Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la fonction suppressive in vitro des lymphocytes T régulateurs, isolés de souris infectées par un virus chronique. Cette méthode peut aider à répondre aux questions sur le phénotype et la fonction suppressive in vitro des lymphocytes T régulateurs activés lors d’une infection virale chronique. Cette technique permet d’évaluer l’effet direct des lymphocytes T régulateurs sur l’individu avec une réponse positive aux lymphocytes T in vitro.

C’est un grand avantage de cette technique. Commencez par transférer cinq fois dix au cinquième lymphocytes spléniques totaux dans 50 microlitres de tampon facs dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 96 puits à fond d’U, suivi de 150 microlitres de tampon facs. Centrifugez la plaque et jetez le surnageant.

Ensuite, agitez les pastilles cellulaires et lavez les cellules deux fois de plus dans 200 microlitres de tampon facs par puits. Après le deuxième lavage, remettez les granulés en suspension dans 50 microlitres de cocktail d’anticorps par puits, pendant 20 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules deux fois dans un tampon facs et décantez le surnageant.

Ensuite, fixez les cellules pendant 20 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius avec 100 microlitres de tampon de fixation, suivi de deux lavages avec tampon de lavage de perméabilisation. Après le deuxième lavage, remettre les cellules en suspension dans 50 microlitres d’anticorps anti-FOXP3. Pour préparer les billes revêtues d’anti CD3 CD28, transférez le volume approprié de billes magnétiques dans un tube de 15 millilitres et ajoutez un volume égal de PPS.

Mélangez doucement la solution par pipetage et centrifugez les billes magnétiques. À la fin du lavage, jetez le surnageant et diluez les billes dans 50 microlitres de milieu complet par puits. Ensuite, ensemencez 50 microlitres d’un fois dix pour les cinquièmes lymphocytes T régulateurs CD4 positifs CD25 positifs par puits dans une plaque inférieure U de 96 puits, suivis de 50 microlitres d’un fois dix pour les cinquièmes lymphocytes T CD8 positifs par puits.

Lorsque toutes les cellules ont été plaquées, ajoutez 50 microlitres de billes diluées revêtues d’anti CD3 CD28 dans chaque puits, et ajoutez jusqu’à 50 microlitres de milieu pour porter le volume total de chaque puits à 200 microlitres. Ensuite, couvrez l’assiette avec du papier d’aluminium et placez-la à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Pour analyser la production de cytokines des lymphocytes T CD8 positifs, après trois jours de culture, transférez les surnageants dans une autre plaque à 96 puits et analysez les surnageants par ELISA, selon les instructions du fabricant.

Pour analyser la prolifération des lymphocytes T CD8 positifs, laver trois fois la plaque de cellules avec le tampon facs. Ensuite, réinstallez les pastilles en suspension dans 50 microlitres d’un cocktail d’anticorps approprié contre les lymphocytes T CD8 positifs proliférés pendant 20 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois dans un tampon facs et fixez-les pendant 20 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius avec 100 microlitres de tampon de fixation.

Enfin, lavez les cellules deux fois de plus dans le tampon facs et remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon facs. Mesurer ensuite le pourcentage de prolifération des lymphocytes T CD8 positifs par cytométrie en flux. Dans les lymphocytes spléniques obtenus à partir de souris naïves et infectées,-1 est spécifiquement régulé à la hausse dans les cellules CD4 positives FOXP3 négatives conventionnelles et les cellules CD8 positives négatives FOXP3 des souris infectées par le clone 13 du LCMV.

La fréquence des lymphocytes T régulateurs CD4 positifs FOXP3 est deux fois plus élevée chez les souris infectées par le clone 13 du LCMV que chez les souris naïves, la plupart des cellules CD4 positives de FOXP3 présentant également un phénotype-1 élevé activé. Les lymphocytes T CD8 répondeurs positifs peuvent être séparés avec succès sans contamination significative par d’autres cellules immunitaires. Après l’isolement des lymphocytes T régulateurs, une population dominante de lymphocytes T CD25 positifs CD4 positifs avec une pureté supérieure à 80 % peut être obtenue.

La stimulation de lymphocytes T régulateurs et répondeurs isolés par des billes enrobées d’anti-CD3 CD28 entraîne l’inhibition des lymphocytes T CD8 répondeurs positifs de manière dose-dépendante. En effet, lorsque des lymphocytes T CD8 répondeurs positifs sont co-cultivés avec des lymphocytes T régulateurs chroniques dans un rapport de un à un, la prolifération des lymphocytes T CD8 répondeurs positifs est considérablement inhibée. La production d’interféron gamma par les cellules répondeuses CD8 positives est également inhibée de manière significative lorsque les cellules T répondantes CD8 positives sont co-cultivées avec des cellules T régulatrices activées de souris infectées de manière chronique, par rapport à la co-culture avec des cellules T régulatrices au repos de souris naïves.

Nous avons constaté que cette technique peut être réalisée en 80 heures si elle est exécutée correctement. Pendant que vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des lymphocytes T régulateurs fraîchement isolés immédiatement après leur isolement. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine pour explorer la fonction des lymphocytes T régulateurs dans une maladie inflammatoire chronique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en place d’une procédure de suppression des lymphocytes T régulateurs in vitro, à l’aide d’un système de co-culture de lymphocytes T régulateurs et répondeurs.