Name: Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules endothéliales hémogéniques embryonnaires murines par cytométrie en flux. Cette méthode FACS permet d'obtenir des cellules viables pour l'étude de l'hématopoïèse et la recherche sur les cellules souches.

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

<ol><li>Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelium+during+development+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelium during development and beyond.</a> Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).</li>
<li>Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+hematopoietic+potential+of+side+population+cells+throughout+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development.</a> Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).</li>
<li>Nakano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemogenic+endocardium+contributes+to+transient+definitive+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis.</a> Nat Commun. 4, 1564(2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+head+as+a+site+for+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li>
<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
<li>de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoietic+stem+cells+first+develop+within+the+major+arterial+regions+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo.</a> Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).</li>
<li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li>
<li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-Kit%2C+Notch+signaling%2C+and+p27-mediated+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li>
<li>Tavian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta-associated+CD34%2B+hematopoietic+cells+in+the+early+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo.</a> Blood. 87 (1), 67-72 (1996).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).</li>
<li>Kelly, M. A., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Hierarchy+Regulating+Human+Endothelial+Cell+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Takahashi, M., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+method+of+rodent+whole+embryo+culture+using+the+rotator-type+bottle+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+hierarchy+downstream+of+retinoic+acid+that+independently+regulates+vascular+remodeling+and+endothelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation.</a> Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).</li>
<li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%3A+a+B+cell-specific+member+of+the+T200+glycoprotein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li>
<li>Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Ly-6G+on+myeloid+lineage+cells+in+mouse+bone+marrow.+RB6-8C5+mAb+to+granulocyte-differentiation+antigen+%28Gr-1%29+detects+members+of+the+Ly-6+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family.</a> J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).</li>
<li>Kina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoclonal+antibody+TER-119+recognizes+a+molecule+associated+with+glycophorin+A+and+specifically+marks+the+late+stages+of+murine+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage.</a> British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).</li>
<li>Jackson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+ischemic+cardiac+muscle+and+vascular+endothelium+by+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells.</a> J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).</li>
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<li>Gomez Perdiguero,, E,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
</ol>

Ce travail a été soutenu byNIH subventions HL128064, HL096360, EB017103 et CT Innovations accordent 15 RMB-YALE-04, à KKH, et NICHD / NIH T32HD007094.

Il reste de nombreuses questions sans réponse dans le domaine du développement hematovascular - un domaine qui est encore à ses débuts en raison des difficultés techniques inhérentes à l&#39;étude des populations cellulaires transitoires et petits qui émergent seulement pendant des périodes de développement spécifiques. Les techniques décrites ci-dessus améliorent beaucoup de ces difficultés en permettant l&#39;isolement des cellules, même simples à partir de la cellule endothéliale hemogenic et populations HSPC dans les tissus embryonnaires à des moments critiques du développement en utilisant des réactifs et du matériel qui sont généralement disponibles dans la plupart des laboratoires. Notre protocole permet également l&#39;isolement parallèle de non-hemogenic fractions de cellules endothéliales de la YS et AGM, qui peuvent être utilisées pour des analyses indépendantes, soit en tant que témoins pour la fraction de cellules endothéliales hemogenic dans les analyses ultérieures. Un point clé dans l&#39;isolement des cellules endothéliales hemogenic utilisant cette méthode à base de FACS-multicolor est co spectrale appropriéempensation et dessin précis des portes d&#39;une seule couleur. En tant que tel, il est fortement recommandé que les contrôles de couleur simple unstained et être inclus dans tous les essais expérimentaux, et qu&#39;ils - ainsi que des échantillons traités avec des anticorps de contrôle isotype - être utilisé pour établir d&#39;abord une compensation spectrale appropriée et le dessin des portes. Cependant, la coloration non spécifique est minime par ce protocole, donc les contrôles non colorées et une seule couleur sont suffisantes pour la vérification de routine des portes une fois les paramètres de trieur FACS ont été optimisés. portes SP inexactement tirées sont une préoccupation particulière à l&#39;approche décrite dans le présent rapport. Des études antérieures ont montré que des cellules souches multipotentes présentent efflux préférentielle de Hoechst rouge 17, formant la base physiologique de leur apparition dans le PS par FACS. Nous avons montré que les cellules endothéliales hemogenic et HSPC se trouvent de même au sein de la fraction de cellules SP 5,11. Des médicaments tels que le canal de calciumhibitor vérapamil bloquer ce comportement colorant Hoechst efflux dans des cellules SP par l&#39;intermédiaire d&#39;un blocage d&#39;une variété de transporteurs transmembranaires multirésistantes de résistance. Dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, cela se produit principalement par le transporteur ABCG2 / BCRP1 24. Typiquement induit vérapamil&gt; 50% blocage de la SP, cependant, le degré global de Hoechst efflux et son blocage ultérieur par vérapamil vu a été montré pour être affecté par le calendrier de développement, probablement en raison de changer l&#39;expression de types de transporteurs multirésistantes multiple avec différentiel Hoechst la capacité d&#39;efflux, et la sensibilité à Verapamil 5. Ainsi, il est fortement recommandé que le vérapamil-traité Hoechst teinté contrôle négatif être en standard inclus pour assurer gating SP bon: si une porte de SP est bien établi, une réduction notable du nombre de cellules SP doit être détecté dans des échantillons colorés avec Hoechst en la présence de vérapamil. Nous avons précédemment montré que triéCellules SP du sac E9.5 murin de jaune d&#39;œuf ont ~ 80-90 fois plus grande capacité à générer HSPC dans une culture hématopoïétique à base de méthylcellulose, par rapport à un nombre adapté de E9.5 non fractionnée, non Hoechst colorées des cellules de tissu YS ensemble 5. Une caractérisation plus poussée du PS a montré que dans la vésicule ombilicale de souris pendant hématopoïétique précoce et le développement vasculaire à E8.0, il y a expression appréciable de la VE-cadhérine et Flk-1, mais une faible expression de tige (c-Kit) et des marqueurs hématopoïétiques (CD45). Ainsi, à ce point de temps de développement, primordiale (non hemogenic) CE, définie comme étant Flk-1 + / CD31 + / CD45- des cellules non SP prédominent. Ce profil d&#39;expression des changements que l&#39; expression du marqueur endothélial diminue et CD45 et c-Kit expression augmente, concomitante avec une capacité croissante à générer HSPC in vitro entre E9.5 et E11.5 5. Ceci suggère une activité hématopoïétique de tissu YS est contenu dans le SP, devenant ainsi la plus apparente entre E9.5 et E11.5, et se déclareraitment par une perte temporisée des caractéristiques endothéliales et l&#39;acquisition progressive de la capacité hématopoïétique. En tant que tel, l&#39; expression des transporteurs de multirésistance qui donnent naissance au phénotype SP sont un élément important marqueur phénotypique de l&#39; endothélium hemogenic 5; en fait, les cellules non-SP de l&#39;AGA ne présentent pas de sang potentiel de formation 12. Ainsi, l&#39;isolement réussi de la SP par coloration de Hoechst dans les deux YS et AGA en sorte que les cellules seront triées de hématopoïétique compartiment des cellules souches d&#39;un tissu donné, et après la coloration d&#39;anticorps de cellules au sein de cette fraction permettant la discrimination de l&#39;hemogenic (Flk -1 + / c-kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populations 5,11,12. En outre, il a été noté précédemment que CD41 + cellules du SP du sac vitellin et les tissus AGM sont capables de former des colonies de lignées multiples dans de la méthylcellulose culture à base 11,12. Nous définissons les cellules endothéliales hemogenic comme Flk1 + c-Kit + cellules CD45- SPs en utilisant CD45 comme marqueur désigné de la lignée hématopoïétique plutôt que CD41 donné notre constatation que l&#39; expression de Flk1 et CD45 est pratiquement mutuellement exclusifs 5,11. Cela permet à un pur isolement de cellules au sein de la SP qui ont tous deux endothéliale (Flk-1) et la tige caractéristiques (c-Kit) nécessaires à l&#39;endothélium de transition hématopoïétique mais qui n&#39;ont pas encore fait l&#39;objet de ce changement, tel que déterminé par l&#39;absence de CD45 dans ces cellules. Il serait utile d&#39;envisager de sous-fractionnement de la population HSPC, définie comme cellules Flk-1- / c-Kit + / CD45 + / SP, en CSF1R + (de macrophage tissulaire) et Csf1r- (HSC) fraction récemment rapporté par Gomez et ses collègues 25, car cela offrirait une plus grande résolution de la véritable HSPC contre les populations macrophage tissulaire progénitrices, mais cela ne devrait pas affecter l&#39;intégrité de la fraction des cellules endothéliales hemogenic dont l&#39; isolement , nous avons décrit depuis CSF1R est un marqueur de progéniteurs macrophage 26. Hemogles cellules endothéliales ENIC sont une sous-population rare dans les deux YS et AGM (comprenant: 1 - 3% des cellules endothéliales), et donc un défi majeur dans leur étude est le rendement cellulaire insuffisante pour des applications ultérieures. Ce protocole se traduit généralement par 70-80% des cellules restantes viables au moment du tri, et une sorte de cellule typique hemogenic endothéliales à partir de tissus obtenus à partir de mises en commun plusieurs embryons peut donner seulement quelques centaines de cellules, même dans des conditions optimales avec seulement 10-20% des cellules incorporées dans des colonies produisant de méthylcellulose récupérées. Afin de maximiser le nombre de cellules triées, il est fortement recommandé que les enquêteurs prennent des mesures pour assurer le tissu et la viabilité des cellules à travers toutes les étapes de la procédure: les tissus doivent être disséqués rapidement et mis en commun, et les échantillons doivent être conservés dans la glace chaque fois que possible. Les échantillons doivent être préparées immédiatement avant tri FACS, et triées dans des tubes de collecte contenant le contenu sérique élevé, ou directement dans la culture de la méthylcellulose comme décritd ci-dessus. Si des problèmes de viabilité persistent, les tubes de prélèvement peuvent également être pré-revêtues avec du sérum pour améliorer encore la survie des cellules triées. Si le rendement des cellules endothéliales hemogenic reste faible, de l&#39;os adulte disponibles dans le commerce des perles de fluorophores conjugués moelle osseuse ou peuvent être utilisés pour une compensation spectrale au lieu des commandes de couleur unique dérivées du tissu embryonnaire décrits ici. Si les cellules triées sont destinés à la culture, les cellules endothéliales hemogenic et HSPC doivent être triés directement dans des puits de culture de tissu. Si les cellules triées sont destinées à l&#39;ADN ou le gène analyse de l&#39;expression liée à l&#39;ARN, les cellules endothéliales et non hemogenic hemogenic et HSPC peuvent être triés directement dans les tubes de prélèvement contenant des échantillons de tampon de lyse pour réduire la perte cellulaire. La technique décrite permet de succès (et simultanée) l&#39;isolement des cellules endothéliales et non hemogenic hemogenic, ainsi que HSPC et de cellules sanguines matures à partir des mêmes fractions des tissus embryonnaires. Cette approche permet en outre study des fondements moléculaires des transitions critiques qui se produisent comme les cellules endothéliales produisent du sang. Enseignements tirés de ces études sur le développement peuvent ensuite être utilisées pour optimiser la génération de cellules endothéliales humaines et de HSPC hemogenic descendance de pluripotentes et potentiellement autologue, des cellules souches pour le traitement des troubles hématopoïétiques courants.

Un système de circulation fonctionnelle requiert le développement parallèle des vaisseaux sanguins et des cellules sanguines. Aux premiers stades du développement de sang (hématopoïèse primitive), l&#39;origine des érythroblastes reste débattue vigoureusement 1. En revanche, à des stades ultérieurs du développement des cellules sanguines (hématopoïèse définitive), il est devenu de plus en plus clair que multi-lignage HSPC proviennent de cellules spécialisées vasculaires endothéliales qui acquièrent hématopoïétiques (cellules hemogenic endothéliales) potentiels dans le sac vitellin, le placenta, et AGM 2-5, ainsi que dans la vitelline et vaisseaux ombilicaux, l&#39;endocarde embryonnaire 6, et la tête vasculature 7. La spécification des cellules endothéliales hemogenic au sein de ces tissus distincts se produit à des stades spécifiques du développement; par exemple, dans la vésicule ombilicale à ~ E8.25 et dans l&#39;assemblée générale annuelle à ~ E10 8-12. Néanmoins, même au cours de ces fenêtres de développement spécifiques, la population de endo hemogeniccellules thelial représente une petite fraction de toutes les cellules endothéliales (1 - 3% du sac vitellin et les cellules endothéliales AGM) 11,12. Le processus de la cellule &quot;spécification&quot; endothéliale hemogenic est critique pour murin, ainsi que l&#39;homme, de l&#39;hématopoïèse. Les cellules hématopoïétiques ont été représentés à bourgeonner à partir de l&#39;endothélium des vaisseaux du sac vitellin et l&#39;aorte d&#39;embryons humains 13 et plusieurs laboratoires ont montré que la production de cellules sanguines à partir de cellules souches pluripotentes humaines exige une cellule endothéliale intermédiaire 14-16. Ainsi, la définition du phénotype des cellules endothéliales murines hemogenic et la compréhension des événements moléculaires qui mènent à leur développement dans ce modèle animal devrait faciliter la poursuite des technologies in vitro pour la production de cellules endothéliales hemogenic à partir de cellules souches pluripotentes humaines. À son tour, le développement éventuel d&#39;une approche pour la production à grande échelle de types de cellules sanguines différenciées de multi-lignée HSPC - se derived à partir de cellules souches pluripotentes humaines par l&#39;intermédiaire d&#39;une cellule endothéliale hemogenic physiologiquement pertinente intermédiaire - aurait un potentiel thérapeutique incroyable pour hématologique, oncologique et la médecine régénérative. Pour atteindre cet objectif, nous avons défini le phénotype des cellules endothéliales hemogenic, à un niveau clonal, dans le jaune murin sac 11 et AGM 12, deux sites majeurs de production HSPC définitive au cours de l&#39; embryogenèse. Comme HSPC dans les adultes de la moelle osseuse 17, les cellules endothéliales hemogenic embryonnaires et HSPC exposition Hoechst propriétés colorant d&#39;efflux et donc apparaître dans la «population de côté» (SP) des cellules sur un terrain FACS 5,11,12 (comme le montre la figure 3). En outre, nous avons également montré que les cellules endothéliales hemogenic expriment des marqueurs des deux endothéliales et les cellules souches (et Flk1 CKIT, respectivement), mais n&#39;expriment le marqueur de lignée hématopoïétique CD45 5,11,12. Ainsi, les cellules endothéliales hemogenic peuvent être identified et isolés par FACS comme cellules Flk1 + / cKit + / CD45- SP, et nous avons montré que ces cellules donnent naissance à des HSPC contenu dans la / cKit + / CD45 + SP fraction Flk1- du sac vitellin et les cellules AGM 5,11,12. Les cellules endothéliales Hemogenic et HSPC peuvent être identifiés et isolés du sac jaune ou tissus AGM récoltées à partir soit des embryons fraîchement euthanasiés, ou à partir d&#39; embryons cultivés pendant 48 heures en culture ex vivo de l&#39; embryon (comme représenté sur la figure 1). La culture ex vivo permet sélective pré-traitement des embryons individuels avec des agents pharmacologiques, et permet également l&#39; expression transitoire de transgènes souhaités ( par exemple, par transduction lentivirale). l&#39;identification FACS des cellules endothéliales et hemogenic HSPC par le procédé décrit ici peut être utilisé comme une mesure quantitative du développement hématopoïétique définitif dans des modèles murins génétiquement modifiés; les cellules peuvent également être récupérées pour des applications expérimentales ultérieures, y compris le sang-foessais rmer, analyse de l&#39;expression, et la transplantation. Matières animales: Usages et considérations éthiques Un nombre croissant d&#39;études a établi la contribution importante des cellules endothéliales hemogenic à la formation HSPC pendant la phase de l&#39;hématopoïèse définitive du développement embryonnaire. Pourtant, les conditions physiologiques et des signaux qui favorisent la spécification d&#39;une sous - population de cellules endothéliales vers un destin hemogenic restent mal connus, et donc ne peuvent pas encore être imitées dans un cadre in vitro. En effet, les techniques décrites dans le présent document sont actuellement utilisées par notre laboratoire et d&#39; autres groupes afin d&#39; améliorer la compréhension du domaine du développement hematovascular, telles qu&#39;une approche pour la spécification des cellules ex vivo hemogenic endothéliales et la production HSPC pourrait être développé un jour. Jusqu&#39;à ce moment, cependant, le champ reste dépendant de tissus primaires de type sauvage (et gène) des embryons de souris tiquement modifiés pour obtenir spécifiées cellules endothéliales hemogenic et HSPC pour une étude plus approfondie. Les cellules endothéliales Hemogenic et HSPC peuvent être identifiés de façon fiable et isolés soit E8.5 (10 - 12 paires de somites) jaune sac ou E10.5 (35 - 40 paires de somites) AGM 11,12. En raison de la rareté relative des cellules endothéliales hemogenic (représentant typiquement 1 - 3% du nombre total de cellules endothéliales 11,12 au sein de ces tissus) , la mise en commun des tissus provenant de multiples (~ 8 - 10) littermates dans un seul échantillon est fortement recommandé afin de obtenir suffisamment de cellules pour une expérimentation ultérieure. Vérifier que les cellules endothéliales et hemogenic HSPC ont été identifiés et isolés avec succès peut être réalisée par culture de cellules récupérées dans des conditions qui induisent la différenciation hématopoïétique. Dans ces conditions, les cellules endothéliales et hemogenic HSPC présenteront une différenciation hématopoïétique lignées multiples, ce qui entraîne l&#39;apparition de colonies contenant eryprogéniteurs Throid (BFU-E), granulocytes et de macrophages progéniteurs (CFU-GM), et granulocytes, érythrocytes, macrophage, colonies de mégacaryocytes progénitrices (CFU-GEMM).

<table><tbody><tr><td>DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophénacétyl)-L-alanyl]-S-phénylglycine t-butyle ester)</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td>IRRITANT TOXIQUE : Porter des lunettes de protection, un masque et des gants lors de la manipulation.</td></tr><tr><td>Sous-coussin absorbant</td><td>Covidien</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pince droite</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux droits de 8,5 cm</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothésie)</td><td>Henry Schein&nbsp ;</td><td>50033</td><td>INHALANT TOXIQUE : Utiliser dans la hotte.</td></tr><tr><td>100x Pénicilline Streptomycine Glutamine (10 000 U/ml de Pénicilline, 10 000 mg/ml de Streptomycine, 29,2 mg/ml de L-glutamine)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase de type II</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &#956 ; M passoire à cellules en nylon</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris CD31 - PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris Flk-1 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>561259</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trichlorhydrate)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td>TOXIQUE : irritant. Portez des lunettes de protection et des gants lors de la manipulation. Préparer une solution mère de 25 mg/ml dans du H2O distillé, stocker les aliquotes à -20 &#176 ; C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vérapamil</td><td>Sigma</td><td>1711202&nbsp ;</td><td>TOXIQUE : irritant. Portez des lunettes de protection, un masque et des gants lors de la manipulation. &nbsp ; Préparer une solution mère de 5 mM (100x) dans de l’éthanol à 95 %. Stocker à -20 &#176 ; C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi&nbsp ;</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre à cellules Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>Décongélation et aliquote selon les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>Teinture Giemsa modifiée</td><td>Sigma</td><td>GS500</td><td>TOXIQUE : Contient du méthanol - à utiliser dans la hotte et à porter des gants lors de la manipulation. Diluer dans de l’eau distillée jusqu’à une solution à 0,02 %.</td></tr><tr><td>Cytospin Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Clipped Funnel Starter Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120110</td><td>Comprend des cytofunnels, du papier filtre, des cytolames et des cytoclips à utiliser avec la centrifugeuse Cytospin</td></tr><tr><td>Anti-Mouse B-220 - FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Gr-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter-119-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (4,5 g/L)</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s Buffered Salt</td><td>Solution Life Technologies&nbsp ;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 24 puits enrobée de fibronectine</td><td>EMD Millipore</td><td>PIFB24P05</td><td></td></tr><tr><td>IgG2A-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>IgG2B-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>556923</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cellules embryonnaires murines hemogenic endothéliales

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

La spécification des cellules endothéliales hemogenic de l&#39;endothélium vasculaire embryonnaire se produit pendant de brèves périodes de développement dans les tissus distincts, et est nécessaire pour l&#39;émergence de HSPC définitive du sac murine supplémentaire embryonnaire jaune, le placenta, les vaisseaux ombilicaux, et l&#39;aorte-gonades-mésonéphros embryonnaires ( région AGM). La nature transitoire et la petite taille de cette population cellulaire rend son isolement reproductible pour la quantification soigneuse et des applications expérimentales techniquement difficile. Nous avons établi une cellule activé par fluorescence (FACS) protocole à base pour l&#39;isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC pendant leurs temps de génération de pointe dans le sac vitellin et AGM. Nous démontrons méthodes de dissection du sac vitellin et les tissus AGM à partir d&#39;embryons de souris, et nous présentons optimisés digestion des tissus et de conjugaison d&#39;anticorps conditions pour la survie cellulaire maximale avant l&#39;identification et la récupération via FACS. Représentant FACS anaparcelles de lyse sont présentés qui identifient la cellule endothéliale hemogenic et phénotypes HSPC, et décrivent un dosage à base de méthylcellulose pour évaluer leur sang potentiel de formation à un niveau clonal.

Étiquetage réussie des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de YS embryonnaires ou AGM donneront FACS scatter parcelles similaires aux parcelles représentatives présentées dans la figure 3. Après cellules vivantes standard et la discrimination doublet par l&#39; avant et la diffusion latérale (non représenté), la population de côté (SP) les événements sont visualisés dans un Hoechst Red vs. Hoechst terrain différentiel Bleu linéaire en l&#39;absence de vérapamil comme un &quot;épaule&quot; gauche décalée de la majorité des (non-SP) événements (Figure 3A). Lorsque la porte de la SP est correctement établi, les cellules SP représenteront environ 1-3% du nombre total de cellules viables et YS 3 - 5% du nombre total d&#39;événements AGM viables. Le traitement de vérapamil devrait aboutir à&gt; 50% d&#39; inhibition des événements SP indépendamment de la source tissulaire (figure 3A, les panneaux supérieurs). Nous avons déjà déterminé que d&#39;autres populations qui apparaissent en dehors de l&#39;épaule de SP, mais sont également bloqués par le vérapamil sont erythr Ter119 positifoblasts, et sont donc exclues de notre population SP 5. Par rapport à la SP, les cellules non-SP sont identifiées comme étant la grappe dense de cellules adjacentes à la SP &quot;épaulement&quot; (figure 3A). Cette population contient non-Hemogenic CE qui peut être distingué en utilisant un CD31-PE vs CD45-FITC fille parcelle (figure 3B), comme CD31 + / CD45- événements. Non-Hemogenic CE sont généralement 2-5% des cellules non-SP de AGM (figure 3B) ou jaune sac (non représenté), et un nombre élevé de ces cellules peuvent être triés en arrière avec une relative facilité. Pour l&#39; identification des HSPC et Hemogenic CE, portes filles sont tirées de la fraction de SP, l&#39; identification des cellules CD45 + et CD45-, où cellules CD45 + sont typiquement &lt;20% du nombre total d&#39; événements dans les deux AGM (figure 3C) ou YS (non représenté). Hemogenic CE sont ensuite identifié à partir de cellules CD45- dans un différentiel cKit-APC vs Flk1-PECy7 fille pbeaucoup comme des événements doubles positifs, et représentent généralement 1 à 3% des événements CD45- lorsqu&#39;il est isolé à partir soit AGM (Figure 3 D) ou YS (non représenté). HSPC sont identifiés à partir de la fraction CD45 + dans un cKit-APC séparée vs. Flk1-PECy7 terrain fille comme Flk1- / CKIT + cellules, et aussi représentent généralement environ 25 - 30% de la petite population de cellules CD45 + lorsqu&#39;ils sont obtenus à partir soit YS (non représenté) ou AGM (Figure 3 E). Ainsi, les deux Hemogenic CE et HSPC sont exceptionnellement rares (~ 0,01% des événements cellulaires totaux), et il est typique pour ce protocole pour revenir quelques centaines de chaque type de cellule, même lorsque le tissu à partir de plusieurs embryons sont mis en commun. Portes dans les parcelles filles devraient être établies en référence aux groupes témoins négatifs. Afin de faire la distinction entre coloration spécifique et non spécifique d&#39; anticorps, les portes doivent être initialement établis en référence à la fois les contrôles non marqués (Figure 3C) ainsi que des échantillons qui ont été traités avec (IgG2A IgG2b) ou de contrôle d&#39;isotype apparié par fluorescence conjugué (non représenté). Ce dernier contrôle a montré que la coloration non spécifique est minime par ce protocole, donc pendant que nous recommandons que les anticorps de contrôle isotype (par exemple., IgG2a-PE ou IgG2B-FITC) être initialement utilisés pour optimiser les réglages de trieur FACS et déterminer les limites de grille , nous constatons également que les contrôles sont non colorées suffisant pour vérifier les limites de grille et la qualité expérimentale pendant FACS de routine de tri. Si les portes sont bien dessinés, scatter positif minimal doit être observée dans des portes simples ou doubles-positifs lors de l&#39;enregistrement des contrôles ou non colorés isotype. Les cellules endothéliales Hemogenic de l&#39;AGA et HSPC subissent une différenciation hématopoïétique plus de 14 jours de culture dans de la méthylcellulose (figure 4A). La proportion relative des types de colonies typiquement observée dans cesles cultures dépendent de la source tissulaire. Les cellules endothéliales Hemogenic isolées à partir de tissus jaune de sac à E8.5-E9.5 donnent lieu à BFU-E, CFU-GM, et peu CFU-GEMM 5, tandis que les cellules endothéliales hemogenic isolées du E10.5 AGM donnent lieu à prédominance CFU -GEMM 12, bien que d&#39; autres lignées sont encore observées, comme le montre la figure 4B (panneau en haut à gauche). HSPC isolé à partir de E10.5 AGM donnent également lieu principalement à CFU-GEMM sur la culture dans de la méthylcellulose (figure 4B, le panneau supérieur du milieu), bien que ces cellules seront également se différencier en d&#39; autres types de colonies hématopoïétiques ainsi. Cellules endothéliales non-hemogenic (CD31 + / CD45- non PS) ont également été plaqué (figure 4B, en haut à droite). Ces cellules montrent pas de croissance hématopoïétique dans la culture au bout de 14 jours. Les dosages de la capacité hématopoïétique de types cellulaires marqueur de surface individuelles exprimant, y compris des cellules avec et sans expression d&#39;une hématopoïétiquend marqueurs endothéliaux CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41 et CD45 au sein de la fraction de SP de l&#39;AGM à E10.5 ont été effectuées et démontrer que l&#39;activité multi-lignage formant colonie dans le E10.5 AGM est restreint à CD31 +, VE-cadhérine +, c-Kit +, CD41 + et CD45 + SP 12 cellules. Fait intéressant, l&#39;activité des colonies formant a été noté dans les deux cellules Flk-1 + et Flk-1- SP, mais seulement des cellules Flk1 + c-Kit + CD45- SP a donné naissance à des colonies multi-lignée via une monocouche endothéliale intermédiaire caractérisé à la fois par &quot;pavé &quot;morphologie des cellules endothéliales (figure 4B, le panneau en bas à gauche) et par Dil-AcLDL absorption 12. En outre, l&#39; expression de c-Kit est nécessaire pour l&#39; activité hématopoïétique de cellules AGM SP 12. Bien qu&#39;il ait été montré que certains précurseurs myéloïdes présentent des caractéristiques morphologiques similaires par rapport à des cellules endothéliales hemogenic, les cellules progénitrices myéloïdes expriment CD45 et ne peut pas générer des colonies de lignées multiples <em&gt; in vitro. HSPC génèrent également des colonies multi-lignée, mais bien que ces cellules CD45, ils manquent de Flk-1 expression 12,23 et donner lieu à des amas de cellules arrondies sans monocouche endothéliale sous - jacente (figure 4B, le panneau en bas à droite). Par conséquent, la population nous définissons endothélium hemogenic (ou des cellules Flk-1 + / c-Kit + / CD45-SP) représentent des cellules endothéliales avec hématopoïétiques l&#39;expression du gène potentiel et robuste hematoendothelial, y compris GATA-1/2, LMO2, SCL / Tal-1, Runx-1, c-Kit, CD34, CD41 et CD45 11 qui sont distinctes de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, ainsi que leurs homologues des cellules endothéliales non-hemogenic. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig1.jpg" /> Figure 1. Dans l&#39; ensemble Workflow. En bref, les embryons sont retirés de barrages enceintes, et YS ou tissus AGM sont récoltés. Embryons peuvent éventuellement être cultivées pendant 2<html> 4-48 h ex vivo avant la récolte des tissus. YS ou des tissus prélevés AGM sont digérées à une suspension cellulaire unique, aliquoté dans des tubes de contrôle et de l&#39;échantillon, et on fait incuber en présence de colorant Hoechst et / ou des anticorps conjugués à fluorescence. Verapamil, un inhibiteur du canal calcium, est également utilisé pour générer un contrôle négatif essentiel pour la vérification de déclenchement précis de la fraction SP. les cellules endothéliales Hemogenic sont identifiés par FACS comme Flk1 + / cKit + / CD45- des cellules SP, tandis que HSPC sont contenus dans la fraction Flk1- / cKit + / CD45 + SP de cellules; les deux types de cellules sont triées sur méthylcellulose pour la confirmation d&#39;un potentiel hemogenic. En outre, les cellules endothéliales non-hemogenic peuvent être victimes de discrimination (et récupérés, si on le souhaite) que CD31 + / CD45- cellules non-SP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> igure 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Dissection de YS et AGM Tissues. A) Le YS est disséquée à partir d&#39; embryons E8.5, et placé tout dans stérile HBSS + pour la suite digestion. B) Le tronc d&#39;embryons E10.5 est isolé en effectuant des coupes horizontales ci - dessous les deux membres antérieurs et postérieurs bourgeons. L&#39;AGA est ensuite séparé des bourgeons des membres et des pinces de tissus en utilisant ventrales. C) images Bright-terrain montrent la dissection des deux YS et AGM à partir d&#39; un embryon E10.5 (échelle = 1 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig3.jpg" /> Figure 3. Emplacements représentatifs Démontrant Porte hiérarchie pour discriminationde Hemogenic cellules endothéliales s (Flk1 + / CKIT + / Les cellules CD45- SP), HSPC (Flk1- / CKIT + / Les cellules CD45 + SP), et les cellules endothéliales non-hemogenic (CD31 + / CD45- non-SP) par FACS de E8.5 YS ou E10.5 AGM. Après cellule et doublet discrimination en direct de cellules provenant soit YS (panneaux de gauche) ou AGM (panneaux de droite) par l&#39; avant et la diffusion latérale (non représenté), A) la population latérale (SP) porte est établi et vérifié par une diminution significative de la fraction SP dans le contrôle négatif traité vérapamil. La population non-SP est identifié comme étant le cluster dense de cellules adjacentes à la SP. Dans chacune des parcelles présentées 20.000 événements sont affichés B) , les cellules endothéliales non hemogenic sont identifiées comme étant des cellules CD31 + / CD45- au sein de la fraction non-SP et représentent 2. - 5% de cellules non-SP , qu&#39;ils soient obtenus à partir de AGM (représentés ) ou YS (non représenté). Pour dISCRIMINATE Hemogenic CE ou HSPC, C) portes filles sont tirées de la fraction de SP pour identifier CD45 + et CD45- cellules. D) Pour l&#39; identification des cellules endothéliales hemogenic soit de AGM (illustré) ou YS (non représenté), portes filles supplémentaires sont tirées de la fraction CD45- distinguer CKIT cellules + (vs. cKit-) et Flk1 + (vs. Flk1-). Hemogenic CE soit YS ou AGM sont généralement environ 1 - 3% des événements CD45- E) HSPC sont identifiés à partir de la CD45 + fraction comme cKit + et Flk1-, et représentent généralement 20 -. 30% de CD45 + cellules si triées de AGM (représenté ) ou YS (non représenté). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig4.jpg" /> Figure 4 Visualisation de Différenciation Hématopoïétique suivante Culture de Hemogenic cellules endothéliales et HSPC sur méthylcellulose. A) forment des colonies de cellules individuelles triées dans les 7 jours de placage sur méthylcellulose. Multi-lignage potentiel hématopoïétique peut être confirmée par l&#39; observation de plusieurs types de colonies hématopoïétiques, identifié par l&#39; évaluation des morphologies de colonies distinctes 11. B) Phase d&#39;imagerie microscopique trié CE hemogenic et HSPC de AGM (ou YS, non représenté) montrent multi-lignée hématopoïétique la formation de colonies au bout de 7 jours de culture en milieu de culture méthylcellulose. Non-hemogenic CE AGM (ou YS, non représenté) ne démontrent pas la croissance dans ces conditions. A plus fort grossissement, les cellules adhérentes avec la morphologie des cellules endothéliales classique &quot;pavé&quot; (flèche blanche) peut être vu donnant lieu à des amas de cellules hématopoïétiques en cultures de hemogenic CE; pas de telles cellules endothéliales sont observées dans des cultures de tri HSPC (échelle = 100 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l&#39;isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules endothéliales hématogènes primaires à partir de tissus embryonnaires murins par tri cellulaire activé par fluorescence. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre l'isolement fiable et spécifique de cellules endothéliales hématogènes viables à partir de tissus hématopoïétiques embryonnaires. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour des analyses et des cultures ultérieures.Les cellules endothéliales hématogènes ainsi que les cellules souches hématopoïétiques et leurs progéniteurs qui peuvent être isolées à l’aide de cette méthode seront ensuite utilisées pour aider à répondre à des questions essentielles concernant la régulation de leur développement et de leur fonction. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés à identifier la population latérale de cellules comprenant les cellules endothéliales hématogènes ainsi que les cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques. La dissection du tissu embryonnaire et les procédures de balayage seront démontrées par Kat Marcelo, ancienne étudiante diplômée de mon laboratoire.Ainsi qu'Emily Grits, une chercheuse clinique actuelle, et Jen Fang, une post-doctorante actuelle. Commencez par nettoyer toutes les surfaces de travail avec de l'éthanol à 70 % et placez un tapis absorbant sous la paillasse du laboratoire.Ensuite, placer un rat euthanasié en position dorsale sur le coussin inférieur et vaporiser abondamment la région abdominale inférieure avec de l'éthanol à 70 %. Réaliser une longue incision horizontale perpendiculaire à la ligne médiane de la paroi abdominale inférieure. Puis effectuer deux autres incisions horizontales d'un pouce chacune, s'étendant respectivement vers le haut et vers le bas à partir du point médian de l'incision horizontale initiale.Ensuite, disséquer la paroi abdominale afin d'exposer complètement les cornes utérines droite et gauche contenant les multiples embryons en gestation. À l’aide de pinces, saisir l’une des deux cornes utérines et utiliser des ciseaux et des pinces pour détacher l’utérus du myomètre environnant. Puis transférer les deux cornes dans une plaque de culture tissulaire stérile en polystyrène de 60 millimètres placée sur de la glace.Placer la plaque sous un microscope stéréo standard et utiliser la pince pour séparer chaque unité placentaire fœtale. Pour chaque unité, disséquer la couche musculaire de chaque poche utérine afin de mettre au jour la poche gestationnelle et la décidua sous-jacentes. Pour isoler le sac vitellin, retirer délicatement autant de tissu que possible de la poche entourant l'embryon inclus.Retirer le reste du tissu du sac vitellin de l'embryon proprement dit à l'origine embryonnaire des vaisseaux vitellins, si nécessaire. Pour isoler la région aorte-gonade-mésonephros (AGM), sectionner l'embryon sous le cœur et les membres antérieurs, puis éliminer la région thoracique et la tête. Ensuite, sectionner l'embryon juste sous les membres postérieurs, puis retirer et éliminer le tissu de la queue.Ensuite, retirez les membres postérieurs et les tissus ventraux excédentaires de la section restante contenant l'AGM. Au fur et à mesure que chaque sac vitellin ou AGM est récolté, regroupez les tissus embryonnaires dans des tubes de 1,5 millilitre contenant du HPSS+ placés sur de la glace. Pour obtenir une suspension monocellulaire, centrifugez le tissu embryonnaire et resuspendez le culot dans un millilitre de collagénase de type deux diluée dans du HPSS+. Incubez le tube pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Mélanger par retournement toutes les cinq minutes. À la fin de l'incubation, faire passer l'échantillon 10 fois à travers une pipette P1000 pour dissocier mécaniquement le tissu en douceur. Ensuite, centrifuger à nouveau l'échantillon, en resuspendant le culot dans un millilitre de HPSS+ froid. Filtrer ensuite l'échantillon à travers un tamis cellulaire de 70 microns et dénombrer les cellules.Après le décompte, récupérez les cellules par centrifugation. Resuspendez ensuite le culot dans du DMEM+ à 37 degrés Celsius à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre. Pour marquer les cellules en vue d'un tri FACS, prélevez au moins 100 microlitres de cellules en aliquots dans des tubes de 1,5 millilitre et ajoutez du vérapamil dilué dans de l'éthanol à 95 % dans le tube témoin « Hoechst uniquement + vérapamil » afin d'obtenir une concentration finale de 50 micromolaire.Placer tous les tubes à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter le Hoechst aux tubes témoins contenant uniquement le Hoechst et le Hoechst plus la vérapamil, ainsi qu'au tube d'échantillon, à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre, puis replacer les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure, à l'abri de la lumière, en mélangeant délicatement les tubes par retournement toutes les 15 minutes. À la fin de l'incubation, centrifuger tous les échantillons et diluer les culots à une concentration de 1 × 10⁵ cellules par millilitre dans du HPSS+ froid. Ajouter ensuite des anticorps marqués par un fluorochrome aux tubes témoins contenant uniquement les anticorps et au tube d'échantillon, à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre, pour une incubation de 30 minutes sur de la glace, à l'abri de la lumière.À la fin de l'incubation, centrifuger les échantillons et remettre en suspension les culots dans 500 microlitres de HPSS glacé. Filtrer les échantillons à l'aide des bouchons filtrants en maille des tubes FACS polystyrène de 5 millilitres à fond rond, puis placer les tubes sur de la glace à l'abri de la lumière. Analyser ensuite immédiatement les cellules par cytométrie en flux.Après la discrimination standard des cellules vivantes et des doublets par diffusion avant et latérale, les événements de la population latérale sont visualisés sur le diagramme de dispersion linéaire hoechst rouge contre hoechst bleu comme une bosse décalée vers la gauche par rapport aux événements de la population non latérale. Cette population latérale est significativement réduite après traitement par le vérapamil. Les cellules de la population non latérale sont identifiées comme l'amas dense de cellules adjacent à la population latérale.La fraction cellulaire non population latérale contient des cellules endothéliales non hémogéniques qui sont davantage distinguées en tant qu'événements CD31+CD45-. Afin d'identifier les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques ainsi que les cellules endothéliales hémogéniques, des fenêtres filles sont tracées à partir de la fraction de la population latérale, mettant en évidence les cellules CD45+ et CD45-. Les cellules endothéliales hémogéniques sont ensuite identifiées parmi les cellules CD45- sur un diagramme fille différentiel cKit versus Flk1 comme des événements doublement positifs.Les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques sont identifiées à partir de la fraction CD45+ dans un tracé fille distinct en tant que cellules Flk1-cKit+. À la suite de cette procédure, des cultures basées sur le méthylcellulose peuvent être mises en place afin d'évaluer fonctionnellement le potentiel hématopoïétique des cellules isolées, ou bien les cellules peuvent être traitées immédiatement pour des analyses d'expression génique et protéique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures environ si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir les échantillons protégés de la lumière et sur de la glace, sauf indication contraire, afin de maximiser la viabilité cellulaire. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la biologie vasculaire hématique d'explorer la spécification hémogène des cellules endothéliales et leur production de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques au cours du développement embryonnaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'isolement des cellules endothéliales hémogènes à partir de tissus embryonnaires murins par cytométrie en flux.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre comment les micro-dissection du sac vitellin et l'aorte-gonades-mésonéphros région à partir d'embryons et l'utilisation de cytométrie en flux à trier les cellules souches hématopoïétiques.

L&#39;isolement des premiers cellules souches hématopoïétiques de murin sac vitellin et AGA

Ici, nous décrivons un protocole pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales murines pulmonaires. Cette méthode comprend mécanicien et dissociation enzymatique du tissu pulmonaire ainsi que d'un processus de purification en 2 étapes utilisant des anticorps anti-PECAM-1 et anti-ICAM-2 anticorps conjugués à des billes magnétiques, ce qui produit une population de cellules endothéliales pures d'origine essentiellement microvasculaires.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

La culture de la cellule primaire est une technique utile pour l'analyse de populations spécifiques de cellules, en particulier à partir d'embryons de souris transgéniques à des stades spécifiques du développement. Ici, ventricules embryonnaires sont disséqués et dissociées, et des perles anticorps conjugués à reconnaître et séparer les cellules endothéliales pour une analyse ultérieure.

Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

La capacité d’isoler les cellules endothéliales valvulaires cardiaques (VEC) est essentielle pour comprendre les mécanismes de développement, de maintenance et de maladie des valves.  Nous décrivons ici l’isolement des VEC à partir de souris Tie2-GFP embryonnaires et adultes à l’aide de FACS qui permettra de réaliser des études déterminant la contribution des VEC dans les processus de développement et de maladie.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

La manipulation de l’expression temporelle des gènes dans les cellules souches embryonnaires (CSE) en différenciation peut être réalisée à l’aide de systèmes de gènes inductibles. Cependant, la génération de ces lignées cellulaires est coûteuse et prend du temps. Ce protocole permet l’expression rapide d’un transgène dans la différenciation des cellules dérivées de l’ES et l’analyse ultérieure de la différenciation hématopoïétique en aval.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) sont interconnectées par des protéines jonctionnelles spécifiques formant une barrière hautement régulée séparant le sang et le système nerveux central (SNC), ce que l’on appelle la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’isolement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales primaires murines, comme nous l’avons vu dans ce protocole, permet des études in vitro détaillées de la BHE.

Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes postnatales murines optimisées pour le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Ces cellules conviennent aux approches de séquençage de nouvelle génération.

Isolement de cellules endothéliales rétiniennes murines pour le séquençage de nouvelle génération

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

Cette étude a permis d’établir une méthode stable et efficace pour l’isolement, la culture et la détermination fonctionnelle des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire (CD34+ VW-SC). Cette méthode d’isolement facile à suivre et rapide peut être utilisée par d’autres chercheurs pour étudier les mécanismes potentiels impliqués dans les maladies cardiovasculaires.

Isolement immunomagnétique des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire chez la souris

Découvrez l'isolement des cellules endothéliales hémogéniques embryonnaires murines par cytométrie en flux. Cette méthode FACS permet d'obtenir des cellules viables pour l'étude de l'hématopoïèse et la recherche sur les cellules souches.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

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