Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d'enquêter sur l'Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur

La cryosphère permet d'accéder à des organismes préservés ayant subsisté dans des conditions environnementales passées. L'objectif général de cette procédure est de révéler la diversité cachée en collectant avec succès des échantillons et en éliminant les matériaux exogènes des carottes congelées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions historiques importantes concernant des périodes sélectionnées, en identifiant les organismes récupérés à partir de glace glaciaire et de pergélisol.

Le prélèvement d'un échantillon stérile sur le terrain est difficile en raison de la forte probabilité d'introduction de contaminants. L'avantage principal de cette technique réside donc dans le fait que l'élimination des contaminants s'effectue dans un environnement de laboratoire contrôlé. La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle, car les étapes de raclage et de décontamination peuvent être relativement difficiles à apprendre.

C'est vraiment un travail à deux personnes, qui demande donc beaucoup de patience et, surtout, un excellent esprit d'équipe. Cette procédure sera démontrée par deux techniciens de soutien de mon laboratoire, Karen Foley et Robert Jones. Ce protocole exige une propreté méticuleuse.

Utilisez un four réglé à 450 degrés Celsius pour stériliser les éléments suivants pendant quatre heures : des supports métalliques stériles sans acides nucléiques, du matériel en verre, des pinces métalliques et de la laine de verre. Utilisez un emballage en aluminium épais pour éviter toute recontamination.

Ensuite, stériliser par filtration l'éthanol à 85 % et l'eau ultra-pure à l'aide de filtres de 0,22 micron. Ces liquides doivent rester à quatre degrés Celsius ou en dessous, sinon ils risquent de fissurer l'échantillon, ce qui facilitera la contamination. Conserver l'éthanol à moins 20 degrés Celsius.

Et conservez l'eau à quatre degrés Celsius. Ensuite, stérilisez une règle en plastique avec de l'éthanol à 70 %, puis avec une solution de décontamination de l'ADN et une solution de décontamination des ARNases. Essuyez chaque solution immédiatement après son application.

Ensuite, conserver la règle dans un sac Whirl-Pak stérile et exempt d'acides nucléiques. Puis, préparer l'espace de la chambre froide en nettoyant d'abord les murs, les sols et un plan de travail en métal avec de l'eau de javel à 1 %. Régler ensuite la température de la pièce à environ moins 11 degrés Celsius.

Une fois préparés, porter des combinaisons légères, des gants en nitrile et des masques dans la chambre froide afin de réduire tout risque de contamination de la pièce ou des échantillons. Cette procédure exige que deux personnes travaillent en tandem. Cela peut s'avérer difficile compte tenu des nombreuses possibilités de recontamination.

Pour assurer le succès, nous nous surveillons mutuellement, communiquons et changeons fréquemment de gants. Une fois tout préparé, apportez les matériaux stérilisés et les échantillons dans la chambre froide, et installez-les sur la table nettoyée à l’eau de javel. Cela inclut les cultures préparées de S. marcescens.

Tout d'abord, le carotte de pergélisol est placée sur une feuille de papier d'aluminium préparée. Ensuite, l'extérieur de la carotte est légèrement inoculé avec une culture diluée de S. marcescens à l'aide d'une fiche en mousse stérile. Puis, on place la carotte sur un support métallique stérile au-dessus d'un bac.

Maintenant, la lame en acier du microtome est essuyée de manière stérile avec de l'éthanol à 70 %, une solution de décontamination de l'ADN et une solution de décontamination des RNases. Ensuite, le chercheur A nettoie leurs gants en nitrile de la même manière. Puis A tient le cylindre à un angle de 45 degrés au-dessus du plateau.

B gratte délicatement environ cinq millimètres sur la surface extérieure de l'ensemble du noyau, y compris aux extrémités, à l'aide du scalpel stérile, tandis qu'A tourne le noyau après chaque passage. Si nécessaire, la lame doit être nettoyée à nouveau avec les trois solutions. Ensuite, B verse rapidement et soigneusement de l'éthanol à 95 % filtré et stérilisé sur le noyau pendant qu'A fait tourner ce dernier.

Ensuite, le cœur est rapidement rincé à l'eau. Le support métallique au-dessus du plateau est maintenant remplacé, et le cœur est placé sur le nouveau support. A nettoie ensuite ses gants en nitrile, puis place le cœur sur un support propre au-dessus du plateau.

Entre-temps, B pulvérise l'ensemble du carottier avec une solution de décontamination de l'ADN, puis rince avec de l'eau stérilisée par filtration. Ensuite, B pulvérise l'ensemble du carottier avec une solution de décontamination des ARNase, suivie d'un autre rinçage avec l'eau. Enfin, le carottier est placé dans un sac Whirl-Pak stérile.

Commencez par placer un support métallique au-dessus d’un récipient en verre dans une hotte à flux laminaire. Ensuite, placez le noyau sur le support métallique. Laissez décongeler de deux à cinq millimètres de la surface extérieure du noyau pendant environ 10 minutes.

Pendant ce temps, tournez le cœur de 90 degrés toutes les deux minutes. Après la décongélation, saisissez de la laine de verre avec une pince et essuyez toute la surface du cœur pour recueillir les bactéries. Ensuite, ensemencez les deux boîtes à l’aide de la laine de verre.

Ensuite, mesurer les dimensions extérieures du cœur à l’aide de la règle, sans toucher le cœur. En outre, ensemencer deux plaques supplémentaires avec la culture d'origine précédemment utilisée pour doper la surface extérieure du cœur afin de vérifier que l'inoculum était viable. Puis, transférer le cœur dans un grand sac stérile et le conserver à moins 80 degrés Celsius.

Incuber les boîtes ensemencées à 23 degrés Celsius pendant une semaine, puis les examiner à la recherche de colonies de S. marcescens qui deviennent rouges à cette température. Bien que ce protocole comporte une série d'étapes critiques, l'une des plus importantes consiste à vérifier la croissance de Serratia marcescens. S'il n'y a aucune colonie visible de S. marcescens, passer à la phase de décongélation suivante.

SI des colonies de S. marcescens sont présentes, prélevez alors cinq millimètres supplémentaires au cœur et répétez la procédure. Vérifiez si S. marcescens a poussé à partir de la culture initiale exposée aux basses températures de la chambre froide. Des échantillons ont été prélevés dans la glace et le pergélisol d’un tunnel de 110 mètres situé à Fox, en Alaska.

Le tunnel permettait d'accéder à du limon riche en glace et à des alluvions. Des échantillons ont été prélevés en triple exemplaire. Dans des installations situées au New Hampshire, les protocoles décrits ont été réalisés.

Le gène de l'ARNr 16S a été séquencé à partir de bactéries cultivées à partir des carottes. Les espèces de Pseudomonas dominaient, mais des membres apparentés aux Planctomycéties étaient également présents. En outre, l'absence d'espèces de Serratia, particulièrement intéressante, montre que le protocole de décontamination a suffisamment éliminé l'ADN exogène.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment décontaminer efficacement des carottes de glace et de pergélisol. Une fois maîtrisées, les étapes de traitement en chambre froide peuvent être réalisées en 30 à 45 minutes si elles sont effectuées correctement. Lorsque vous essayez cette procédure, il est essentiel de faire attention à tout ce que vous touchez et à tous les endroits que vous touchez.

En cas de doute, changez simplement vos gants et effectuez une nouvelle stérilisation. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage d'amplicons ou la métagénomique en shotgun peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quelle était la composition en espèces pour cette période, ou quelles caractéristiques fonctionnelles dominaient dans ces conditions environnementales.