Name: Entièrement automatisé centrifuge microfluidique Dispositif pour Ultrasensitive Protein Détection de sang total (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Découvrez une méthode ELISA automatisée sur lab-on-a-disc utilisant des nanofibres de dioxyde de titane pour détecter des protéines à sensibilité femtomolaire dans 10 µL de sang total en 30 minutes.

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Ce travail a été soutenu par le National Research Foundation de Corée (NRF) subventions (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), une subvention de la Korean Health Technology R &amp; D Project, Ministère de la Santé et Bien-être (A121994) et IBS-R020-D1 financé par le gouvernement coréen.

REMARQUE: On prélève du sang d&#39;individus sains et a été recueilli dans un tube de collecte de sang. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de tous les bénévoles. 1. Fabrication de TiO 2 Mat NF <ol><li> Préparation de la solution de précurseur 22 <ol><li> Dissoudre 1,5 g de tétraisopropylate de titane (TTIP) dans un mélange d&#39;éthanol (99,9%, 3 ml) et de l&#39;acide acétique glacial (3 ml) et mélanger la solution à la température ambiante (25 ° C) pendant 30 min sur un agitateur magnétique. </li><li> Dissoudre 11% en poids de polyvinylpyrrolidone (PVP) dans 3,64 g d&#39;éthanol (99,9%) et agiter la solution à 65 ° C pendant 1 heure en utilisant un agitateur magnétique à plaque chauffante. </li><li> Combiner et mélanger les deux solutions à 65 ° C pendant 4 heures sur un agitateur magnétique à plaque chauffante. </li></ol></li><li> électrofilage <ol><li> Chargez la solution préparée dans une seringue reliée à une aiguille de 200 um Diame intérieure en acier inoxydableter. Verser la solution directement dans la seringue après le retrait du piston. </li><li> Introduire la solution constamment à un débit de 0,3 ml / h pendant 10 min sur une tranche de silicium (2 cm x 2 cm) placées sur un substrat mis à la terre à une tension continue élevée (15 kV). Au cours de l&#39;électrofilage, régler la distance entre l&#39;aiguille et le substrat à la terre à 10 cm. </li></ol></li><li> Calcination du tapis NF <ol><li> Placer le tapis NF dans un four et à augmenter la température jusqu&#39;à 500 ° C avec une vitesse de montée en puissance de 3 ° C / min dans des conditions de haut vide (5 x 10 -5 Torr). </li><li> Maintenir la température à 500 ° C pendant 3 h. Refroidir la température des échantillons à la température ambiante (25 ° C) dans le four. </li></ol></li></ol> 2. Intégration de TiO 2 Mat NF dans un centrifuge microfluidique Disc <ol><li> Fabrication d&#39;un disque <ol><li> Utilisez le logiciel de conception 3D (par exemple, SolidWorks ou similaire) pour dépeindre les chambres, canaux ou soupapes de chaque couche de disque. Convertir les fichiers de conception à commande numérique par ordinateur (CNC) en utilisant le code de génération de code logiciel (par exemple, Edgecam ou similaire). Utilisez les logiciels selon le manuel d&#39; instruction 23,24 Note:. Les dimensions typiques des canaux utilisés dans ce dispositif sont de 1,0 mm x 0,3 mm (largeur x profondeur). </li><li> Ouvrez le logiciel d&#39;exploitation de la machine de fraisage CNC (par ex., DeskCNC ou similaire) et charger le code CNC pour le logiciel d&#39;exploitation et cliquez sur les éléments suivants dans l&#39;ordre: &quot;AUTO&quot; -&gt; &quot;G CODE OPEN&quot; -&gt; Sélectionnez le code CNC généré. </li><li> Fixez la plaque de PC sur la machine de fraisage CNC: utiliser 1 plaques mm PC pour la couche supérieure et des plaques de PC de 5 mm pour la couche de disque. Exécutez la machine de fraisage CNC pour couper chaque couche du disque en cliquant sur le bouton &quot;START&quot;. </li></ol></li><li> Transfert de TiO 2 mat NF sur le disque<ol><li> Placer un substrat de silicium et une petite boîte de Pétri contenant 40 ul de (tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl) -1-trichlorosilane dans une chambre à vide sous vide pendant 30 min. Fluorosilane se vaporise et enduit sur le substrat. </li><li> Mélanger les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) de pré-polymère avec un agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 et dégazer dans une chambre à vide. Spin-coat les PDMS sur un substrat de silicium à 650 rpm pendant 60 secondes. </li><li> Durcir les PDMS revêtus sur un substrat de silicium dans un four à 65 ° C pendant 10 minutes pour atteindre un état adhérent. NOTE: Le durcissement du temps peut varier en fonction des conditions environnementales, et la force d&#39;adhérence peut être testée par un test d&#39;adhérence à l&#39;aide d&#39;un rhéomètre. </li><li> Transférez le tapis TiO 2 NF préparé par électrofilage et calcination sur le silicium PDMS revêtu en utilisant une pince à épiler. Ensuite, appliquer manuellement une pression conformationnelle sur le TiO 2 mat NF transféré avec un objet plat (par exemple., Lame de verre) et retirer l&#39;objet. Mettrecet échantillon dans le four à 65 ° C pendant 4 heures ou à 80 ° C pendant 1 heure pour faire durcir la couche de PDMS complètement. </li><li> Manteau de liaison des chambres de réaction dans le disque avec 20 ul du / de mélange de l&#39; agent de durcissement PDMS (10: 1), qui agit comme une couche adhésive pour fixer le TiO 2 mat NF sur le disque. </li><li> Distribuer 50 pi d&#39;éthanol (99,9%) sur le tapis TiO 2 NF sur la couche PDMS, couper le tapis NF avec un trou de perforation de 6 mm de diamètre, et transférer la coupe TiO 2 mat NF aux chambres de réaction de liaison revêtues de 20 pl du PDMS à l&#39;étape précédente. NOTE: Dans cette étape, l&#39; éthanol sera utile pour détacher la coupe TiO 2 mat NF du substrat Si. </li><li> Incuber le TiO 2 mat NF disque intégré dans le four à 65 ° C pendant 4 heures ou à 80 ° C pendant 1 heure pour guérir les PDMS complètement. </li></ol></li><li> La modification de surface du tapis de TiO 2 sur le disque NF <ol><li> PRepare solution à 1% v / v de (3-glycidoxypropyl) silane méthyldiéthoxy (GPDES) dans l&#39;éthanol (99,9%). </li><li> Traiter le disque intégré TiO 2 mat NF avec un plasma d&#39;oxygène à 140 W, débit d&#39;oxygène de 50 sccm pendant 180 sec. Distribuer 100 pl de solution GPDES sur chaque tapis de nanofibres et laisser incuber à la température ambiante (25 ° C) pendant 2 heures. </li><li> Laver les substrats brièvement en distribuant de l&#39;éthanol (99,9%) en utilisant une bouteille de lavage, puis retirer l&#39;éthanol complètement en inversant le disque et il buvard contre un propre lingette. Cure à 80 ° C pendant 1 heure. Laver deux fois avec de l&#39;éthanol (99,9%) de la même manière que celle indiquée ci-dessus, pour éliminer les physiquement adsorbées et non liée GPDES molécules. </li><li> Séchez avec un courant d&#39;azote sec sous vide. REMARQUE: Le disque peut être stocké dans un récipient fermé à la température ambiante (25 ° C) jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Immobilisation d&#39;anticorps sur la surface <ol><li> Préparer une solution de 200 ug / ml d&#39;anticorps de capture (anticorps monoclonal de souris anti-hsCRP humain ou de souris monoclonal anti-cTnI) en diluant les anticorps avec un tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4). Distribuer 5 ul de la solution sur chaque tapis NF dans un disque à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Voir la liste des matériaux pour plus d&#39;informations sur les anticorps. </li><li> Maintenir les disques dans une chambre humidifiée et incuber à 37 ° C pendant 4 heures. Laver les anticorps revêtus mat NF avec un tampon BSA-PBS 0,1%. Remplir la chambre avec 100 pi de tampon de lavage à l&#39;aide d&#39;une micropipette, retirez le tampon par aspiration ou par décantation. Enfin, inverser le disque et épongez contre un nettoyage lingette, puis assembler le disque. </li></ol></li><li> Ensemble de disque <ol><li> Dessinez la conception du disque sur un ruban adhésif double face en utilisant un programme de CAO (par exemple, AutoCAD ou similaire). Chargez le dessin CAO au traceur de découpe. </li><li> Couper le ruban adhésif double face en utilisant le traceur de découpe. Décoller une couche de protection de ruban adhésif double et fixer it au-dessus de la couche de disque. Décoller l&#39;autre couche de protection et fixer la couche supérieure sur la couche du disque. </li><li> Chargez le disque préalablement assemblé dans la machine de pressage et d&#39;aligner précisément les couches supérieure / adhésives / disque à l&#39;aide des marques d&#39;alignement dans chaque couche pour connecter chaque vanne, le canal, et les chambres. Appliquer une pression conformationnelle en utilisant la machine de pressage. </li></ol></li></ol> 3. Immunoassay <ol><li> Remplir les chambres avec du tampon BSA-PBS à 1% en utilisant une micro-pipette et laisser incuber le disque à 37 ° C pendant 1 heure. Retirer le tampon par aspiration à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Effectuez cette étape pour bloquer les sites ayant pas réagi et de réduire l&#39;adsorption non-spécifique de la protéine dans un disque. </li><li> Laver deux fois avec 0,1% de BSA-PBS et en remplissant les chambres d&#39;aspiration en utilisant une micropipette. Remarque: À ce stade, le disque peut être stocké à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Charge 10 pi de sang total de l&#39;antigène enrichi ou sans sérum CRP-pour la détection de la CRP sur le disque en utilisant un micropipette. Pour effectuer les graphiques d&#39;étalonnage, en utilisant des concentrations de CRP de 1 pg / ml à 100 ng / ml; et cTnI de 10 pg / ml à 100 ng / ml. NOTE: En raison des niveaux plus élevés de CRP dans le sang total, qui est habituellement dans la gamme uM, sans sérum CRP a été utilisée pour démontrer la faible limite de détection de l&#39;appareil. </li><li> Faire tourner le disque à 3 600 tours par minute (391 x g) pendant 60 secondes pour séparer les globules rouges. </li><li> vanne ouverte n ° 1 par une irradiation laser, et un transfert de 4 pi du surnageant de plasma dans la chambre contenant 8 pi de détection d&#39;anticorps conjugués à la HRP en faisant tourner le disque à 2400 tours par minute pendant 3 secondes. NOTE:. Les processus généraux d&#39;actionnement de la vanne et la visualisation de fonctionnement du disque sont décrits en détail dans un précédent rapport 21 </li><li> Appliquer un mode de mélange (1, 15 ° de la 15 s Hz) pendant 5 secondes pour la liaison des anticorps de la protéine et de détection. </li><li> Ouvrez la vanne n ° 2, et transférer le mélange préparé à l&#39;étape 6 à la chambre de réaction de liaison (2400 rpm, 3 sec). Ensuite, appliquer un mode de mélange (1, 2 ° C de 60 Hz) pendant 20 minutes pour réaliser une réaction immunologique entre le mélange et les anticorps se liant sur ​​le TiO2 FNs. Après la réaction, la vanne ouverte n ° 3 et transférer le mélange résiduel dans la chambre de déchets (2400 rpm, 10 secondes). </li><li> Transférer le tampon de lavage (600 pi) à la chambre de réaction de liaison en ouvrant la vanne 4 et faire tourner le disque (2400 tpm, 4 secondes). Ensuite , appliquez un mode de mélange (-1, 30 ° de la de 30 Hz) pendant 120 secondes pour se laver les TiO 2 FNs dans la chambre. </li><li> Laver les TiO 2 FNs deux fois en suivant même état ​​de l&#39; étape 3.8, et retirer le tampon de lavage résiduel complètement en faisant tourner le disque à 2400 rpm pendant 20 sec. Ensuite, fermez le robinet # 5. </li><li> Pour la réaction de chimiluminescence, appliquer un mode de mélange (1, 2 ° C de 30 Hz) pendant 1 min après le transfert de la solution de substrat chimioluminescent dans la chambre de réaction de liaison en ouvrant la vanne 6 et le filagele disque à 2400 rpm pendant 10 secondes par la suite. </li><li> Transférer la solution de substrat ayant réagi à la chambre de détection en ouvrant la vanne 7 et faire tourner le disque à 2400 tpm pendant 10 secondes. </li><li> Mesurer les signaux de chimioluminescence de la solution de substrat ayant réagi en utilisant un tube photomultiplicateur (PMT), le module de système de détection équipé. NOTE: Le système de détection est une machine construite sur mesure en utilisant les éléments suivants: moteur pas à pas, les composants mécaniques, les stades de la traduction, et disponible dans le commerce PMT. Les parties optomécaniques et moteur pas à pas sont assemblés pour maintenir le dispositif, et le moteur peut tourner le disque. La détection est réalisée par VPM fixe sur les pièces mécaniques, et il est situé au-dessus des chambres de détection du dispositif. En manipulant le moteur pas à pas, les chambres de détection sont alignés à droite en dessous de la zone de détection du TRE. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le dosage de TiO 2 NF disque intégré est une technique rapide, économique et pratique pour la détection ultrasensible de faible abondance des protéines présentes dans un volume très faible de sang. Cette technique présente l&#39;avantage d&#39;utiliser des volumes d&#39;échantillons de petite taille (10 pi) et se prête à l&#39;analyse de plusieurs échantillons simultanément. Cela fournit un grand potentiel en tant que dispositif de multiplexage de dosage immunologique. Le dispositif a l&#39;avantage qu&#39;il...

Plusieurs plates - formes pour le diagnostic de la maladie ont été élaborés à base de matériaux à l&#39; échelle nanométrique 1,2 tels que des nanofils, 3 nanoparticules, 4 nanotubes, 5 et nanofibres (SNF) 6-8. Ces nanomatériaux offrent d&#39;excellentes perspectives dans la conception de nouvelles technologies pour les essais biologiques très sensibles en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques. Par exemple, les nanofibres d&#39;oxyde de zinc mésoporeuse ont été utilisées pour la femtoseconde molaire détection sensible des marqueurs biologiques du cancer du sein. 9 Récemment, des nanomatériaux à base de dioxyde de titane (TiO 2) ont été étudiées pour des applications bioanalytiques 10 compte tenu de leur stabilité chimique, 11 négligeable dénaturation des protéines 12 et de la biocompatibilité. 13 En outre, les groupes hydroxyle sur la surface de TiO 2 faciliter la modification chimique et la liaison covalente de biomolécules. 14,15 modelée TiO2 thin films 16 ou 17 nanotubes de TiO 2 ont été utilisés pour améliorer la sensibilité de la détection d&#39;une protéine cible en augmentant la zone de surface; Cependant, le procédé de fabrication est relativement complexe et nécessite un équipement coûteux. D&#39;autre part, FNs électrofilées bénéficient d&#39;une attention en raison de leur grande surface ainsi que processus simple et la fabrication à faible coût; 18,19 encore, la caractéristique fragile ou lâche du électrofilés TiO 2 mat NF rend difficile à manipuler et intégrer avec des dispositifs microfluidiques. 6,20 par conséquent, les TiO 2 tapis NF ont rarement été utilisés dans des applications bioanalytiques, en particulier celles qui nécessitent des conditions de lavage difficiles. Dans cette étude, pour surmonter ces limitations, nous avons développé une nouvelle technologie pour le transfert du électrofilés NF Tapis sur la surface d&#39;un substrat cible en utilisant un polydiméthylsiloxane mince (PDMS) couche adhésive. Furthermore, nous avons démontré avec succès l&#39;intégration de électrofilée TiO2 NF mats sur un dispositif microfluidique centrifuge en polycarbonate (PC). En utilisant ce dispositif, une détection de haute sensibilité, entièrement automatisé et intégré de la protéine C-réactive (CRP), ainsi que la troponine I cardiaque (cTnI) a été réalisée dans les 30 minutes à partir de seulement 10 pi de sang total. 21 En raison de la combinaison avantages des propriétés de la FN et la plate-forme centrifuge, l&#39;essai ont montré une large plage dynamique de six ordres de grandeur de 1 pg / ml (~ 8 fM) à 100 ng / ml (~ 0,8 pM) avec une limite inférieure de détection de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) pour CRP et une gamme dynamique de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) à 100 ng / ml (~ 4 nM) avec une limite de détection de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) pour cTnI. Ces limites de détection sont ~ 300 et ~ 20 fois plus faible par rapport à leurs résultats ELISA classiques correspondants. Cette technique pourrait être appliquée à la détection de toutes les protéines cibles, avec des anticorps appropriés. Dans l&#39;ensemble, cette coopération de l&#39;appareilULD contribuent grandement au diagnostic in vitro et des essais biochimiques , car il peut détecter des quantités rares de protéines cibles avec une grande sensibilité même de très petites quantités d&#39;échantillons biologiques, par exemple, 10 pl de sang total. Bien que nous ne démontré la détection des protéines sériques par ELISA dans cette étude, la technologie de transfert et l&#39;intégration des électrofilés FNs avec des dispositifs microfluidiques pourrait être appliquée plus largement dans d&#39;autres réactions biochimiques qui nécessitent une grande surface pour une sensibilité de détection élevée.

<table><tbody><tr><td>Plaquette Si</td><td>LG SILTRON</td><td>Plaquette polie, qualité d’essai</td><td>Dia. (mm) = 150, orientation = < 100>, dopant = bore, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, épaisseur (&mu ; m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>Polycarbonate (PC)&nbsp ;</td><td>Daedong Plastic</td><td>PCS#6900</td><td>Épaisseur (mm) = 1 et 5&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tétraisopropoxyde de titane, 98 %,</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1 300 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS et agent de durcissement</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>J T Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM</td><td></td></tr><tr><td>Spectroscopie photoélectronique à rayons X</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alpha</td><td></td></tr> Machine <tr><td>de modélisation 3D</td><td>M& I CNC Lab, Corée</td><td></td><td>Fraiseuse CNC</td></tr><tr><td>Machine de distribution de cire</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Corée</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td> personnalisé <td>FLEXcon, USA</td><td>DFM 200 clair 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>Traceur de découpe</td><td>Graphtec Corporation, Japon</td><td>Graphtec CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>Four (calcination)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>Rhéomètre (Tack test)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp ; III - ORM Package</td><td></td></tr><tr><td>Système plasma d’oxygène</td><td>FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti-humaine hsCRP</td><td>Hytest Ltd., Finlande</td><td>4C28</td><td>(clone # C5)</td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti-cTnI</td><td>Hytest Ltd., Finlande</td><td>4T21</td><td>(clone # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP chèvre conjuguée polyclonale anti-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP souris monoclonale anti-cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td><td>(clone # 16A11)</td></tr><tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco Inc</td><td>E404</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement sanguin</td><td>Tube</td> de prélèvement BD <td>367844</td><td>K2 EDTA 7,2 mg plus < sang > Tube collecteur</td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA femto</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques multi-étiquettes modulaire</td><td>Perkin Elmer</td><td>Envision 2104</td><td></td></tr><tr><td>Machine d’opération de disque</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Corée</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube photomultiplicateur personnalisé (PMT)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>Version 2012</td><td>Logiciel de</td></tr><tr><td>conception Logiciel de CAO 3D SolidWorks&nbsp ;</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Version 2013</td><td>Logiciel de conception 3D,</td></tr> <tr>logiciel <td>Edgecam</td><td>Vero</td><td>version 2009.01.06928</td><td>Logiciel de génération de code</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>version 2.0.2.18</td><td>Logiciel de la fraiseuse CNC</td></tr></tbody></table>

entièrement automatisé centrifuge microfluidique dispositif pour ultrasensitive protein détection de sang total

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Le test immuno-enzymatique (ELISA) est une méthode prometteuse pour détecter de petites quantités de protéines dans des échantillons biologiques. Les dispositifs offrant une plate-forme permettant de réduire le volume d’échantillons et le temps de dosage, ainsi qu’une automatisation complète, sont nécessaires pour une utilisation potentielle dans le diagnostic sur le lieu d’intervention. Récemment, nous avons démontré la détection ultrasensible des protéines sériques, de la protéine C-réactive (CRP) et de la troponine cardiaque I (cTnI), en utilisant un laboratoire sur disque composé de tapis nanofibreux (NF) de TiO2. Il a montré une large plage dynamique avec une sensibilité de détection femtomolaire (fM), à partir d’un petit volume de sang total en 30 min. L’appareil se compose de plusieurs composants automatisés pour la séparation du sang, le dosage, le mélange et le lavage pour une sensibilité accrue à partir de faibles volumes d’échantillons. Ici, dans la démonstration vidéo, nous montrons les protocoles expérimentaux et le savoir-faire pour la fabrication des NF ainsi que du disque, leur intégration et le fonctionnement dans l’ordre suivant : procédés de préparation du tapis TiO2 NF ; impression par transfert de TiO2 NF mat sur le disque ; modification de surface pour les réactions immunitaires, l’assemblage et le fonctionnement des disques ; Détection sur disque et résultats représentatifs pour l’immunoessai. L’utilisation de cet appareil permet une analyse multiplexée avec une consommation minimale d’échantillons et de réactifs. Compte tenu des avantages, le dispositif devrait être utilisé dans une grande variété d’applications et s’avérer bénéfique pour faciliter l’analyse de protéines peu abondantes.

En utilisant ce protocole, un dispositif microfluidique centrifuge entièrement automatisé pour la détection des protéines du sang entier avec une sensibilité élevée a été préparé. Les TiO 2 tapis NF ont été préparés par des procédés de électrofilage et calcination. Afin de fabriquer le FNs de diamètre désiré, la morphologie et l&#39;épaisseur, des conditions telles que le débit, la tension et le temps filer électrofilage ont été optimisés. Lorsque les conditions ne sont pas op...

Ce protocole démontre comment atteindre la sensibilité de détection femtomolaire des protéines dans 10 μL de sang total en 30 min. Cela peut être réalisé en utilisant des tapis nanofibreux électrofilés intégrés dans un laboratoire sur disque, qui offrent une grande surface ainsi qu’un mixage et un lavage efficaces pour un meilleur rapport signal/bruit.

Entièrement automatisé centrifuge microfluidique Dispositif pour Ultrasensitive Protein Détection de sang total

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer la sensibilité de détection de l’ELISA à l’aide de nanofibres filées naturelles. Cette vidéo montre comment atteindre la sensibilité de détection femtomolaire des protéines dans 10 microlitres d’échantillons de sang total en 30 minutes. Dans une plate-forme de laboratoire sur disque, la force centrifuge est utilisée pour transférer le liquide à travers les chambres, et l’ensemble du processus est entièrement automatisé.La sensibilité de détection pourrait être fortement améliorée par l’intégration de nanofibres. Cependant, le problème était que la nanofibre est très fragile et difficile à manipuler. Dans cette vidéo, nous présentons un processus simple pour fixer des tapis fragiles en nanofibres de dioxyde de titane sur un disque en plastique.Pour fabriquer des tapis de nanofibres de dioxyde de titane sur un substrat de silicone par électrofilage, le substrat de silicone est d’abord silanisé, recouvert de PDMS et prédurci. Un tapis en nanofibres est ensuite transféré sur ce PDMS prédurci et ce produit est poinçonné pour produire une pièce circulaire à fixer. Enduire la chambre de réaction d’une goutte de PDMS comme adhésif et fixer la pièce circulaire au fond de la chambre.Ensuite, durcissez le PDMS au four. Enfin, assemblez les couches de disques en un seul appareil complet pour ELISA. Cette technique de transfert de nanofibres nous permet d’utiliser la grande surface des nanofibres pour la bioanalyse.Le dispositif microphylitique centrifuge offre l’intégration et l’automatisation complètes de tous les processus requis dans l’ELISA. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes est qu’elle pourrait détecter les concentrations femtomolaires de protéines à partir de seulement 10 microlitres de sang total. Préparez les solutions de précurseurs comme décrit dans le protocole d’essai ci-joint.Ensuite, chargez la solution dans l’électrospinner et fabriquez les nanofibres par électrofilage, en utilisant les conditions optimales. Lorsque les tapis en nanofibres polymères sont préparés, faites-les calciner dans un four sous vide. Après calcination, les tapis de nanofibres de dioxyde de titane sont enfin préparés.Préparez la mise en page microphylitique à l’aide d’un logiciel de conception 3D tel que SOLIDWORKS, et transférez la conception sur la fraiseuse CNC. Utiliser la fraiseuse CNC pour fabriquer le disque avec des canaux et des chambres. Le disque et le tapis en nanofibres sont maintenant prêts à être intégrés.Préparez une chambre à vide, un substrat en silicone et du fluorosilane. Silaniser le substrat de silicone avec du fluorosilane sous vide pendant 30 minutes. Préparez le PDMS invité en préparant le prépolymère avec un agent de durcissement dans un rapport de 10 pour un, et faites tourner l’enrobage sur le substrat de silicone silanisé à 650 tr/min pendant 60 secondesFaites durcir le PDMS enduit sur la plaquette silanisée à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes pour la rendre adhésive. Transférez maintenant ces tapis en nanofibres sur le silicone enduit de PDMS en appliquant une pression appropriée à l’aide d’un objet plat tel qu’une lame de verre. Faites cuire l’échantillon à 80 degrés Celsius pendant une heure pour durcir complètement l’adhésif PDMS.Versez quelques gouttes d’éthanol sur les tapis de nanofibres fixés sur la couche PDMS et faites un trou de six millimètres de diamètre à l’aide d’un PunchIt. Ensuite, décollez les tapis en nanofibres perforés fixés sur le PDMS du substrat en silicone. Ensuite, enduisez la chambre de réaction de liaison dans le disque avec environ 20 microlitres de mélange PDMS et placez les nanofibres attachées sur le PDMS dans les chambres.Ensuite, incubez le disque intégré du tapis en nanofibres à 80 degrés Celsius pendant une heure. Préparer une solution de GPDES à 1 % en volume dans de l’éthanol. Ensuite, traitez les nanofibres du disque avec du plasma d’oxygène.Distribuez 100 microlitres de solution GPDES sur chaque tapis en nanofibres et incubez à température ambiante pendant deux heures dans un récipient scellé. Après l’incubation, retirez la solution GPDES en tapotant le disque sur un essuie-glace. Lavez à l’éthanol, retirez-le et faites-le cuire à 80 degrés Celsius pendant une heure.Après la cuisson, laver à l’éthanol et tapoter pour retirer. Répétez ce processus et séchez-le avec un jet d’azote. Pour l’immobilisation des anticorps, distribuez une solution d’anticorps capturés diluée.Conservez les disques dans une chambre humidifiée et incubez à 37 degrés pendant quatre heures. Lavez le reste de la solution avec un tampon de lavage. Maintenant, assemblez le disque à l’aide d’un ruban adhésif double face.Appliquez une pression raisonnable pour assembler les couches en un disque complet. Remplissez les chambres de réaction de liaison avec un tampon de blocage et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez deux fois avec un tampon de lavage et conservez le disque à 40 degrés Celsius jusqu’à utilisation.Chargez les réactifs, les tampons de lavage et 10 microlitres de sang total dans les chambres de réactifs et d’échantillons. Placez le disque dans une machine de visualisation personnalisée pour un immunodosage automatisé. Le système de visualisation contient un rotor connecté à un ordinateur pour le fonctionnement automatisé du disque, ainsi qu’une lumière stroboscopique et une caméra CCD pour la prise d’images.Faites tourner le disque à 3 600 tr/min pendant 60 secondes pour séparer les globules rouges. Mélangez le plasma avec les anticorps de détection. Transférez le mélange dans la chambre de réaction intégrée avec un tapis de nanofibres de dioxyde de titane.Après l’immunoréaction, lavez les nanofibres en transférant le tampon de lavage dans la chambre de réaction. Ensuite, transférez la solution de substrat chimiluminescent dans la chambre de réaction de liaison et incubez en mode de mélange pendant une minute. Enfin, transférez la solution de substrat réagi dans la chambre de détection.Lorsque toute la réaction est terminée, transférez le disque dans un système de détection et lisez le signal chimiluminescent à l’aide d’un logiciel personnalisé. Le fonctionnement du disque et le système de détection peuvent être intégrés dans une seule plate-forme. En optimisant la tension et le fluorate, des tapis de nanofibres uniformes ont été obtenus, comme le montre cette image MEB.Afin d’optimiser le temps de durcissement du PDMS, la force d’adhérence a été mesurée. S’il était trop court, le tapis en nanofibres était intégré dans le PDMS ou décollé s’il était trop long. Après optimisation, le tapis en nanofibres a ensuite été fixé de manière stable sur le PDMS.La gamme linéaire de détection de la protéine C-réactive à partir de deux plateformes est illustrée dans ce graphique. En utilisant le laboratoire d’intégrité des nanofibres sur le disque, nous avons pu obtenir une sensibilité de détection très améliorée de la protéine C-réactive à partir de seulement 10 microlitres de sérum en 30 minutes. Les technologies actuellement disponibles, telles que l’ELISA sur plaque à 96 puits, nécessitent un volume d’échantillon plus important et un temps de détection plus long.Dans l’ensemble, l’ELISA à base de disque intégré aux nanofibres a montré une large plage dynamique de six ordres de grandeur avec une limite de détection de six femtomoles de protéine C-réactive. Cette sensibilité de détection, aidée par la grande surface fournie par les nanofibres intégrées dans le disque, dépassait celle de l’ELISA conventionnel, qui était limité à 2 000 femtomoles. Après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que vous avez une bonne compréhension de la préparation d’un dispositif microphylitique centrifuge, de l’intégration de nanofibres de phase et de la détection de protéines à l’aide d’ELISA.Cette technique peut être utile pour détecter des protéines faiblement liées dans une très petite quantité d’échantillons biologiques.

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