Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

L’objectif global de cette méthode de micropatterning basée sur le pochoir, pour les cellules souches pluripotentes humaines, est de fournir un moyen simple et robuste de générer des gradients environnementaux spatiaux qui contrôlent les modèles de différenciation des cellules souches. Cette méthode peut vous aider à répondre à des questions clés sur la structuration des tissus à l’aide d’un modèle de cellules souches humaines, telles que la façon dont les gradients spatiaux des forces d’adhésion cellule-cellule et matrice cellulaire peuvent aider à organiser les destins de différenciation des cellules souches. L’avantage de cette méthode est qu’elle ne nécessite pas de modification de surface supplémentaire pour générer des motifs ECM adhésifs pour les cellules à fixer.

Cela signifie que la méthode est compatible avec diverses configurations ECM et substrats, spécifiques à chaque lignée cellulaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de micropatterning sont difficiles à apprendre. Parce qu’il nécessite une manipulation précise et soigneuse du pochoir et des cellules.

Pour cette procédure, les pochoirs PTMS doivent déjà être conçus et fabriqués. De même, faites en sorte que les cellules EFC humaines se développent sur la matrice de la membrane basale, de sorte que les colonies soient prêtes pour l’ensemencement plus tard dans la procédure. Pour commencer, chargez une parabole de 700 microlitres d’éthanol à 70 % de qualité analytique, dans de l’eau ultra-pure.

Ensuite, placez le pochoir PDMS sur la solution et placez le plat dans une armoire de biosécurité pour qu’il sèche pendant la nuit. Le lendemain, vérifiez qu’aucune bulle ne s’est formée sous le pochoir. Ensuite, préparez le plat jusqu’à ce que les cellules puissent être ensemencées sur le pochoir.

Préparez une aliquote de matrice de membrane basale humaine de qualité ESC en ajoutant 16,7 millilitres de DMF12, pour faire une solution 1,5x et la maintenir sur de la glace. Traitez le substrat avec 100 watts de plasma d’oxygène pendant 90 secondes. N’ouvrez pas la parabole tant qu’elle n’est pas à l’intérieur de la chambre à plasma et couvrez-la rapidement après le traitement.

Ce traitement évitera la formation de bulles lorsque le substrat est immergé dans la solution. Maintenant, couvrez le pochoir avec 450 microlitres de solution de matrice de membrane basale préparée 1,5x. Ensuite, scellez le plat avec du parafilm et incubez-le pendant cinq heures.

Avant de continuer, vérifiez les six plaques de puits des colonies HESC préparées. Identifiez et aspirez des colonies de cellules différenciées qui ont perdu leur morphologie HESC typique. Ils doivent tous sembler arrondis, avoir une morphologie épithéliale serrée et avoir un rapport noyau/cytoplasme élevé avec des nucléoles proéminents.

Ensuite, lavez deux fois chaque puits de cellules plaquées avec deux millilitres de DMF12. Après le deuxième lavage, ajoutez un millilitre d’enzymes digestives à chaque puits, comme l’accutase et incubez l’assiette pendant huit minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, tapotez doucement la plaque pour détacher toutes les colonies du substrat.

Ensuite, rincez chaque puits avec au moins quatre millilitres de milieu pour chaque millilitre d’enzyme digestive appliqué dans le puits, et collectez les suspensions cellulaires dans un seul tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 200 g pendant trois minutes à température ambiante pour former une pastille de cellule. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 400 microlitres de milieu d’entretien HESC, complété par 10 micromolaires d’inhibiteur de roche.

Triturez doucement les cellules trois fois pour briser les amas. Ensuite, corrigez la densité des suspensions. Mélangez bien et faites une dilution de 200 microlitres 1:20 dans un média.

Comptez les cellules dans la dilution à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, diluez la suspension principale au besoin, à l’aide d’un milieu avec un inhibiteur de roche. Pour continuer, ajoutez le nombre requis de cellules sur chaque pochoir préparé.

Seule une monocouche de cellules doit être déposée, alors répartissez-les uniformément. Laissez le pochoir reposer sans être dérangé pendant cinq minutes, afin que les cellules puissent se stabiliser. Ensuite, transférez soigneusement les pochoirs chargés dans un incubateur, en gardant la vaisselle à niveau tout au long du transfert.

Laissez les cellules se fixer aux pochoirs pendant une incubation d’une heure. Une fois que les cellules ont été autorisées à se fixer, examinez-les au microscope pour vous assurer qu’elles l’ont fait correctement. Transférez le pochoir sur le capot et aspirez les cellules non attachées du pochoir.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de tensioactif non ionique compatible à 0,5 % dans du DMF12 dans la zone entourant le pochoir. Faites tourner la solution pour couvrir le pochoir. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces autoclavées, décollez délicatement le pochoir du plat.

Après avoir retiré le pochoir, inspectez les cellules du micromodèle au microscope. Le tensioactif non ionique empêche ces cellules de se dessécher. Laissez les cellules microparentales incuber dans la solution de milieu supplémentée en surfactant pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.

Après 10 minutes, aspirez la solution et lavez la plaque avec deux millilitres de milieu DMF12 normal, trois fois. Après les lavages, ajoutez deux millilitres de milieu d’entretien HESC avec inhibiteur de roche. Encore une fois, inspectez les cellules pour vérifier que les micromotifs se sont correctement formés.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, aspirez le milieu, lavez les cellules une fois avec du DMF12, puis ajoutez deux millilitres de milieu de différenciation supplémenté, pour induire les cellules à subir la différenciation du mésoendoderme. Plus tard, analysez les résultats.

La fabrication du pochoir de cellule à l’aide d’une découpeuse laser a fourni des caractéristiques de 1000 microns. Le pochoir était composé d’une fine feuille de pochoir avec des trous traversants à micromotifs et d’un joint PDMS utilisé pour contenir les cellules. À l’aide de cet outil, des cellules souches hématopoïétiques micro-décortiquées ont été étudiées lors de la différenciation du mésoendoderme.

Les périphéries de la colonie H9-HESC ont des adhérences d’intégrine plus élevées que les cellules à l’intérieur de la colonie. Ainsi, les cellules se différencient en cellules mésoendodermiques brachiaires T-positives, lorsqu’elles sont induites par l’activan, BMP4 et FGF2. Lorsque ces cellules ont été modelées en monocouches de géométries différentes, les angles droits géométriques et isotropiés et à des courbures convexes ont conduit à une concentration locale des forces de traction médiées par l’intégrine et ont entraîné une différenciation accrue du mésoendoderme.

L’intensité de l’expression T à différents endroits au sein d’une même colonie a montré que l’étendue de l’induction du mésoendoderme était en effet plus élevée dans les angles vifs des colonies carrées et rectangulaires, et aux courbures convexes d’un arc semi-circulaire. Cela démontre que les forces mécaniques médiées par l’adhésion cellulaire peuvent être modulées à l’aide de la méthode décrite. Avant de tenter la procédure, il est important d’optimiser le temps d’enrobage de la matrice, la digestion des cellules et le temps de fixation, pour la lignée spécifique de cellules souches pluripotentes humaines avec laquelle vous travaillez.