Name: Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Découvrez l'analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T régulatrices isolées de souris infectées par le virus de la chorioméningite lymphocytaire chronique. Cette méthode évalue leur activité suppressive in vitro.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche en sciences fondamentales par l’intermédiaire de la Fondation nationale pour la recherche de Corée (NRF) financé par le ministère de l’Éducation (2015R1A6A3A01020610 à HJP) et une subvention du projet coréen de R&D sur les technologies de la santé, ministère de la Santé, du Bien-être et des Affaires familiales, République de Corée (HI15C0493 à SJH).

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<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
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<li>McHugh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+immunoregulatory+T+cells%3A+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+constitutively+expressing+cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4.</a> J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+Mycobacterium+tuberculosis+immunity+in+patients+with+active+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease.</a> Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).</li>
<li>Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-specific+regulatory+T+cells+delay+the+arrival+of+effector+T+cells+in+the+lung+during+early+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis.</a> J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).</li>
<li>Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+control+Leishmania+major+persistence+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity.</a> Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).</li>
<li>Grainger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helminth+secretions+induce+de+novo+T+cell+Foxp3+expression+and+regulatory+function+through+the+TGF-beta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway.</a> J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).</li>
<li>cells in helminth infection: the regulators and the regulated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Trends+Immunol%22">Trends Immunol</a>. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).</li>
<li>You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regulatory+T+cells+potently+abrogate+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity.</a> J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).</li>
<li>Curiel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li>
<li>Dittmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impairment+of+CD8%28%2B%29+T+cells+by+regulatory+T+cells+during+persistent+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection.</a> Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).</li>
<li>Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+suppression+of+CD8%2B+T+cell+function+by+Friend+virus-induced+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells.</a> J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).</li>
<li>Iwashiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+by+CD4%2B+regulatory+T+cells+induced+by+chronic+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).</li>
<li>Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+T+cells+regulate+virus-specific+primary+and+memory+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses.</a> J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).</li>
<li>Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+control+the+severity+of+viral+immunoinflammatory+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions.</a> J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).</li>
<li>Veiga-Parga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+regulatory+T+cells+during+viral-induced+inflammatory+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions.</a> J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+CD8%2B+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li>
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<li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+infection+with+respiratory+syncytial+virus+impairs+regulatory+T+cell+function+and+increases+susceptibility+to+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma.</a> Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).</li>
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<li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li>
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<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li>
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S.-J.H. est titulaire d’un brevet et perçoit des redevances de brevet liées à la voie-1. Les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier.

Bien que seulement un petit nombre de cellules T reg existe chez les souris et les humains, il est important de comprendre leur fonction , car ils jouent un rôle crucial dans la régulation de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance immunitaire. Le nombre et les suppresseurs fonctions de T reg cellules augmente au cours d&#39; une infection chronique par le virus 15-20 ainsi que la progression du cancer 13,14. Ceci est probablement dû à la stimulation antigénique ...

Cellules régulatrices T (T reg) expriment forkhead box P3 (Foxp3) en tant que facteur de transcription pour leur développement et la fonction 1. En outre, les cellules T reg expriment diverses autres molécules telles que CD25 2, le gène lymphocyte activation 3 (LAG-3) 3, d&#39;une tumeur du récepteur du facteur de nécrose induite par glucocorticoïde-4 et des lymphocytes T cytotoxiques-associated protein 4 (CTLA-4) 5 sur leur surface ou la région intracellulaire. Au cours de l&#39; infection chronique par divers types d&#39;organismes pathogènes tels que les virus, les bactéries 6,7 à 8,9 et les parasites 10-12, ou dans le cadre du développement du cancer 13,14, les cellules T reg se différencient en cellules activées, l&#39; affichage amélioré la fonction suppressive des cellules effectrices CD4 + et de ciblage T CD8 +. Un certain nombre d&#39;articles ont suggéré que les cellules T reg élargies et activées contribuent aux responsab dépréciés de lymphocytes T CD8 +e pendant ami retrovirus (FV) infection 15-17. Cellules T reg FV-induites inhibent l&#39; IFN-γ ou l&#39; expression du granzyme B et réactivité cytotoxique des cellules T CD8 + 15-17. En outre, dans un modèle d&#39;infection par le virus de l&#39; herpès simplex, il a été rapporté que l&#39; épuisement des cellules reg CD4 + CD25 + T conduit à l&#39; expansion de cellules T CD8 + spécifiques du virus et de graves lésions tissulaires par une infiltration de cellules T CD4 + immunopathogènes 18-20. Les souris infectées de manière chronique avec la souche 13 clone du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV CL13) 21-24 ont été largement utilisés pour caractériser le phénotype et la fonction des cellules T effectrices (T eff) et des cellules T reg durant une infection virale chronique. Au cours de l&#39; infection par LCMV persistante, les cellules eff spécifique du virus T perdent progressivement leur fonction d&#39;effecteur et deviennent des cellules épuisées T (T exh). D&#39;un autre côté, Tcellules reg renforcent leur capacité à supprimer la réponse cellulaire spécifique du virus T 25. La diminution de la capacité de fonctionnement des cellules eff T peut être expliquée par plusieurs facteurs tels que la régulation positive des récepteurs inhibiteurs sur les cellules eff T, la fonction altérée des cellules présentatrices d&#39;antigène, la production de cytokines immunorégulatrices, et augmentation de la fréquence ou de la fonction améliorée de T reg cellules 26. Parmi les facteurs impliqués dans la suppression des cellules T, la mort cellulaire programmée protein-1 (PD-1) exprimant les cellules éch T et les cellules T reg ont été largement considérées comme les caractéristiques de l&#39; antigène de persistance et de l&#39; environnement suppressive. Récemment, il a été signalé que le blocage de la voie PD-1 et l&#39; ablation des cellules T reg conduit à l&#39; amélioration de la fonction des cellules T et une diminution de la charge virale au cours LCMV infection chronique 27. En outre, les cellules T reg sont activées lors de l&#39; infection chronique de souris avec 23,25 LCMV </sup&gt; et leur fonction suppressive est renforcée 25. PD-1 est fortement exprimé sur les lymphocytes T reg ainsi que des cellules T EXH, et le niveau de PD-1 exprimé par les cellules T reg est en corrélation avec la force de leur fonction suppressive pour inhiber la prolifération des lymphocytes T 25. Ici, nous décrivons une méthode pour comparer les caractéristiques des cellules T activées reg isolées à partir de souris infectées par LCMV CL13 et de repos des cellules T reg isolées de souris naïves. En outre, nous expliquons une série de processus pour séparer les cellules reg T activées et examiner leur ex vivo phénotype, ainsi que de mesurer leur activité suppressive in vitro.

<table><tbody><tr><td>FITC Rat Anti-Souris CD4</td><td>RM4-5</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td></tr><tr><td>U-Bottom Plaques</td><td></td> de Culture Tissulaire <td>BD Biosciences</td><td>353077</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td> de fixation <td>BD Biosciences</td><td>554655</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Souris CD25</td><td>7D4</td><td>BD Biosciences</td><td>553072</td></tr><tr><td>Crépine à cellules, 70 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td></tr><tr><td>Crépine à cellules, 40 mm</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-souris CD279 (-1)</td><td>29F.1A12</td><td>BioLegend</td><td>135217</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Souris CD4</td><td>RM4-5</td><td>Biolegend</td><td>100547</td></tr><tr><td>APC Anti-Souris/Rat Foxp3&nbsp ;</td><td>FJK-16s</td><td>eBioscience</td><td>17-5773</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-5223</td></tr><tr><td>PerCP-Cyanine5.5 Anti-souris CD8a</td><td>53-6.7</td><td>eBiosicence</td><td>45-0081</td></tr><tr><td>Souris IFN-gamma Platinum ELISA</td><td></td><td>eBiosicence</td><td>BMS606</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30256</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td> de lysage ACK <td>Gibco</td><td>A10492-01</td></tr><tr><td>L-Glutamine, solution de 200 mM</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td>Référence 25030</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine, 10 000 U/ml</td><td></td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>Référence 10378-016</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes dans le proche infrarouge fixable</td><td>Life technologies</td><td>L-34975</td>CD8a+ Kit d’isolation des cellules T, souris Miltenyibiotec 130-104-075 CD4+ CD25+ Kit d’isolement réglementaire des cellules T, souris Miltenyibiotec 130-091-041 Colonnes de séparation MACS, colonnes LD <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-901</td></tr><tr><td>Colonnes de séparation MACS, colonnes</td><td></td> LS <td>Miltenyibiotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M (pH 8,0)</td><td></td><td>Promega</td><td>V4231</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td></td><td>Sigma Life Science</td><td>M7522</td></tr><tr><td>Sérum</td><td></td> de veau fœtal <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30919.03</td></tr><tr><td>CellTrace Violet Cell</td> <td>Kit de prolifération cellulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34557</td></tr><tr><td>BD Débitcytomètre</td><td></td> Canto II <td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td></td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Hématocytomère</td><td></td><td>Marienfeld superior</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules t activées regulatory isolés de chorioméningite lymphocytaire souris infectées par le virus chroniques

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Cellules régulatrices T (T reg), qui expriment Foxp3 comme un facteur de transcription, sont des sous - ensembles de cellules T CD4 +. Lymphocytes T reg jouent un rôle crucial dans la tolérance immunitaire et le maintien de l&#39; homéostasie en régulant la réponse immunitaire. Le rôle principal des cellules T reg est de supprimer la prolifération des T effecteurs (Teff) des cellules et la production de cytokines telles que l&#39; IFN-γ, le TNF-α et IL-2. Il a été démontré que la capacité des cellules T Reg pour inhiber la fonction des cellules T eff est augmentée au cours de l&#39; infection par le pathogène persistant et le développement du cancer. Afin de clarifier la fonction des cellules T reg sous repos ou enflammées conditions, une variété de tests in vitro de suppression en utilisant des cellules reg souris ou T humains ont été mis au point. L&#39;objectif principal de cette étude est de développer une méthode pour comparer les différences dans le phénotype et la fonction suppressive entre repos et T reg activécellules. D&#39;isoler des cellules T activées reg, les souris ont été infectées avec le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) , le clone 13 (CL13), une souche de LCMV chronique. Lymphocytes T reg isolés de la rate des souris infectées par LCMV-CL13 présentaient à la fois le phénotype activé et l&#39; activité suppressive accrue par rapport aux cellules T au repos reg isolées à partir de souris naïves. Ici, nous décrivons le protocole de base pour une analyse ex vivo de phénotype de distinguer les cellules reg T activées à partir de cellules au repos T reg. En outre, on décrit un protocole pour la mesure de l&#39;activité suppressive des cellules T reg complètement activés.

Nous avons généré des souris avec une infection virale persistante en leur injectant 2 x 10 6 pfu de LCMV CL13 par voie intraveineuse. Pour étudier les changements phénotypiques dans les cellules reg T et les cellules T du cours de l&#39; infection par le virus chronique, des lymphocytes spléniques provenant de souris naïves et infectées ont été colorés avec divers anticorps et analysées par cytométrie en flux. A 16 ans d pi, PD-1 a été régulée à la hauss...

Ici, nous décrivons un protocole pour analyser le phénotype des cellules T régulatrices (Treg) isolées de souris naïves et chroniques infectées par le virus de la chorioméningite lymphoïde. De plus, nous proposons un processus pour évaluer l’activité suppressive des cellules Treg.

Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la fonction suppressive in vitro des cellules T régulatrices isolées de souris infectées par un virus chronique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions concernant le phénotype et la fonction suppressive in vitro des cellules T régulatrices activées durant une infection virale chronique. Cette technique permet d'évaluer l'effet direct des cellules T régulatrices sur l'individu présentant une réponse positive des cellules T in vitro.Il s'agit d'un grand avantage de cette technique. Commencez par transférer cinq fois dix à la puissance cinq lymphocytes spléniques totaux dans 50 microlitres de tampon FACS dans chaque puits d'une nouvelle plaque 96 puits en U, suivis de 150 microlitres de tampon FACS. Centrifugez la plaque et éliminez le surnageant.Ensuite, agiter les culots cellulaires et laver les cellules deux fois supplémentaires dans 200 microlitres de tampon FACS par puits. Après le deuxième lavage, resuspendre les culots dans 50 microlitres de cocktail d'anticorps par puits, pendant 20 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius. Puis laver les cellules deux fois dans du tampon FACS et décantir le surnageant.Ensuite, fixer les cellules pendant 20 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius avec 100 microlitres de tampon de fixation, suivi de deux lavages avec du tampon de lavage perméabilisant. Après le deuxième lavage, resuspendre les cellules dans 50 microlitres d'anticorps anti-FOXP3. Pour préparer les billes revêtues d'anticorps anti-CD3 CD28, transférer le volume approprié de billes magnétiques dans un tube de 15 millilitres, puis ajouter un volume égal de PPS.Mélanger délicatement la solution par pipetage et centrifuger les billes magnétiques. À la fin du lavage, éliminer le surnageant et diluer les billes dans 50 microlitres de milieu complet par puits. Ensuite, semer 50 microlitres de cinq fois dix puissance quatre cellules T régulatrices CD4 positif CD25 positif par puits dans une plaque en U de 96 puits, suivis de 50 microlitres de cinq fois dix puissance quatre cellules T répondeuses CD8 positif par puits.Lorsque toutes les cellules ont été ensemencées, ajouter 50 microlitres des billes recouvertes d'anticorps anti-CD3 et CD28 diluées dans chaque puits, puis ajouter jusqu'à 50 microlitres de milieu afin d'ajuster le volume total de chaque puits à 200 microlitres. Ensuite, recouvrir la plaque d'une feuille d'aluminium et l'incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant 72 heures. Pour analyser la production de cytokines par les lymphocytes T CD8 positifs, après trois jours de culture, transférer les surnageants dans une autre plaque de 96 puits et analyser les surnageants par ELISA, conformément aux instructions du fabricant.Pour analyser la prolifération des lymphocytes T CD8 positifs, laver la plaque de cellules trois fois avec du tampon FACS. Ensuite, resuspendre les culots dans 50 microlitres d'un mélange d'anticorps approprié dirigé contre les lymphocytes T CD8 positifs proliférés pendant 20 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius. À la fin de l'incubation, laver les cellules deux fois dans du tampon FACS et les fixer pendant 20 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius avec 100 microlitres de tampon de fixation.Enfin, laver les cellules deux fois supplémentaires dans le tampon FACS et resuspendre les culots dans 200 microlitres de tampon FACS. Ensuite, mesurer le pourcentage de prolifération des cellules T CD8 positives doublement marquées par Phylate par cytométrie en flux. Chez les lymphocytes spléniques obtenus à partir de souris naïves et infectées, la protéine PD-1 est spécifiquement surexprimée à la fois dans les cellules CD4 positives conventionnelles FOXP3 négatives et les cellules CD8 positives FOXP3 négatives des souris infectées par le LCMV clone 13.La fréquence des cellules T régulatrices CD4 positives exprimant FOXP3 est deux fois plus élevée chez les souris infectées par le LCMV clone 13 que chez les souris naïves, la majorité des cellules T CD4 positives exprimant FOXP3 présentant également un phénotype activé PD-1 élevé. Les cellules T CD8 positives effectrices peuvent être séparées avec succès sans contamination significative par d'autres cellules immunitaires. Après l'isolement des cellules T régulatrices, une population dominante de cellules T CD4 positives CD25 positives avec une pureté supérieure à 80 pour cent peut être obtenue.La stimulation de lymphocytes T régulateurs et effecteurs isolés par des billes revêtues d'anticorps anti-CD3 et CD28 entraîne une inhibition des lymphocytes T effecteurs CD8 positifs de manière dépendante de la dose. En effet, lorsque les lymphocytes T effecteurs CD8 positifs sont cultivés en co-culture avec des lymphocytes T régulateurs chroniques à un ratio de un pour un, la prolifération des lymphocytes T effecteurs CD8 positifs est significativement inhibée. La production d'interféron gamma par les cellules effectrices CD8 positives est également significativement inhibée lorsque ces dernières sont cultivées en co-culture avec des lymphocytes T régulateurs activés provenant de souris chroniquement infectées, par rapport à une co-culture avec des lymphocytes T régulateurs au repos provenant de souris naïves.Nous avons constaté que cette technique peut être réalisée en 80 heures si elle est effectuée correctement. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser immédiatement après leur isolement des cellules T régulatrices fraîchement isolées. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine pour explorer la fonction des cellules T régulatrices dans une maladie inflammatoire chronique.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place une procédure de suppression in vitro des lymphocytes T régulateurs, en utilisant un système de co-culture de lymphocytes T régulateurs et de lymphocytes T répondeurs.

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