Entièrement automatisé centrifuge microfluidique Dispositif pour Ultrasensitive Protein Détection de sang total

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer la sensibilité de détection de l’ELISA à l’aide de nanofibres filées naturelles. Cette vidéo montre comment atteindre la sensibilité de détection femtomolaire des protéines dans 10 microlitres d’échantillons de sang total en 30 minutes. Dans une plate-forme de laboratoire sur disque, la force centrifuge est utilisée pour transférer le liquide à travers les chambres, et l’ensemble du processus est entièrement automatisé.

La sensibilité de détection pourrait être fortement améliorée par l’intégration de nanofibres. Cependant, le problème était que la nanofibre est très fragile et difficile à manipuler. Dans cette vidéo, nous présentons un processus simple pour fixer des tapis fragiles en nanofibres de dioxyde de titane sur un disque en plastique.

Pour fabriquer des tapis de nanofibres de dioxyde de titane sur un substrat de silicone par électrofilage, le substrat de silicone est d’abord silanisé, recouvert de PDMS et prédurci. Un tapis en nanofibres est ensuite transféré sur ce PDMS prédurci et ce produit est poinçonné pour produire une pièce circulaire à fixer. Enduire la chambre de réaction d’une goutte de PDMS comme adhésif et fixer la pièce circulaire au fond de la chambre.

Ensuite, durcissez le PDMS au four. Enfin, assemblez les couches de disques en un seul appareil complet pour ELISA. Cette technique de transfert de nanofibres nous permet d’utiliser la grande surface des nanofibres pour la bioanalyse.

Le dispositif microphylitique centrifuge offre l’intégration et l’automatisation complètes de tous les processus requis dans l’ELISA. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes est qu’elle pourrait détecter les concentrations femtomolaires de protéines à partir de seulement 10 microlitres de sang total. Préparez les solutions de précurseurs comme décrit dans le protocole d’essai ci-joint.

Ensuite, chargez la solution dans l’électrospinner et fabriquez les nanofibres par électrofilage, en utilisant les conditions optimales. Lorsque les tapis en nanofibres polymères sont préparés, faites-les calciner dans un four sous vide. Après calcination, les tapis de nanofibres de dioxyde de titane sont enfin préparés.

Préparez la mise en page microphylitique à l’aide d’un logiciel de conception 3D tel que SOLIDWORKS, et transférez la conception sur la fraiseuse CNC. Utiliser la fraiseuse CNC pour fabriquer le disque avec des canaux et des chambres. Le disque et le tapis en nanofibres sont maintenant prêts à être intégrés.

Préparez une chambre à vide, un substrat en silicone et du fluorosilane. Silaniser le substrat de silicone avec du fluorosilane sous vide pendant 30 minutes. Préparez le PDMS invité en préparant le prépolymère avec un agent de durcissement dans un rapport de 10 pour un, et faites tourner l’enrobage sur le substrat de silicone silanisé à 650 tr/min pendant 60 secondes

Faites durcir le PDMS enduit sur la plaquette silanisée à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes pour la rendre adhésive. Transférez maintenant ces tapis en nanofibres sur le silicone enduit de PDMS en appliquant une pression appropriée à l’aide d’un objet plat tel qu’une lame de verre. Faites cuire l’échantillon à 80 degrés Celsius pendant une heure pour durcir complètement l’adhésif PDMS.

Versez quelques gouttes d’éthanol sur les tapis de nanofibres fixés sur la couche PDMS et faites un trou de six millimètres de diamètre à l’aide d’un PunchIt. Ensuite, décollez les tapis en nanofibres perforés fixés sur le PDMS du substrat en silicone. Ensuite, enduisez la chambre de réaction de liaison dans le disque avec environ 20 microlitres de mélange PDMS et placez les nanofibres attachées sur le PDMS dans les chambres.

Ensuite, incubez le disque intégré du tapis en nanofibres à 80 degrés Celsius pendant une heure. Préparer une solution de GPDES à 1 % en volume dans de l’éthanol. Ensuite, traitez les nanofibres du disque avec du plasma d’oxygène.

Distribuez 100 microlitres de solution GPDES sur chaque tapis en nanofibres et incubez à température ambiante pendant deux heures dans un récipient scellé. Après l’incubation, retirez la solution GPDES en tapotant le disque sur un essuie-glace. Lavez à l’éthanol, retirez-le et faites-le cuire à 80 degrés Celsius pendant une heure.

Après la cuisson, laver à l’éthanol et tapoter pour retirer. Répétez ce processus et séchez-le avec un jet d’azote. Pour l’immobilisation des anticorps, distribuez une solution d’anticorps capturés diluée.

Conservez les disques dans une chambre humidifiée et incubez à 37 degrés pendant quatre heures. Lavez le reste de la solution avec un tampon de lavage. Maintenant, assemblez le disque à l’aide d’un ruban adhésif double face.

Appliquez une pression raisonnable pour assembler les couches en un disque complet. Remplissez les chambres de réaction de liaison avec un tampon de blocage et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez deux fois avec un tampon de lavage et conservez le disque à 40 degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Chargez les réactifs, les tampons de lavage et 10 microlitres de sang total dans les chambres de réactifs et d’échantillons. Placez le disque dans une machine de visualisation personnalisée pour un immunodosage automatisé. Le système de visualisation contient un rotor connecté à un ordinateur pour le fonctionnement automatisé du disque, ainsi qu’une lumière stroboscopique et une caméra CCD pour la prise d’images.

Faites tourner le disque à 3 600 tr/min pendant 60 secondes pour séparer les globules rouges. Mélangez le plasma avec les anticorps de détection. Transférez le mélange dans la chambre de réaction intégrée avec un tapis de nanofibres de dioxyde de titane.

Après l’immunoréaction, lavez les nanofibres en transférant le tampon de lavage dans la chambre de réaction. Ensuite, transférez la solution de substrat chimiluminescent dans la chambre de réaction de liaison et incubez en mode de mélange pendant une minute. Enfin, transférez la solution de substrat réagi dans la chambre de détection.

Lorsque toute la réaction est terminée, transférez le disque dans un système de détection et lisez le signal chimiluminescent à l’aide d’un logiciel personnalisé. Le fonctionnement du disque et le système de détection peuvent être intégrés dans une seule plate-forme. En optimisant la tension et le fluorate, des tapis de nanofibres uniformes ont été obtenus, comme le montre cette image MEB.

Afin d’optimiser le temps de durcissement du PDMS, la force d’adhérence a été mesurée. S’il était trop court, le tapis en nanofibres était intégré dans le PDMS ou décollé s’il était trop long. Après optimisation, le tapis en nanofibres a ensuite été fixé de manière stable sur le PDMS.

La gamme linéaire de détection de la protéine C-réactive à partir de deux plateformes est illustrée dans ce graphique. En utilisant le laboratoire d’intégrité des nanofibres sur le disque, nous avons pu obtenir une sensibilité de détection très améliorée de la protéine C-réactive à partir de seulement 10 microlitres de sérum en 30 minutes. Les technologies actuellement disponibles, telles que l’ELISA sur plaque à 96 puits, nécessitent un volume d’échantillon plus important et un temps de détection plus long.

Dans l’ensemble, l’ELISA à base de disque intégré aux nanofibres a montré une large plage dynamique de six ordres de grandeur avec une limite de détection de six femtomoles de protéine C-réactive. Cette sensibilité de détection, aidée par la grande surface fournie par les nanofibres intégrées dans le disque, dépassait celle de l’ELISA conventionnel, qui était limité à 2 000 femtomoles. Après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que vous avez une bonne compréhension de la préparation d’un dispositif microphylitique centrifuge, de l’intégration de nanofibres de phase et de la détection de protéines à l’aide d’ELISA.

Cette technique peut être utile pour détecter des protéines faiblement liées dans une très petite quantité d’échantillons biologiques.