Name: Génome Édition dans Astyanax mexicanus Utilisation Transcription Activator comme Effector nucléases (TALENs) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Apprenez l'édition génomique par TALENs chez Astyanax mexicanus pour étudier les bases génétiques des adaptations cavernicoles. Cette méthode permet d'introduire des mutations ciblées et d'analyser leurs effets phénotypiques.

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Ce travail a été financé par le Département de génétique, de développement et de biologie cellulaire et de l&#39;Iowa State University et par NIH EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner a fourni des commentaires sur le manuscrit.

Toutes les procédures d&#39;animaux étaient en conformité avec les lignes directrices des Instituts nationaux de la santé et ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;Université de l&#39;Iowa et l&#39;Université du Maryland. 1. TALEN Conception <ol><li> Entrée souhaitée séquence cible à un site Web de conception TALEN. (Par exemple: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Entrée choisie longueurs de tableau entretoise / répétition. <ol><li> Copiez la séquence génomique dans la case &quot;Séquence&quot;. </li><li> Dans l&#39;onglet &quot;Fournir personnalisé Spacer / RVD Longueurs&quot; sélectionner la longueur d&#39;espacement et longueur du tableau. Remarque: Les longueurs Spacer de 15 paires de bases, et répéter longueurs de réseaux de 15-17 fonctionnent bien et rendre l&#39;assemblage moins complexe. </li></ol></li><li> Sélectionnez une paire TALEN. paires Talen conçus autour d&#39;un site unique d&#39;enzyme de restriction permettent pour le génotypage par l&#39;enzyme de restriction digestionun produit de PCR. </li><li> Concevoir des amorces pour amplifier la région génomique entourant le site cible TALEN au moyen d&#39; un site Web tel que Primer3 30-32. Lors de génotypage avec une enzyme de restriction, les amorces de conception pour amplifier une région qui contient le site d&#39;enzyme de restriction qu&#39;une seule fois. Il est recommandé que cette région est amplifiée et séquencée avant la construction TALEN pour identifier les polymorphismes présents dans A. mexicanus population de laboratoire à utiliser pour microinjection. </li></ol> 2. Assemblée TALEN (Modifié à partir du protocole TALEN Kit) 33,34 Pour plus de détails et de dépannage, voir le protocole 34. <ol><li> Préparer et séquencer les plasmides nécessaires à partir du kit TALEN selon les instructions du fabricant. </li><li> Mettre en place le # 1 des réactions pour les réactions A et B Inclure répéter variables diresidues (DRV) 1-10 et pFUS_A vecteur de destination dans la réaction A. Inclure DRV 11- (N-1) et evecteur e destination pFUS_B (N-1) dans la réaction B où N est le nombre total de DRV dans le TALEN. <ol><li> Ajouter à chaque réaction: 1 pi de chaque plasmide contenant chaque DRV (100 ng / ul), le vecteur de destination (100 ng / pl), 1 pl Bsa I des enzymes de restriction, 1 ul de sérumalbumine bovine (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul de ligase, 2 ul de tampon 10 x de ligase et x ul d&#39;eau pour un volume total de 20 ul. Par exemple, voir le tableau 1. Remarque: Les demi-réactions peuvent également être utilisés. </li><li> Placez les réactions dans un thermocycleur et exécuter le cycle: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Incuber les réactions avec la nucléase. Pour chaque réaction ajouter 1 pl 25 mM ATP et 1 ul nucléase. Incuber réactions à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Transformer les réactions. <ol><li> Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes. Note: Homemade c compétenteaunes peuvent être utilisés. Cependant, les cellules ayant une faible compétence peuvent entraîner un manque de colonies. <ol><li> Mélanger 2,5 pi de la réaction avec 25 pi de cellules chimiquement compétentes. Incuber sur la glace pendant cinq minutes. Incuber les cellules pendant 30 secondes à 42 ° C. </li><li> Placer les tubes sur la glace pendant 2 min. Ajouter 125 pi de bouillon de Super optimale avec répression catabolique (SOC). Agiter les tubes à 37 ° C pendant 1 heure. </li></ol></li><li> Plaque 100 ul de cellules transformées sur des plaques LB contenant de la spectinomycine (50 pg / ml), X-gal et isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG). Cultivez O / N à 37 ° C. </li></ol></li><li> Choisissez 2-3 colonies blanches pour chaque réaction et vérifier par colonie PCR utilisant des amorces pCR8_F1 et pCR8_R1 (tableau 2). <ol><li> Faire un mélange maître des réactifs. Par exemple, voir le tableau 3. </li><li> Choisissez une colonie et de l&#39;étaler dans le fond d&#39;un tube PCR, puis mettre les restes de la colonie dans 2 ml de LB avec spectinomycine(50 ug / ml). Placer 15 ul du mélange maître dans le tube avec la colonie. </li><li> Exécutez le programme de PCR suivant (tableau 4) </li><li> Vérifiez la PCR (exécuter la totalité du volume) sur un gel agarose à 1,5% par électrophorèse. Les clones corrects auront une bande à la taille attendue ainsi qu&#39;un frottis et une échelle de bandes. Pour un exemple du frottis approprié, voir 34,33. </li><li> Cultivez 2 ml de cultures des clones corrects dans des milieux LB O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation. </li></ol></li><li> Miniprep les plasmides selon les instructions du fabricant. </li><li> Séquence pour vérifier la séquence TALEN avec pCR8_F1 et pCR8_R1. Suivez les méthodes 35 décrites précédemment. </li><li> En utilisant les clones corrects vérifiées par séquençage, mis en place la réaction # 2 (kit TALEN), qui placera les DRV des vecteurs A et B et la DRV finale dans le vecteur de destination. <ol><li> Préparer mélange pour la réaction 2 (Tableau 5). Note: HaLes réactions lf peuvent être utilisés. </li><li> Placez les réactions dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Transformer les réactions. <ol><li> Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes. <ol><li> Mélanger 2,5 pi de la réaction avec 25 pi de cellules chimiquement compétentes. Incuber sur la glace pendant 5 min. Choc thermique des cellules pendant 30 secondes à 42 ° C. </li><li> Placer les tubes de la glace. Ajouter 125 pi de SOC. Placer les tubes dans un incubateur sous agitation à 37 ° C pendant 1 heure. </li></ol></li><li> Plaque 100 ul de cellules transformées sur des plaques LB avec l&#39;ampicilline (100 pg / ml), X-gal et IPTG. Cultivez O / N à 37 ° C </li></ol></li><li> Choisissez 1-3 colonies blanches pour chaque réaction et vérifier par colonie PCR utilisant des amorces TAL_F1 et TAL_R2 (tableau 2). <ol><li> Préparer une solution de la polymerase Mastermix, l&#39;eau et amorcesdécrit dans le tableau 3. Choisissez une colonie et de l&#39; étaler dans le fond d&#39;un tube PCR, puis mettre les restes de la colonie dans 2 ml de LB avec de l&#39; ampicilline (100 pg / ml). Placer 15 ul de la solution dans le tube de la colonie. </li><li> Exécuter le programme de PCR (tableau 6). </li><li> Vérifier la PCR sur un gel d&#39;agarose à 1,5% par électrophorèse. Les clones corrects auront un étalement et une échelle de bandes. Pour un exemple du frottis approprié, voir 34,33. </li><li> Cultivez 2 ml de cultures des clones corrects dans des milieux LB O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation. </li></ol></li><li> Miniprep les plasmides selon les instructions du fabricant. </li><li> Séquence pour vérifier la séquence TALEN avec TAL_F1 et TAL_R2 suivant les méthodes 35 décrites précédemment. </li></ol> 3. ARNm de transcription de TALENs <ol><li> Digest 4 pg de modèle de séquence vérifiée avec 2 pi Sac I pendant 2 heures à 37 ° C. </li&gt; <li> Essai 2 pi du plasmide digéré par Sacl sur un gel d&#39;agarose à 1,5% par électrophorèse. Plasmides qui sont correctement digérées afficheront une seule bande. </li><li> On purifie le reste du plasmide digéré par Sac I suivant le protocole de PCR kit de purification. Laver deux fois avec la solution de lavage avant l&#39;élution. Eluer dans 30 pi d&#39;eau sans nucléase. </li><li> Suivez le protocole standard pour la production T3 ARNm. <ol><li> Mettre en place des réactions de la moitié en utilisant 0,5 pg de modèle linéarisé (préparé ci-dessus). Incuber à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Ajouter 0,5 pi de DNase (inclus dans le kit) et incuber à 37 ° C pendant 15 min. </li></ol></li><li> Purifier l&#39;ARNm, en suivant les instructions du fabricant. Eluer dans 30 l&#39;eau sans nucléase ul. </li><li> Exécuter un gel agarose à 1,5% par électrophorèse pour vérifier l&#39;ARNm. <ol><li> Nettoyer le dispositif de gel avec un produit pour éliminer la contamination de RNase et de préparer un gel à 1,2%. </li><li> Mix 1 ul ARNm + 4 &amp;# 181; l sans nucléase l&#39;eau + 5 pi glyoxyl colorant de charge. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 30 min. Centrifuger les tubes brièvement et placer sur la glace avant d&#39;exécuter le gel. </li></ol></li><li> Vérifier la concentration en utilisant un procédé de quantification des concentrations d&#39;acide nucléique et de stocker l&#39;ARN dans des aliquotes à -80 ° C. Choisir une taille de l&#39;aliquote de telle sorte que l&#39;ARN n&#39;a pas été congelé / décongelé plusieurs fois. Remarque: Les concentrations de 500-1000 ng / nl sont généralement obtenus. ARN avec une concentration plus faible peut être utilisé aussi longtemps que l&#39;intégrité de l&#39;ARN est maintenue (telle qu&#39;évaluée par une bande plutôt que sur un frottis sur le gel). </li></ol> 4. Inject Astyanax mexicanus Embryons avec TALEN ARNm <ol><li> Préparer Outils pour injection. <ol><li> Verser des plaques d&#39;injection en versant 1,2% d&#39;agarose dans de l&#39;eau du poisson (eau traitée avec du bicarbonate de sodium et le sel de mer à un pH de 7,4 et une conductivité de 700 uS) dans une boîte de Pétri. Placez un moule (pièce en plastique avec des projections pour faire des puits pour les poissonsoeufs) à l&#39;intérieur du plat. Retirer le moule lorsque la gélose a durci et conserver à 4 ° C. Pour plus de détails sur le moule voir 36. </li><li> Tirez aiguilles pour l&#39;injection à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;aiguille selon les directives du fabricant. Remarque: la longueur de l&#39;aiguille appropriée est important pour les injections. Les aiguilles qui sont trop longues seront trop souples pour les injections. Le protocole pour les aiguilles de traction variera en fonction de l&#39;équipement utilisé pour tirer des aiguilles. Un exemple d&#39;une aiguille appropriée est représenté sur la figure 1. Pour notre équipement, nous nous retirons des aiguilles qui sont 5-6 cm de longueur, et ont un diamètre extérieur à la pointe d&#39;environ 0,011 mm lorsqu&#39;il est cassé. Cependant, les aiguilles doivent être étalonnés (étape 4.3.4) afin de déterminer la largeur d&#39;ouverture. Un exemple de programme pour extraire les aiguilles peuvent être trouvés dans le Tableau 7. </li><li> Préparer les pipettes en verre pour le transfert d&#39;embryons par rupture de la pipette, de sorte que l&#39;ouverture est assez grande pour un oeuf de passer à travers. Flamber l&#39;extrémité cassée jusqu&#39;à ceil est plus forte. Note: Il est important d&#39;utiliser des pipettes en verre et des bols en verre lorsque vous travaillez avec A. oeufs mexicanus et les embryons car ils sont collants et adhèrent au plastique. </li></ol></li><li> Collecter 1 cellule étape Eggs. <ol><li> Race A. mexicanus suivant des protocoles standards 37. Remarque: Par exemple, si les poissons sont maintenus sur un 14 cycle de lumière: obscurité 10 et en utilisant le temps Zeitgerber (ZT) avec ZT0 comme lumières allumées et ZT14 comme lumières éteintes, notre frai de surface entre ZT15 et ZT19. moment de la ponte exacte doit être déterminée pour chaque laboratoire individuel. </li><li> Provoquer frai par suralimenter les poissons pendant 3-4 jours avant l&#39;accouplement et à placer du poisson dans l&#39;eau douce. Augmenter la température de 2 ° C. Note: Notre température initiale de l&#39;eau est d&#39;environ 74 ° F. </li><li> Collecter les œufs de poissons de surface dans l&#39;obscurité, en vérifiant toutes les 15 minutes pour obtenir des œufs au stade 1 cellule. Des centaines d&#39;oeufs peuvent être obtenus à partir d&#39;une seule paire de poissons de surface. </li><li> Collecteœufs dans des bols en verre pour empêcher de coller aux surfaces en plastique et trier pour isoler embryons au stade 1 cellule avant l&#39;injection en observant les œufs sous le microscope et la collecte des œufs qui sont une seule cellule. Gardez les oeufs dans l&#39;eau douce du système (eau du réservoir dans lequel les poissons adultes sont logés, qui a été traité pour le pH et conductivité). </li></ol></li><li> Injecter TALEN ARNm. <ol><li> Injecter des quantités différentes d&#39;ARNm totale (quantités égales de chacun de la paire TALEN) afin de déterminer la concentration optimale pour l&#39;injection comme la toxicité et l&#39;efficacité varient en fonction TALEN paire. Commencer par l&#39;injection de concentrations d&#39;ARNm total qui sont 400-800, p. Diluer et de combiner l&#39;ARNm à des concentrations désirées pour injecter 1,5 nl. </li><li> Charge diluée ARNm dans le dos de l&#39;aiguille et fixez l&#39;aiguille à un micro-injecteur. </li><li> Casser l&#39;aiguille en utilisant une pince. </li><li> Calibrer l&#39;aiguille. Par exemple, éjectez 10 fois et récupérer la baisse résultant en un micro capillaire. 10 x 100 1,0 jetable81; l, 32 mm micro capillaire, la chute doit remplir le micro capillaire à 0,5 mm pour 1,5 / 1 injection nl. Réglez le temps et la pression d&#39;injection au besoin. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans la cellule unique et injecter l&#39;ARNm. Injecter directement l&#39;ARNm dans la cellule, et non pas dans le jaune d&#39;oeuf. </li><li> Recueillir des embryons injectés dans des bols en verre. Gardez embryons à 23-25 ​​° C. Retirer les embryons morts (embryons qui deviennent trouble et de forme irrégulière) régulièrement pendant les premiers jours suivant l&#39;injection. Un nombre record d&#39;embryons morts et déformés de contrôle (sans injection) et des plaques injectées. Remarque: la concentration d&#39;ARNm accrue peut conduire à une toxicité accrue et une déformation / mort des embryons. Ainsi, la toxicité par rapport à l&#39;efficacité doit être équilibrée pour déterminer la meilleure concentration de l&#39;ARNm pour l&#39;injection. </li></ol></li></ol> 5. Phénotype Fondateur poisson et évaluer l&#39;efficacité TALEN <ol><li> Sacrifiez embryons selon le protocole d&#39;animaux dans les institutions. Note: Nous euthanasierembryons par refroidissement rapide sur la glace. </li><li> Recueillir des embryons dans 0,8 ul de PCR tubes de bande à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. Remarque: Le génotypage peut être effectuée sur des embryons ou des pools d&#39;embryons individuels. </li><li> Extraire l&#39;ADN. <ol><li> La place des embryons dans 100 ul d&#39;hydroxyde de sodium 50 mM (NaOH) et incuber à 95 ° C pendant 30 min, puis refroidir à 4 ° C. </li><li> Ajouter 1/10 volume (10 ul) de 1 M de Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Effectuer une PCR sur la région en utilisant les amorces conçues à l&#39; étape 1.3 (voir les tableaux 8 et 9 pour les protocoles d&#39;échantillonnage). Pour les embryons individuels 1 pi d&#39;ADN est suffisante pour la réaction PCR. </li><li> Digest produit PCR résultant avec l&#39;enzyme de restriction appropriée et exécuter un gel agarose à 1,5% par électrophorèse. <ol><li> Par exemple, pour le génotypage du locus albinisme oculo 2 (OCA2) dans les embryons injectés digérer le produit de PCR en utilisant l&#39;enzyme de restriction Bsr I en ajoutant 0.5 Ul de Bsr I directement à 12,5 pi de la réaction PCR terminée, l&#39; incubation à 65 ° C pendant 2 heures. Exécutez le digérées et le produit digéré sur un gel. Les bandes résistantes à des enzymes de restriction ( par exemple, des bandes qui ne digère pas) indiquent que des mutations induites par TALEN sont présents (figure 2). </li></ol></li><li> (Facultatif) Calculer le taux de mutation de pourcentage en déterminant le pourcentage de produit non coupé par l&#39; analyse des images de gels à Fidji 38 à l&#39; aide de l&#39;outil d&#39;analyse de gel pour calculer la valeur d&#39;intensité de chaque bande comme décrit précédemment 29. </li><li> Déterminer la séquence des alleles mutants par clonage du TA purifié sur gel, l&#39;enzyme de restriction bande mutant résistant et le séquençage des clones. <ol><li> Gel purifier l&#39;enzyme de restriction bande mutant résistant suivant les instructions du fabricant. TA cloner la bande suivant les instructions du fabricant. Prélever des colonies et à croître dans 1,5 ml LB O / N à 37 ° C dans une secousseincubateur. </li><li> les cultures miniprep en suivant les instructions du fabricant. Envoyer l&#39;ADN pour le séquençage. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un programme tel que ApE, aligner les séquences mutantes à la séquence de type sauvage. <ol><li> Copiez et collez les deux séquences en fichiers ape. Choisissez l&#39;outil &quot;Aligner deux séquences&quot; dans le menu &quot;Outils&quot;. </li><li> Spécifiez les deux séquences d&#39;ADN en utilisant les menus déroulants. Remarque: le complément inverse de la séquence clonée peut être nécessaire d&#39;utiliser en fonction de la direction dans laquelle la PCR est entré dans le vecteur de clonage. Si les séquences ne sont pas alignés, répétez les étapes cochant la case &quot;Rev-Com&quot; dans la boîte &quot;Aligner l&#39;ADN&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Évaluer le poisson fondateur de phénotypes au stade approprié et en utilisant des méthodes appropriées pour le phénotype attendu 29 (Par exemple, la figure 3). Les méthodes de phénotypage seront basés sur le phénotype attendu pour le gène ciblé par le chercheur en utilisant le protocol. </li></ol> 6. écran pour la transmission germinale Remarque: A. mexicanus atteignent leur maturité sexuelle à 4-8 mois. <ol><li> Traversez poissons fondateur sexuellement matures type poisson sauvage. </li><li> Embryons d&#39;écran ou les poissons adultes en utilisant des méthodes dans les étapes 5.1-5.7 (Figure 4). Pour les poissons adultes, un morceau de la queue peut être fixé suivant anesthetization. <ol><li> Anesthetize poissons en immergeant le poisson dans une solution de tricaïne (ester éthylique de l&#39;acide 3-aminobenzoïque) pour réduire le stress lors de l&#39;écrêtage fin. Après découpage fin, permettent de récupérer le poisson dans l&#39;eau douce. Les poissons se rétablissent rapidement; observer jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient récupéré (nagent normalement). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

De grands progrès ont été réalisés ces dernières années dans la compréhension de la base génétique de l&#39;évolution des traits. Alors que les gènes candidats qui sous - tendent l&#39;évolution d&#39;un certain nombre de traits ont été identifiés, il est resté difficile de tester ces gènes in vivo en raison de l&#39;absence de traçabilité génétique des espèces les plus intéressantes évolutionnaire. Nous rapportons ici une méthode pour l&#39; édition du génome dans A. mexicanus, une espèce utilisée pou...

Comprendre la base génétique de l&#39;évolution caractéristique est un objectif de recherche critique des biologistes évolutionnistes. Des progrès considérables ont été accomplis dans l&#39; identification des loci sous - tendent l&#39;évolution des traits et d&#39; identifier des gènes candidats au sein de ces loci (par exemple 1-3). Cependant, le test fonctionnel du rôle de ces gènes est restée difficile que de nombreux organismes utilisés pour l&#39;étude de l&#39;évolution des traits ne sont actuellement pas génétiquement traitable. L&#39;avènement des technologies de l&#39;édition du génome a considérablement augmenté manipulabilité génétique d&#39;un large éventail d&#39;organismes. Transcription nucléases activateurs comme effecteurs (Talens) et regroupés régulièrement espacées répétitions courtes palindromiques (de CRISPRs) ont été utilisés pour générer des mutations ciblées dans des gènes dans un certain nombre d&#39;organismes (par exemple 4-11). Ces outils, appliqués à un système évolutionnaire pertinent, ont le potentiel de révolutionner le chemin biologistes évolutionnistes étudier la base génétique de l&#39;évolution. Astyanax mexicanus est une espèce de poisson qui existe sous deux formes:. Un (poissons de surface) de la rivière-logement sous forme de surface et de multiples formes cavernicoles (de cavefish) A. mexicanus cavefish a évolué à partir d&#39; ancêtres de poissons de surface (revue dans 12). Les populations de poissons cavernicoles ont évolué un certain nombre de traits , y compris la perte d&#39;yeux, de diminuer ou de la perte de la pigmentation, nombre de papilles gustatives et neuromastes crâniens, et les changements accru de comportement tels que la perte du comportement de la scolarité, l&#39; augmentation de l&#39; agressivité, des changements dans l&#39; alimentation posture et hyperphagie 13 -19. Cavefish et les poissons de surface sont interfécondes, et des expériences de cartographie génétique ont été réalisées pour identifier les gènes loci et candidats pour les caractères de la grotte 1,20-26. Certains gènes candidats ont été testés pour un rôle fonctionnel dans la contribution aux caractéristiques des cavernes dans la culture cellulaire 1,19, dans des organismes modèles d&#39;autres espèces 21 ou 27 par une surexpression ou knock - down temporaire uchanter morpholinos 28 A. mexicanus. Cependant, chacune de ces méthodes a des limites. La capacité de générer des alleles mutants de ces gènes chez A. mexicanus est essentiel pour la compréhension de leur fonction dans l&#39;évolution de cavefish. Ainsi, A. mexicanus est un organisme candidat idéal pour l&#39; application des technologies de modification du génome. Nous présentons ici une méthode pour l&#39; édition du génome dans A. mexicanus utilisant TALENs. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer la mosaïque injectée fondateur du poisson pour les phénotypes et pour isoler les lignes de poissons avec des mutations stables dans les gènes d&#39;intérêt 29.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Station</td><td></td><td></td><td></td>d’injection</tr><tr><td>Appareil</td><td></td><td></td><td></td>à gel</tr><tr><td>Extracteur</td><td></td><td></td><td></td>d’aiguille</tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Entreprise <</td><td>strong>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Remarque : Pour autant que nous le sachions, les fournitures de différentes sociétés peuvent être utilisées, sauf indication</td><td></td><td></td><td></td>contraire</tr><tr><td>Golden Gate TALEN et TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulé)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiologie Support : LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 en 50 % EtOH</td><td>Teknova (commandé via Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de spectinomycine, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super ampicilline (1 000x solution)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, prête à l’emploi</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (commandée auprès de Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (commandée auprès de Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Utiliser BsaI, et non BsaI-HF (comme décrit dans le protocole Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>fourni avec des enzymes de</td><td></td>restriction</tr><tr><td>10x tampon T4 ligase</td><td>Promega (commandé par Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (commandé par Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>D’autres Taq peuvent être utilisés, mais la réaction doit être ajustée en conséquence</td></tr><tr><td>Kit de ligature rapide</td><td>New England Biolabs (commandé via Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>Nous utilisons Quick Ligase pour toutes les réactions d’assemblage TALEN</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chimiquement compétent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>D’autres cellules chimiquement compétentes ou des cellules compétentes faites maison peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (commandé via Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (commandé via Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Le kit Qiagen doit être utilisé pour la préparation initiale du plasmide (comme décrit dans le protocole du Golden Gate TALEN et du TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR</td><td>Purification Kit Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>F-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (commandé par Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&nbsp ;</td><td>Ambion (commandé par Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (commandé par Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Verre sodocalcique jetable Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips pour micro-injecteur Femtojet</td><td>Eppendorf (commandé chez Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

génome Édition dans<em&gt; astyanax mexicanus</em&gt; utilisation transcription activator comme effector nucléases (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifier les allèles des gènes sous-jacents au changement évolutif est essentiel pour comprendre comment et pourquoi l’évolution se produit. À cette fin, de nombreux travaux récents se sont concentrés sur l’identification de gènes candidats pour l’évolution des traits chez une variété d’espèces. Cependant, jusqu’à récemment, il a été difficile de valider fonctionnellement des gènes candidats intéressants. Des outils récemment développés pour le génie génétique permettent de manipuler des gènes spécifiques dans un large éventail d’organismes. L’application de cette technologie dans des organismes pertinents pour l’évolution permettra d’obtenir un aperçu sans précédent du rôle des gènes candidats dans l’évolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) est une espèce de poisson avec des formes habitant à la surface et dans des grottes. De multiples lignées indépendantes de formes cavernicoles ont évolué à partir de poissons de surface ancestraux, qui sont interfertiles les uns avec les autres et avec les poissons de surface, permettant d’élucider la base génétique des traits des grottes. A. mexicanus a été utilisé pour un certain nombre d’études évolutives, y compris l’analyse de liaison pour identifier les gènes candidats responsables d’un certain nombre de caractères. Ainsi, A. mexicanus est un système idéal pour l’application de l’édition du génome afin de tester le rôle des gènes candidats. Ici, nous rapportons une méthode d’utilisation de nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) pour faire muter des gènes dans la surface d’A. mexicanus. L’édition du génome à l’aide de TALEN chez A. mexicanus a été utilisée pour générer des mutations dans les gènes de pigmentation. Cette technique peut également être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats pour un certain nombre d’autres traits qui ont évolué dans les formes grottes d’A. mexicanus.

Talen paire injections entraînent dans la liaison des DRV à nucléotides d&#39;ADN spécifiques et donc dimérisation des domaines FokI, entraînant des cassures double brin 39 qui peuvent être réparés par l&#39; extrémité non homologue de jonction (NHEJ). NHEJ introduit souvent des erreurs qui se traduisent par des insertions ou délétions (indels). Indels peuvent être identifiés par l&#39;amplification de la région entourant le site cible TALEN et de digérer l&#39;amplic...

la mutagenèse du gène de ciblage est maintenant possible dans une large gamme d&#39;organismes en utilisant des techniques de montage du génome. Ici, nous démontrons un protocole pour la mutagenèse du gène ciblé utilisant l&#39; activateur de la transcription comme nucléases effectrices (Talens) dans Astyanax mexicanus, une espèce de poisson qui comprend les poissons de surface et cavefish.

Génome Édition dans<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Utilisation Transcription Activator comme Effector nucléases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

L'objectif général de cette procédure est d'introduire des mutations dans des gènes spécifiques du poisson des grottes Astyanax mexicanus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés du domaine de la biologie de l'évolution concernant la base génétique de l'évolution des caractères troglodytes. Le principal avantage de cette technique est que l'effet de la perte du gène spécifique peut désormais être testé chez Astyanax mexicanus.Après avoir conçu et assemblé des nucléases effectrices de type activateur de transcription, ou TALEN, conformément au protocole décrit, utilisez deux microlitres de Sac1 pour digérer quatre microgrammes de matrice dont la séquence a été vérifiée, à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Faites migrer deux microlitres de la matrice digérée par Sac1 sur un gel d'agarose à un point cinq pour cent et vérifiez la présence d'une seule bande afin de confirmer la digestion. Pour réaliser la production d'ARNm T3, utilisez zéro virgule cinq microgramme de matrice linéarisée pour préparer des réactions demi-tailles en suivant un protocole standard.Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, ajouter 0,4 microlitre de DNase et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après la purification de l'ARNm, pour vérifier la qualité, utiliser un produit éliminant la contamination par les RNases afin de nettoyer l'appareil pour gel.Ensuite, préparez un gel à 1,2 %. Mélangez un microlitre d'ARNm, quatre microlitres d'eau sans nucléase et cinq microlitres de colorant de charge au glyoxal. Incubez les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, centrifuger brièvement les tubes, puis les placer sur de la glace avant de réaliser l'électrophorèse sur gel. Après avoir vérifié la concentration de l'ARNm, préparer des aliquotes avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius. Se référer au protocole écrit pour plus de détails.Après avoir préparé les aiguilles d'injection et les boîtes selon le protocole décrit, induire la ponte chez A.mexicanus en suralimentant les poissons pendant trois à quatre jours avant la reproduction et placer les poissons dans de l'eau fraîche. Augmenter la température de l'eau de deux degrés Fahrenheit, soit environ 76 degrés Celsius. Vérifier toutes les 15 minutes la présence d'œufs en surface dans l'obscurité et les transférer dans des bols en verre afin d'éviter qu'ils n'adhèrent à la surface.Des centaines d'œufs peuvent être obtenus à partir d'un seul couple de poissons de surface. Sous un microscope, trier les œufs isolés et transférer ceux au stade une cellule vers de l'eau de système fraîche. Charger l'ARNm dilué à l'arrière de l'aiguille et détacher l'aiguille vers un microinjecteur.Ensuite, à l’aide de pinces, cassez l’aiguille. Pour étalonner l’aiguille, effectuez 10 injections et recueillez la goutte résultante dans une microcapillaire. La goutte doit remplir une microcapillaire jetable de un microlitre, 10 par 100, 32 millimètres jusqu’à zéro virgule cinq millimètres par injection de un virgule cinq nanolitre.Insérez maintenant l'aiguille dans la cellule unique et injectez l'ARNm. Ramassez les embryons injectés dans des bols en verre et incubez-les à une température de 23 à 25 degrés Celsius. Éliminez régulièrement les embryons morts pendant les premiers jours suivant l'injection.Enregistrez le nombre d'embryons morts et déformés provenant des plaques témoins non injectées et des plaques injectées. Reportez-vous au protocole écrit pour plus de détails. Après avoir euthanasié les poissons conformément au protocole IACUC de votre établissement, pour extraire l'ADN, réunissez les embryons dans 100 microlitres de soude à 50 millimolaire et incubez à 95 degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, refroidir à quatre degrés Celsius. Ajouter un dixième du volume d'une solution de tris HCl 1 M, pH 8, aux embryons refroidis. Puis réaliser une PCR en utilisant des amorces, par exemple pour le gène de l'albinisme oculocutané deux ou OCA2.Pour chaque embryon, un microlitre d'ADN suffit pour la réaction de PCR. Pour génotyper le locus OCA2, utilisez l'enzyme de restriction DSR1 afin de digérer le produit de PCR obtenu en ajoutant directement zéro virgule cinq microlitre d'enzyme à douze virgule cinq microlitres de la réaction de PCR terminée. Après une incubation à 65 degrés Celsius pendant deux heures, analysez la réaction ainsi qu'un échantillon du produit de PCR non digéré sur un gel d'agarose à un virgule cinq pour cent.Effectuez des analyses supplémentaires conformément au protocole écrit. Les injections de TALEN peuvent provoquer des cassures double brin de l'ADN qui peuvent être réparées par jonction non homologue des extrémités, mais qui peuvent également introduire des insertions ou des délétions, appelées INDELs. En utilisant une digestion par restriction ciblant la région espaceur des TALEN, les INDELs peuvent être identifiés par la présence d'une bande résistante à l'enzyme de restriction.Les injections de TALEN peuvent produire des mutations géniques bialléliques chez A.mexicanus, ce qui permet d'évaluer certains phénotypes chez les poissons fondateurs. Par exemple, le gène OCA2, dont on pense qu'il est responsable de l'albinisme chez les poissons des grottes, a été évalué. Comme illustré ici, des taches albinos ont été identifiées chez les poissons injectés avec des TALEN ciblant OCA2, taches qui n'étaient pas présentes chez les poissons non injectés.Dans cette image de gel, des produits de PCR de 306 paires de bases provenant de l'exon neuf de OCA2 d’A.mexicanus ont été analysés afin de détecter la perte du site d’enzyme de restriction dans des pools de 10 poissons F1 issus d’un poisson fondateur injecté. L’amplicon provenant d’un embryon témoin a été digéré, tandis qu’une partie de l’amplicon s’est révélée résistante à la digestion par restriction dans les embryons F1 issus de poissons injectés. En outre, les bandes résistantes à la digestion par restriction se sont révélées contenir des INDELs.Une fois maîtrisées, ces injections peuvent être réalisées en moins de quelques heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler soigneusement l'ARN afin d'éviter sa dégradation et d'effectuer les injections au stade une cellule. Après cette procédure, une analyse phénotypique peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires, comme de savoir si un gène particulier est à l'origine d'un phénotype clé chez le poisson lorsque celui-ci est muté chez les poissons de surface.Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie évolutive pour caractériser le rôle des gènes candidats dans l'évolution du poisson des cavernes Astyanax mexicanus. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment injecter des embryons d’Astyanax mexicanus avec de l’ARNm TALEN.

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Cette vidéo présente une technique d’édition du génome basée sur les nucléases à doigts de zinc dans des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Comme les hPSC peuvent potentiellement être différenciées en différents types de cellules, cette technologie est utile pour les études pathologiques et pharmacologiques in vitro d’une manière spécifique au patient.

Édition du génome basée sur les nucléases à doigts de zinc : une technique de modification du génome dans les cellules souches pluripotentes humaines par un mécanisme de réparation dépendant de l’homologie double brin

nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) peuvent être utilisés pour modifier le génome d'embryons de pré-implantation de souris en déclenchant à la fois la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH) des voies. Ces progrès permettent la génération rapide de la souris avec des modifications génétiques précises.

Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

Manipulations transgéniques et l' édition du génome sont essentielles pour tester fonctionnellement le rôle des gènes et des éléments cis -Informations règlementaires. Voici un protocole de microinjection détaillé pour la génération de modifications génomiques (y compris les constructions fluorescentes Tol2 médiées reporters transgène, TALENs et CRISPRs) est présenté pour le poisson modèle émergent, l'épinoche à trois épines.

Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Les auteurs décrivent les approches pour la manipulation des gènes dans le système de modèle évolutionniste Astyanax mexicanus. Trois techniques différentes sont décrites : Tol2 médiée par transgénèse, manipulation ciblée du génome à l’aide de CRISPR/Cas9 et précipitation d’expression utilisant les morpholinos. Ces outils devraient faciliter l’enquête directe des gènes qui sous-tendent la variation entre les formes de surface - et cavernicoles.

Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

Présenté ici est un protocole pour effectuer le temps et l'espace-limité gène knock-out dans les moelles épinières axolotl en injectant CAS9-gRNA complexe dans le canal central de la moelle épinière suivie d'électroporation.

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.

Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e

L’efficacité de la méthode I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) est comparable à celle de la micro-injection traditionnelle, qui nécessite la collecte de zygotes sur les femelles donneuses et le transfert à des femelles pseudo-enceintes. Ce protocole démontre son efficacité en introduisant des mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le locus ROSA26 sur le chromosome 6.

Amélioration de l’édition du génome via une technique d’électroporation in vivo basée sur l’administration d’acides nucléiques oviductaux pour la génération de souris knock-out

La délivrance des éditeurs génomiques sous forme d’ARN est un moyen particulièrement puissant de modifier les génomes des cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères. L’objectif de ce protocole est de délivrer des éditeurs de génome sous forme d’ARNm dans les cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères, suivis d’un séquençage ciblé Illumina et d’une analyse afin de quantifier les résultats d’édition.

Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur

Apprenez l'édition génomique par TALENs chez Astyanax mexicanus pour étudier les bases génétiques des adaptations cavernicoles. Cette méthode permet d'introduire des mutations ciblées et d'analyser leurs effets phénotypiques.

Génome Édition dans

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