valeur moyenne de ligne à N&gt; 100 pour la réduction du bruit 30. <ol><li> Appuyez sur Gel sur l&#39;unité de commande de microscope principal ou dans l&#39;onglet &quot;Numérisation&quot; pour arrêter le balayage et d&#39;économiserl&#39;image en appuyant sur le bouton &quot;Enregistrer TIFF. </li></ol></li></ol> 4. Analyse d&#39;image Remarque: Cette section décrit une procédure courte pour la segmentation des particules de membrane à partir d&#39; images MEB cryofracturation utilisant le package open-source Fidji 31. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec d&#39;autres logiciels d&#39;analyse d&#39;image. <ol><li> Ouvrir l&#39;image avec les Fidji en faisant glisser le fichier image dans la fenêtre principale du programme. Convertir l&#39;image en 8 bits en sélectionnant l&#39;image / Type / 8-bit. Sélectionner l&#39; image / Réglage / Luminosité / Contraste et ajuster si nécessaire (figure 5A). </li><li> Utilisation de l&#39;outil de ligne droite, tracer une ligne de la taille de la barre d&#39;échelle d&#39;image intégré. Sélectionnez Analyser / Echelle Set. Entrez les informations de bonne échelle (distance connue et Unité de longueur), puis cliquez sur OK. Envoyer cette image à l&#39;échelle ajustée. </li><li> Sélectionnez Process / Filtres / Flou gaussien (1,5 rayon nm) et cliquez sur OK (figure 5B). </li><li> Sélectionner l&#39;image / Ajuster / Auto Seuil local ( en utilisant la méthode Niblack) et cliquez sur OK (Figure 5C). </li><li> Sélectionnez Modifier / Inverser puis Process / binaire / bassin versant (Figure 5D). </li><li> Dessiner une bordure autour de la région d&#39;intérêt (ROI) avec l&#39;outil Sélection au lasso. Ajouter la sélection au gestionnaire de ROI en sélectionnant Modifier / Sélection / Ajouter au gérant ou en cliquant sur &#39;T&#39;. </li><li> Sélectionnez Modifier / Effacer l&#39; extérieur (Figure 5E). </li><li> Sélectionnez Analyser / Set mesures, choisissez les paramètres appropriés (par exemple, la région, l&#39; ellipse en forme). </li><li> Sélectionnez Analyser / analyser des particules. Entrez une gamme appropriée pour la taille des particules et marquer «Résultats», «Ajouter au Manager &#39;et, si nécessaire, le« Exclure sur les bords de l&#39;option et cliquez sur OK. Le résultat est représenté sur la figure 5F. </li><li> Ouvrez le fichier à l&#39;échelle imagée enregistrée (étape 4.2). Sélectionnez &#39;Show All&#39; et décochez &#39;étiquettes&#39; dans le gestionnaire de ROI. Revoir la partic sélectionnéeles posé sur l&#39;image originale et ajouter ou supprimer des sélections en utilisant le &quot;Ajouter&quot; ou &quot;Supprimer&quot; boutons du gestionnaire de ROI manuellement. Corrigez toutes les sélections nécessaires à l&#39;aide de l&#39;outil Sélection au lasso et le bouton &#39;Update&#39; du ROI Manager (figures 5G et 5H). </li><li> Analyser les données en utilisant les mesures obtenues. Dans la fenêtre des résultats, cliquez sur Résultats / Résumer pour obtenir, par exemple, la zone moyenne, et la moyenne Major et axes mineurs des particules figurant dans le gestionnaire de ROI. Cliquez sur Résultats / Distribution, sélectionnez un paramètre (comme la région) et cliquez sur OK pour afficher un histogramme pour ce paramètre. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La technique décrite dans ce document permet l&#39;étude des membranes de gel fracturé dans le contexte des tissus végétaux congelés à haute pression bien conservés par microscopie électronique à balayage cryo. Le principal avantage de l&#39;utilisation de ces procédures est que la préparation de l&#39;échantillon est purement physique; aucune mesure impliquant des produits chimiques ou la déshydratation sont nécessaires. Ainsi, il permet d&#39; étudier les structures biologiques à un état ​​quasi-native 26,32.</su...

photosynthèse Oxygenic, originaire de cyanobactérie ancienne, a été hérité par les algues et les plantes terrestres par les événements qui ont conduit à endosymbiotic développement de l&#39;organite chloroplaste. Dans tous les phototrophs oxygénés modernes, le transport photosynthétique d&#39;électrons et la génération de la force proton-motrice et de pouvoir réducteur sont effectuées dans des vésicules de sac-comme aplaties appelées membranes &#39;thylacoïdes&#39;. Ces membranes abritent les complexes protéiques qui réalisent les réactions légères-driven de la photosynthèse et de fournir un support pour la transduction de l&#39;énergie. Les membranes thylacoïdes de plantes et ( un peu) les algues sont différenciées en deux domaines morphologiques distincts: régions membranaires étroitement apprimés appelées «grana» et les membranes unstacked qui interconnectent le grana, appelés &#39;stroma lamelles&#39; 1. Diverses études de gel-fracture des plantes et des membranes thylacoïdes d&#39;algues ont été menées, à partir du début des années 1970. Lorsque le gel fracturé, membranesdiviser le long de leur noyau hydrophobe 2, générant une face exoplasmique (EF) et une face protoplasmique (PF), selon le compartiment cellulaire où les frontières demi-membrane, comme initialement inventé par Branton et al. . en 1975 3 Plant and thylakoïdes algues ont quatre faces de rupture différentes: FE, EFU, PF et PFU, avec &#39;s&#39; et dénotant et régions membranaires &#39;u&#39; &#39;empilées&#39; &#39;dépilés&#39;, respectivement. Les complexes de protéines membranaires, qui ne sont pas fendus ou cassés, ont tendance à rester avec soit E ou P côté de la membrane. Les premières observations que les différentes faces de rupture des thylakoïdes contiennent des particules de différentes tailles et densités 4, ainsi que les nombreuses enquêtes qui ont suivi, ont conduit à l&#39; identification et la corrélation entre les particules observées et les complexes de protéines membranaires qui effectuent les réactions légères 5-13 (avis voir aussi 14,15). Freexpériences eze-fracture de membranes thylacoïdes sont généralement réalisées sur des préparations de chloroplastes ou membranes thylakoïdes isolés (mais voir 16,17), au risque de toute modification / organisation structurelle et ou supramoléculaire qui peuvent survenir au cours de la procédure d&#39;isolement. À la suite de la rupture, les répliques sont préparées par évaporation du platine / carbone (Pt / C), puis par une épaisse couche de carbone (C), et enfin la digestion de la matière biologique 18. Des répliques sont visualisés par microscopie électronique à transmission (MET). La technique traditionnelle cryofracturation-réplique continue à servir comme un outil important pour l&#39; étude de l&#39;organisation supramoléculaire des membranes photosynthétiques et leur adaptation à différents, par exemple., Lumière, conditions 19-23. Dans notre étude récente de la plante de la résurrection homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, nous avons cherché à étudier les changements dans l&#39;organisation supramoléculaire omembranes f thylacoïdes, ainsi que dans l&#39;organisation cellulaire globale, au cours de la déshydratation et la réhydratation. Le caractère unique des espèces de résurrection homoiochlorophyllous est qu&#39;ils sont capables de survivre dans des conditions de dessication dans les tissus végétaux (feuilles), tout en conservant leur appareil photosynthétique. Une fois que l&#39; eau est disponible, ces plantes récupérer et reprendre l&#39; activité photosynthétique en quelques heures à quelques jours 25. Pour cette étude, la cryo-ME à balayage (MEB) d&#39;imagerie d&#39;échantillons de feuilles fracturée par congélation a été combiné avec le gel à haute pression pour l&#39;échantillon cryo-immobilisation. Ces procédures fournissent un moyen de visualiser des échantillons biologiques congelés-hydratés à un état ​​proche de leur état ​​natif 26. Un avantage principal est que les échantillons sont examinés directement après cryofracture et le revêtement, sans étapes successives. Ceci est particulièrement pertinent à l&#39;enquête sur les plantes à différentes teneurs en eau relative (RWC), que leur état d&#39;hydratation est maintenue pendant la préparation. Commentde plus, un inconvénient important est que les échantillons congelés hydraté peuvent subir des dommages du faisceau lors de l&#39;imagerie, en particulier lors d&#39;une numérisation à fort grossissement, qui sont nécessaires pour une mesure précise de la taille des complexes photosynthétiques. Pour y remédier, une méthode appelée «revêtement double couche» (DLC) 27,28 combiné à des conditions d&#39;imagerie spécifiques cryo-SEM ont été utilisés. Ceux - ci ont donné lieu à des échantillons qui sont beaucoup moins sensibles à faisceau et ont permis l&#39;élucidation de précieuses informations sur la protéine photosynthétique organisation supramoléculaire et d&#39; autres constituants cellulaires de la plante de la résurrection C. pumilum à fort grossissement in situ.

<table><tbody><tr><td>Éthanol abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-hexadécène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0,1/0,2 Plaquettes</td><td>Bureau d’études M. Wohlwend GmbH, Suisse</td><td>241</td><td>Les plaquettes ont un diamètre de 3 mm et une épaisseur de 0,5 mm (type A) avec des cavités de 0,1/0,2 mm de profondeur (diamètre 2 mm). Des plaquettes similaires peuvent être obtenues auprès de Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Pince à épiler de haute précision</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (Suisse) Pince à épiler de style Durostar #5 ; Peut être remplacé par d’autres pinces à épiler de haute précision.</td></tr><tr><td>Machine de congélation haute pression</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>Alternatives de congélation à haute pression : 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH ; 2. HPM 010, CMR Boeckeler ; 3. EM PACT2, Leica Microsystems ; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems ; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Système de congélation-fracture</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Préparation cryogénique Étape de chargement</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Porte-échantillon pour fracturation universelle par congélation</td><td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>Porte-pince pour porte-échantillons de diamètre 3 mm</td></tr><tr><td>Navette de cryotransfert sous vide</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Platine MEB</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td>d’images Fidji/Image J, Institut national de la santé http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;étude de l&#39;organisation supramoléculaire de photosynthétiques membranes dans les tissus foliaires gel fracturés par cryo-microscopie électronique à balayage

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

microscopie électronique Cryo-balayage (MEB) d&#39;échantillons de gel fracturé permet l&#39;étude des structures biologiques à des conditions proches indigènes. Ici, nous décrivons une technique pour l&#39;étude de l&#39;organisation supramoléculaire de photosynthétiques membranes (thylakoïdes) dans les échantillons de feuilles. Ceci est obtenu par congélation à haute pression des tissus foliaires, congelez-fracturation, revêtement double couche et enfin cryo-SEM imagerie. L&#39;utilisation du procédé de revêtement à double couche permet l&#39;acquisition d&#39;un fort grossissement (&gt; 100,000X) images avec des dommages de faisceau minimal pour les échantillons congelés hydraté ainsi que les effets de charge minimum. En utilisant les procédures décrites , nous avons étudié les modifications dans la distribution supramoléculaire de photosystème et de la lumière-récolte protéines d&#39;antenne complexes qui ont lieu pendant la déshydratation de la plante de la résurrection Craterostigma pumilum, in situ.

La figure 1 montre des images cryo-MEB de plaquettes contenant congelé, fracturés Craterostigma pièces pumilum foliaires haute pression. Dans certains échantillons, de grandes régions de cellules brisées sont obtenues (figure 1A). Dans d&#39; autres cas , la pièce de la feuille reste fortement liée au disque supérieur et est arraché avec elle (figure 1B). Cependant, même dans le second cas, une partie du tissu de la feu...

Nous décrivons ici une procédure d’étude des tissus végétaux fracturés par congélation. Les échantillons de feuilles congelées à haute pression sont fracturés par congélation et recouverts d’une double couche, ce qui permet d’obtenir des échantillons congelés-hydratés bien conservés qui sont imagés à l’aide du microscope électronique à balayage cryogénique à des grossissements élevés avec des dommages minimaux au faisceau.

L&#39;étude de l&#39;Organisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

L'objectif général de cette technique est d'étudier l'organisation supramoléculaire des membranes photosynthétiques à l'aide de la microscopie électronique à balayage cryogénique de coupes de tissus foliaires congelés puis fracturés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que la caractérisation morphologique des cellules et des organites, la répartition des complexes protéiques intégrés aux membranes, et la localisation des biominéraux. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la fracture par congélation est réalisée directement sur des tissus foliaires, permettant ainsi d'analyser l'organisation supramoléculaire des membranes thylakoïdes dans leur contexte organellaire et cellulaire d'origine.Bien que cette méthode soit ici démontrée sur un échantillon biologique, elle peut également être appliquée à des gels, des polymères et des systèmes de délivrance de médicaments. En général, les personnes novices dans ces procédures doivent savoir que tous les échantillons ne seront pas correctement congelés ou convenablement fracturés. Pour réaliser la cryo-fixation de tissus foliaires par congélation sous haute pression, commencez par utiliser le coin d'une lame de rasoir pour griffer le fond de la cavité de 0,1 millimètre d'une plaquette en aluminium de 0,1 à 0,2 millimètre.Préparez au moins une douzaine de plaquettes pour six échantillons. Ensuite, lavez les plaquettes avec de l'éthanol absolu et conservez-les dans un récipient propre. Après avoir préparé l'appareil de congélation sous haute pression, remplissez la boîte d'échantillons avec de l'azote liquide.Avec une lame de rasoir, découpez un petit morceau de feuille à partir de la plante et utilisez une pince pour placer le tissu à l’intérieur d’un tube de microcentrifugegeation rempli à moitié d’hexadécane. Pour infiltrer les espaces intercellulaires du tissu foliaire, insérez la pointe du dispositif d’infiltration, préparé comme décrit dans le protocole textuel, dans le trou du couvercle du tube de microcentrifugegeation, puis tirez le piston pour créer un vide. Après environ 30 secondes, relâchez le piston.Ensuite, à l’aide de pinces, retirer le morceau de feuille du tube. Utiliser la lame de rasoir pour découper un fragment suffisamment petit pour tenir dans une lamelle. Si nécessaire, amincir la feuille à une épaisseur inférieure à 0,2 millimètre.Pour éviter l'effondrement du tissu, les feuilles sont infiltrées par un liquide avant la congélation à haute pression. L'épaisseur de l'échantillon est maintenue inférieure à 200 microns afin de maximiser la probabilité d'obtenir un échantillon vitrifié. Placez une plaquette propre, côté rayé vers le haut, dans le porte-échantillon de la machine de congélation.Ensuite, placez le morceau découpé de feuille dans la lamelle. Utilisez une goutte d'hexadécane pour remplir l'espace restant de la lamelle avant de placer une autre lamelle, les rayures tournées vers la feuille, afin de fermer le sandwich. Fermez et serrez fermement le support.Congelez l'échantillon en appuyant sur le bouton de jet. Ensuite, transférez rapidement le porte-échantillon dans de l'azote liquide. Utilisez des pinces prérefroidies pour retirer le sandwich du porte-échantillon, en prenant soin de ne pas le fracturer.Il existe deux étapes critiques dans le protocole : la fracture par congélation, qui est un processus aléatoire dont le succès ne peut être évalué qu'au microscope électronique à balayage cryogénique, et le revêtement en double couche, nécessaire pour obtenir des images à fort grossissement avec un dommage minimal dû au faisceau. Lors de la préparation et de la programmation de l'appareil de fracture par congélation conformément aux instructions du fabricant, placer le canon à platine-carbone, ou Pt/C, à 45 degrés et le canon à carbone à 90 degrés. Refroidir le plateau du système de fracture par congélation à moins 140 ou moins 160 degrés Celsius.Ensuite, fixez le dispositif de transfert cryogénique sous vide à la machine et utilisez de l'azote liquide pour remplir la chambre du dispositif. Insérez un porte-échantillon pour fracture cryogénique dans la station de chargement, puis inondez la chambre de la station de chargement avec de l'azote liquide. Puis, à l’aide de pinces de précision, placez un sandwich congelé sur le porte-échantillon et serrez-le fermement en place.Ensuite, retournez le support pour vérifier que le sandwich est bien fixé en place, puis répétez l'opération pour un deuxième sandwich. Détachez le chariot refroidi de la machine de fracture par congélation et reliez-le à la station de chargement. Ouvrez ensuite la vanne du chariot, insérez le bras de retrait dans le support, verrouillez-le en place, puis réinsérez le bras avec le support dans le chariot.Après avoir réaccroché l'ensemble au microscope cryo-fracture, introduire le porte-échantillon dans la chambre à l'aide du bras de retrait. Régler ensuite la lame du microtome cryo-fracture à une hauteur telle qu'elle détache les plaquettes supérieures des sandwichs. À l'aide de la lame du microtome, rompre rapidement les sandwichs.Ensuite, relevez immédiatement le couteau afin d'éviter toute contamination des échantillons par des débris adhérant au couteau. Placez l'obturateur refroidi au-dessus du plan nouvellement exposé pour protéger les échantillons d'une éventuelle contamination par des molécules d'eau présentes dans la chambre. Ensuite, pour recouvrir les échantillons de platine, appuyez sur Configuration afin d'afficher la couche 1 à l'écran.Ensuite, allumez le canon Pt/C en appuyant sur le bouton GUN 1, puis sur le bouton ON. Examinez la vitesse d'évaporation et, une fois qu'elle atteint entre 0,02 et 0,04 nanomètre par seconde, appuyez sur le bouton Measure pour surveiller l'épaisseur de la couche déposée tout en exposant simultanément les échantillons. Pour déposer du carbone, sélectionnez GUN 2 puis appuyez sur le bouton ON.Une fois que la vitesse d'évaporation est d'environ 0,1 nanomètre par seconde, appuyez sur le bouton Mesurer et, en même temps, déplacez l'obturateur pour exposer les échantillons. Lorsque le revêtement est terminé, portez le plateau à moins 120 degrés Celsius. Pour préparer le microscope électronique à balayage au travail cryogénique, sélectionnez dans le menu principal Plateau, Initialiser le plateau, puis confirmez.Sous l'onglet Vide, cliquez sur le bouton Ventilation pour ventiler la chambre du microscope. Ensuite, sélectionnez Outils, Panneau Aller à, puis ouvrez le panneau Liste des points de la platine. Sélectionnez la position ÉCHANGE CRYO pour déplacer la platine aux coordonnées appropriées afin d'insérer le porte-échantillon.En portant une paire de gants propres, ouvrez la chambre à échantillons et insérez le cryostage sur le plateau principal du microscope. Fermez la chambre et, sous l'onglet Vide, cliquez sur le bouton Pompe. Ensuite, refroidissez le microscope en remplissant le duor du microscope avec de l'azote liquide.Une fois que la température de la platine descend en dessous de moins 120 degrés Celsius, activez la fonction de chauffage sur l'unité de transfert cryogénique pour réchauffer la platine jusqu'à moins 120 degrés Celsius. Fixez maintenant le chariot de transfert cryogénique au microscope et transférez le support d'échantillon à l'aide du bras escamotable dans la platine cryogénique du microscope. À l'aide du joystick, déplacez délicatement le porte-échantillon près de l'objectif.Dans l'onglet Diaphragmes, sélectionnez le diaphragme de 10 microns. Ensuite, dans l'onglet Canon, double-cliquez sur le champ Cible EHT, saisissez 10 kilovolts pour la cible EHT, puis cliquez sur OK. Puis, pour activer la tension d'accélération, cliquez sur l'onglet EHT inférieur et sélectionnez EHT activé. Dans l'onglet Détecteurs, sélectionnez InLens dans la liste déroulante. Cliquez ensuite sur l'onglet Balayage et choisissez une vitesse de balayage égale à un, ce qui correspond à un balayage rapide permettant de minimiser les dommages causés par le faisceau, ainsi qu'une résolution d'enregistrement de 1024 par 768 pixels.Dans la liste déroulante Réduction du bruit, sélectionnez Moyenne de lignes et réglez la valeur de n à entre 20 et 30 lignes pour la recherche. Ensuite, en appuyant simultanément sur les touches Contrôle et Tabulation du clavier, utilisez la fonction de point central pour déplacer l'échantillon vers les zones d'intérêt tout en effectuant un agrandissement afin d'identifier les régions contenant des cellules fracturées. Après avoir repéré les régions avec des cellules fracturées, balayez l'échantillon tout en zoomant pour trouver un chloroplaste fracturé.Ensuite, modifiez la valeur moyenne de la ligne n pour qu'elle soit supérieure à 100, afin de réduire le bruit. Dans l'onglet Balayage, appuyez sur Pause pour arrêter le balayage. En appuyant sur Ctrl+Maj+Tab sur le clavier, la fonction de centrage permet de zoomer sur les faces de fracture intéressantes des chloroplastes ; des images à fort grossissement sont alors obtenues en utilisant les mêmes paramètres qu'auparavant.Enfin, appuyez sur le bouton Enregistrer au format TIFF pour sauvegarder l'image. Effectuez l'analyse d'image conformément au protocole écrit. Cette figure montre une image de MEB cryogénique d'une plaquette contenant un fragment de feuille de Craterostigma pumilum congelé sous haute pression et fracturé par congélation, avec une vaste région de cellules fracturées.Dans cet exemple, le fragment de feuille est manquant ; mais un peu de tissu foliaire est resté, attaché aux rainures du couteau sur le plaquet. Après avoir trouvé une fracture réussie, des images à faible grossissement des cellules sont acquises afin d'identifier des régions d'intérêt, telles que les chloroplastes fracturés. Des images de chloroplastes individuellement fracturés sont acquises pour identifier les faces de fracture des membranes thylakoïdes.On observe dans cet exemple une image à fort grossissement des membranes thylakoïdes de feuilles de C. pumilum. On peut distinguer les quatre faces de fracture différentes. Les faces de fracture exoplasmiques des membranes empilées et non empilées, respectivement EFs et EFu, et les faces de fracture protoplasmiques des membranes empilées et non empilées, respectivement PFs et PFu.Le photosystème II, ou PS2, est situé dans les régions membranaires des granums empilés EFs et dans les régions membranaires stromalamellaires EFu. À l'état hydraté, la densité du PS2 est d'environ trois fois plus élevée dans les EFs que dans les EFu, ce qui différencie les deux faces. Lors de la déshydratation de C. pumilum, la densité du PS2 dans les EFs diminue progressivement, atteignant environ la moitié de sa densité dans les conditions hydratées.Notamment, lors d'une déshydratation supplémentaire jusqu'à une teneur en eau relative de 5 à 10 %, les complexes PS2 s'organisent en rangées et en réseaux. Le développement de la technique de réplique par fracture cryogénique a permis d'étudier la taille des complexes de protéines membranaires et leur disposition au sein des membranes biologiques. La combinaison de la fracture cryogénique avec la congélation à haute pression en MEB cryogénique permet d'analyser divers types d'échantillons à plusieurs échelles de taille, des niveaux tissulaire et cellulaire jusqu'au niveau macromoléculaire dans un état proche de l'état natif.Outre la technique présentée ici, des méthodes telles que la spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie, EDS, peuvent également être appliquées en MEB cryogénique ; par exemple, pour alcaliniser les biominéraux.

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Nous présentons un protocole pour la préparation de lamelles d’échantillons biologiques congelés par micro-usinage par faisceau d’ions cryo-focalisé pour des études structurelles à haute résolution de macromolécules in situ avec cryo-tomographie électronique. Le protocole présenté fournit des lignes directrices pour la préparation de lamelles de haute qualité avec une reproductibilité élevée pour la caractérisation structurelle des macromolécules à l’intérieur des Saccharomyces cerevisiae.

Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Le présent protocole décrit l’acquisition à distance de données par cryotomographie électronique à haute résolution à l’aide de Tomo5, ainsi que le traitement ultérieur des données et la moyenne des sous-tomogrammes à l’aide d’emClarity. L’apoferritine est utilisée comme exemple pour illustrer des processus détaillés étape par étape pour obtenir une structure cryo-ET à une résolution de 2,86 Å.

Cryotomographie électronique Collecte de données à distance et moyenne par sous-tomogramme

La tomographie cryo-STEM permet de visualiser les organites de cellules intactes sans enrobage, sectionnement ou autres préparations invasives. La résolution 3D obtenue est actuellement de l’ordre de quelques nanomètres, avec un champ de vision de plusieurs micromètres et une épaisseur accessible de l’ordre de 1 μm.

Visualisation d’organites in situ par tomographie cryo-STEM

Découvrez l'organisation supramoléculaire des membranes photosynthétiques dans les tissus foliaires par cryo-microscopie électronique à balayage. Cette méthode de cryofracturation à haute pression permet d'imager les thylakoïdes dans leur contexte cellulaire natif.

Létude de lOrganisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage (Vidéo) | JoVE Journal

L'étude de l'Organisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage

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