Génome Édition dans Astyanax mexicanus Utilisation Transcription Activator comme Effector nucléases (TALENs)

L’objectif global de cette procédure est d’introduire des mutations dans des gènes spécifiques chez le poisson des cavernes Astyanax mexicanus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie évolutive sur la base génétique de l’évolution des traits des grottes. Le principal avantage de cette technique est que l’effet de la perte du gène spécifique peut maintenant être testé chez Astyanax mexicanus.

Après avoir conçu et assemblé des nucléases effectrices de type activateur de transcription, ou TALEN, selon le protocole de texte, utilisez deux microlitres de Sac1 pour digérer quatre microgrammes de matrice de séquence vérifiée à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Exécutez deux microlitres du plasmide digéré Sac1 sur un gel d’agarose à un point cinq pour cent et vérifiez la présence d’une seule bande pour vérifier la digestion. Pour effectuer la production d’ARNm T trois, utilisez zéro virgule cinq microgrammes de matrice linéarisée pour mettre en place des demi-réactions selon un protocole standard.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez ensuite le point zéro pour les microlitres de DNase et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après avoir purifié l’ARNm, pour vérifier la qualité, utilisez un produit qui élimine la contamination par la RNase pour nettoyer l’appareil de gel.

Ensuite, préparez un gel à un point deux pour cent. Mélangez un microlitre d’ARNm, quatre microlitres d’eau sans nucléase et cinq microlitres de colorant de chargement de glyoxal. Incuber les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, centrifugez brièvement les tubes, puis placez-les sur de la glace avant de faire couler le gel. Après avoir vérifié la concentration de l’ARNm, préparez des aliquotes avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius. Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte.

Après avoir préparé les aiguilles et les plaques d’injection selon le protocole textuel, induisez la ponte chez A. mexicanus en suralimentant les poissons pendant trois à quatre jours avant la reproduction et placez les poissons dans de l’eau douce. Augmentez la température de l’eau de deux degrés Fahrenheit à environ 76 degrés Celsius. Toutes les 15 minutes, vérifiez la présence d’œufs de poisson en surface dans l’obscurité et transférez-les dans des bols en verre pour éviter qu’ils ne collent à la surface.

Des centaines d’œufs peuvent être obtenus à partir d’une seule paire de poissons de surface. Au microscope, triez les œufs isolés et transférez-les au stade d’une cellule dans l’eau douce du système. Chargez l’ARNm dilué à l’arrière de l’aiguille et détachez l’aiguille d’un micro-injecteur.

Ensuite, à l’aide d’une pince, cassez l’aiguille. Pour calibrer l’aiguille, injectez 10 fois et récupérez la goutte résultante dans un microcapillaire. La goutte doit remplir un 10 par 100 jetable d’un microlitre, un microcapillaire de 32 millimètres à zéro virgule cinq millimètres par injection d’un virgule cinq nanolitres.

Maintenant, insérez l’aiguille dans la cellule unique et injectez l’ARNm. Recueillez les embryons injectés dans des bols en verre et incuberez-les à une température de 23 à 25 degrés Celsius. Retirez régulièrement les embryons morts pendant les premiers jours suivant l’injection.

Noter le nombre d’embryons morts et déformés provenant de plaques témoins non injectées et de plaques injectées. Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte. Après avoir euthanasié le poisson selon le protocole IACUC de votre établissement, pour extraire l’ADN, collectez les embryons dans 100 microlitres de 50 millimolaires d’hydroxyde de sodium et incubez à 95 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Puis refroidir à quatre degrés Celsius. Ajouter un dixième du volume d’une molaire tris HCL ph 8 aux embryons refroidis. Réalisez ensuite une PCR à l’aide d’amorces, par exemple pour l’albinisme oculo-cutané deux ou le gène OCA2.

Pour les embryons individuels, un microlitre d’ADN est suffisant pour la réaction PCR. Pour génotyper le locus OCA2, utilisez l’enzyme de restriction DSR1 pour digérer le produit PCR résultant en ajoutant zéro virgule cinq microlitres d’enzyme directement à douze virgule cinq microlitres de la réaction PCR terminée. Après une incubation à 65 degrés Celsius pendant deux heures, exécutez la réaction et un échantillon de produit PCR non digéré sur un gel d’agarose à un point cinq pour cent.

Effectuer des analyses complémentaires selon le protocole texte. Les injections de TALEN peuvent entraîner des cassures d’ADN double brin qui peuvent être réparées par la jonction d’extrémités non homologues, mais qui peuvent également introduire des insertions ou des suppressions, ou INDELs. En utilisant la digestion par restriction finale de PCR pour cibler la région de l’espacement TALEN, les INDEL peuvent être identifiés par la présence d’une bande résistante à l’enzyme de restriction.

Les injections de TALEN peuvent produire des mutations génétiques bialléliques chez A. mexicanus et donc certains phénotypes peuvent être évalués chez les poissons fondateurs. Par exemple, OCA2, le gène supposé responsable de l’albinisme chez les poissons cavernicoles, a été évalué. Comme le montre le présent document, on a identifié des taches d’albinos chez les poissons injectés dans l’OCA2 TALEN qui n’étaient pas présentes chez les poissons non injectés.

Dans cette image en gel, 306 produits de PCR de paires de bases de l’exon neuf de l’OCA2 d’A. mexicanus ont été examinés pour détecter la perte du site de l’enzyme de restriction dans des groupes de 10 poissons F1 provenant d’un poisson fondateur injecté. L’amplicon d’un embryon témoin a été digéré tandis qu’une partie de l’amplicon était résistante à la digestion de restriction chez les embryons F1 de poissons injectés. De plus, il a été démontré que les bandes résistantes à la digestion de restriction contiennent des INDEL.

Une fois maîtrisées, ces injections peuvent être effectuées en moins de quelques heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler soigneusement avec l’ARN pour éviter la dégradation et de l’injecter pendant le stade d’une cellule. À la suite de cette procédure, une analyse phénotypique peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si un gène particulier sous-tend un phénotype de poisson clé lorsqu’il est muté chez les poissons de surface.

Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie évolutive pour caractériser le rôle des gènes candidats dans l’évolution du poisson des cavernes Astyanax mexicanus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’injecter des embryons d’Astyanax mexicanus avec l’ARNm TALEN.