Name: Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Découvrez une méthode pour évaluer l'adhérence de Staphylococcus aureus et Candida albicans sur des monocouches de cellules HeLa infectées par HSV. Cette technique permet d'étudier les interactions entre virus, bactéries et champignons.

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Ce projet a été soutenu par l’Université Midwest, l’Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) de l’Illinois et le Collège de médecine dentaire de l’Université Midwestern de l’Illinois (CDMI).

1. HSV Souches et Manipulation Note: Recombinant non-propagation de HSV-1 (KOS) gL86 et HSV-2 (KOS) 333gJ - avec l&#39; activité du rapporteur bêta-galactosidase utilisés ont été fournis par V. Twiari 36,37. <ol><li> Utiliser des virus à partir d&#39;un lot unique et stocker à -80 ° C, à un rapport 1: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 20% de sérum de fœtus bovin (FBS) et le lait écrémé jusqu&#39;à utilisation. Avant le stockage du lot viral, déterminer la concentration du virus par o - nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) dosage. </li><li> Déterminer la viabilité du virus et de la multiplicité d&#39;infection (MOI) par X-Gal coloration pour chaque série de test expérimental utilisant un test d&#39;entrée du virus de la reporter, comme décrit précédemment (Figure 1) 14. </li><li> Diluer virus (Opt-MEM) à MOI désiré. Fix monocouches (paraformaldéhyde; ainsi 0,5 ml /) avant la coloration. Placez les contrôles de viabilité du virus dans un microti séparéplaque de ter en parallèle avec des plaques d&#39;essai polymicrobienne. </li></ol> 2. HeLa 299 cellules Manipulation <ol><li> Croissance à 37 ° C, 5% de CO2 dans du DMEM avec 4,5 g / L de glucose, 10% de sérum fœtal bovin (FBS), de la gentamicine (50 pg / ml) et de L-glutamine inactivé par la chaleur. cellules Passage à 80% de confluence avec une solution de trypsine (acide éthylènediaminetétraacétique, 0,53 M EDTA, 0,05% de trypsine, 5 ml / flacon). </li></ol> 3. C. albicans Manutention Remarque: C. albicans obtenus à partir d&#39; une source de laboratoire clinique est stocké à -80 ° C dans Remmel lait écrémé 2x moyen. <ol><li> Culture gelé pâte sur Sabouraud Dextrose Medium (37 ° C). Après 24 heures sous - culture de la C. albicans sur le milieu Fungisel (37 ° C; 48 h) pour une utilisation. </li><li> Générer tube germinatif (GT) des formes (choisir colonies représentatives; 3 ml de FBS, 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Après incubation, laver GT (HBSS; 2x; 4000 g). Ajouter GT lavé pour réchauffé HBSS (37 &amp;# 176; C; 0,32 Abs 600). formes GT devraient être 99% des cellules observées tel que déterminé par le nombre de hémocytomètre. </li><li> Faire forme de levure (YF) actions suspensions en choisissant des colonies de Fungisel représentatives (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Comptez le nombre de formes YF / ml au microscope en utilisant un hémocytomètre. formes de YF devraient être 99% des cellules observées tel que déterminé par le nombre de hémocytomètre. </li><li> Faire stock de travail fongique (250 pi de GT ou YF stock en 25 ml de HBSS; 37 ° C; 10 5 UFC / ml) </li></ol> 4. S. aureus Manipulation <ol><li> Magasin S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel écrémé 2x lait). La culture sur de la gélose au sang de mouton (5%, 37 ° C; 24 h). Prélever des colonies représentatives et transfert à mannitol sels moyenne dans les 2 jours pour le stock (37 ° C; 18 h). </li><li> Faire S. aureus suspension stock (3 ml HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 UFC / ml) <ol><li> Faire S. travail aureus actions (100 pidu stock dans 25 ml de HBSS; 10 5 UFC / ml). </li></ol></li></ol> 5. Candida et S. aureus Suspensions <ol><li> Faire mixte C. albicans et S. aureus suspension (250 pl YF ou GT stock et 100 pi de S. aureus disponible dans 25 ml de HBSS). </li></ol> 6. polymicrobienne biofilm Assay <ol><li> Semences des plaques à 96 puits avec 200 pi de 2 x 10 5 cellules HeLa / ml (taux de confluence de 85%). Plaques de roche (30 - 45 min; 37 ° C) avant l&#39; incubation (37 ° C, 5% de CO 2 incubateur; 18 h). Monocouches Wash (1x; Opt-MEM) , puis ensemencer avec HSV (HSV-1 (KOS) gL86 ou HSV-2 (KOS) 33 gJ - dans 100 ul Opt-MEM; MOI 50 et 10). Incuber les plaques (3 h, 37 ° C; 5% CO 2). Utilisez une seule souche virale par jour. </li><li> Laver les monocouches infectées (1x; tampon phosphate salin (PBS) avec du Mg et du Ca 2 2; 100 ul). Remplacer PBS avec HBSS chaud laissant 25 &amp; #181; l dans chaque puits. <ol><li> Ajouter YF, GT et / ou S. Les suspensions aureus travail (100 ul; rapport cible cellulaire = 5: 1; n = 16). comme il est indiqué dans le tableau 1 Incuber les plaques (statiques; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2). </li></ol></li><li> Après incubation, aspirer une colonne à la fois le remplissage immédiatement avec 300 ul de PBS avec Mg +2 et Ca +2. Répétez cette étape deux fois, puis ajouter le tampon test lyse radio immunoprécipitation (RIPA, filtre stérilisé; 200 ul d&#39;une dilution au 1:50). </li><li> Rapidement triturer la cellule lysat HeLa puis placer 50 ul sur des sels de mannitol (MS) et / ou Fungisel (F) médias (figure 2). Passez le lysat en utilisant une tige coudée de verre à un angle de 90 °. Incuber les plaques (18 h à 37 ° C). compter manuellement le nombre de colonies par plaque. Les contrôles sont constitués de S. aureus et / ou C. albicans adhérence aux cellules HeLa HSV-non infectées. </li></ol> 7. Des études d&#39;imagerie &lt;/ P&gt; <ol><li> Laver chaque lamelle de verre ronde (12 mm, 50 ml d&#39;acétone dans bêcher de 100 ml). Sec et stériliser les lamelles (Kimwipes; boîtes de Pétri en verre). Placer les lamelles stériles secs dans les puits de plaques à 24 puits stériles, avec de l&#39;alcool flamme pinces stérilisées. </li><li> Ajouter des cellules HeLa (1 ml; volume de 5x utilisé pour plaques à 96 puits) dans les puits de plaques à 24 puits contenant des lamelles de verre rondes lavées stériles. Ajouter les virus, les bactéries et les champignons selon le modèle (tableau 2) à 5x le volume utilisé pour les plaques à 96 puits, puis incuber et procédé tel que décrit dans les étapes 6.2.1 à 6.4 ci - dessus. </li><li> Après le lavage final, fixer les cellules pour la microscopie en inondant la lame avec du methanol et en le laissant évaporer. Stocker les plaques à la température ambiante jusqu&#39;à ce que la coloration. </li><li> Pour la microscopie en champ clair (1,000x finale d&#39;agrandissement d&#39;origine) remplir les puits contenant des lamelles de méthanol fixe avec de l&#39;eau déminéralisée. Immédiatement aspirer l&#39;eau. Couvrir chaque lamelle avec du cristal violet Grams. Lavez lamelles de libre tache non liée (eau déminéralisée). Lamelles sèches in situ puis les adhèrent avec l&#39; ensemble de dureté moyenne à une diapositive marquée de montage (Figure 3). </li><li> Pour la microscopie (objectif 100x; 1,000x finale grossissement) fluorescent lavage exempt de lamelles de méthanol essentiellement comme décrit dans l&#39;étape 7.4. Sécher les lamelles dans les puits. <ol><li> Après séchage, enlever les lamelles et les placer sur des lames marquées. Puis ajouter une quantité suffisante de dilution de 1:20 isothiocyanate de fluorescéine (FITC) de l&#39;Herpès Simplex Virus Type 1 + 2 gD anticorps pour couvrir la lamelle couvre-objet (1 - 5 ul). </li><li> Incuber les lames dans une chambre d&#39;humidité à 37 ° C pendant 30 min. Après incubation, laver les lamelles en 4 changements de PBS. </li><li> Après le lavage final, le retour de la lamelle à la diapositive marquée. Tache avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, la chambre d&#39;humidité, 37 ° C pendant 30 minutes). Après incubation, laver les lamelles dans 4 changements de PBS, puis apposer sur la diapositive marquée avec jeu dur milieu de montage. </li><li> Laisser le milieu de montage durcir pendant 24 heures à température ambiante dans l&#39;obscurité. Examiner les lamelles sous l&#39;objectif du pétrole soit sur un microscope à fond clair ou microscope à fluorescence avec des filtres de coupure FITC et DAPI. Examiner les images d&#39;au moins 50 champs (100 cellules par organisme minimum) pour la co-localisation (Figure 4). </li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Actuellement , aucune information est disponible sur les interactions complexes entre permanent aux membres semi-permanents du microbiome hôte qui traversent plusieurs domaines taxonomiques, à savoir, procaryotes, eucaryotes et virales. Nous avons donc développé un roman dans le système de modèle in vitro pour étudier biofilm initiation par S. aureus et C. albicans sur le HSV-1 ou HSV-2 infectées HeLa 229 (38 HeLa). Le système de modèle de cellules HeLa présente un...

<html> Le microbiome humain comprend divers organismes provenant de plusieurs royaumes taxonomiques qui partagent des régions géographiques dans le corps. L&#39;adhésion à la surface des cellules est une première étape essentielle dans la formation de biofilm, qui fait partie du processus de colonisation microbiome. Inclus dans le microbiome peuvent être des virus qui causent des infections chroniques et persistantes. L&#39;infection chronique des cellules par ces virus peut provoquer une altération de la disponibilité du récepteur putatif. 1,2 En outre, l&#39; entrée de la cellule par des agents pathogènes intracellulaires pourrait également affecter la fluidité de la membrane hôte / hydrophobie qui à son tour peut modifier l&#39; attachement des autres membres du microbiome, y compris les bactéries et les champignons . Afin de comprendre les interactions qui peuvent se produire entre ces multiples agents pathogènes qui co-localisent dans les mêmes régions géographiques de l&#39;hôte humain, nous devons être en mesure d&#39;étudier l&#39;interaction des agents pathogènes qui représentent le spectre des royaumes taxonomiques présents à la surface de la muqueuse. t &quot;&gt; Le Herpesviridae sont une famille de microbes présents dans 100% des humains en tant que membres permanents du microbiome 3,4. En outre , ils peuvent également être constamment versé à la fois en présence et en l&#39; absence de symptômes. Plus précisément, l&#39; herpès simplex virus-1 et l&#39;herpès simplex virus 2 (HSV-1 et HSV-2, respectivement) sont membres permanents du microbiome dans le oronasopharynx et l&#39;appareil génital. chez les personnes immunocompétentes, HSV-1 et HSV-2 provoquent gingivostomatite, ainsi que herpès génital 5-8. sur ces sites, HSV provoque une infection latente caractérisée par une nécrose chronique persistante virale asymptomatique excrétion 9. entrée de HSV dans des cellules conduit à des altérations de l&#39; expression de surface de nectins, l&#39; héparane sulfate, les radeaux lipidiques et herpesvirus entrée médiateur / tumeur récepteur du facteur (HVEM / TNFR) 10-25. Ces récepteurs potentiellement représentent partagés pour certaines bactéries et les champignons, par exemple S. aureus et C. albicans, qui , bien que des agents pathogènes opportunistes,peuvent également résider en tant que membres du microbiome de la muqueuse de l&#39;oronasopharynx 26,27. Au sein de la oronasopharynx S. aureus et C. Albicans occupent deux sites distincts de la colonisation. Dans des hôtes avec des dents naturelles, la muqueuse buccale est partagée par le HSV-1 et C. albicans, tandis que les nares nasales antérieures sont occupées par S. aureus 28. Cependant, les résultats malgré in vitro que S. aureus adhère aux cellules épithéliales de la bouche, 29,30 S. aureus est rarement isolé à partir d&#39; échantillons oraux lorsque le tissu normal est présent 29,30. On sait peu concernant génitales niches voies co-colonisation au - delà des résultats cliniques que S. aureus est associé à la vaginite aérobie, caractérisée par une inflammation génitale, la décharge et la dyspareunie, tandis que C. Albicans produit des lésions des muqueuses semblables à celles observées dans la cavité buccale 31-35. Ainsi, bien que ces membres de la microbi orale et génitaleertains royaumes taxonomiques croisées peu est connu au sujet de leur interaction que son impact sur ​​leur capacité à initier la formation de biofilm par l&#39; adhésion à la surface de la cellule hôte 5. Ce protocole a été appliqué de manière efficace afin de déterminer les conséquences fonctionnelles de co-colonisation / infection.

<table><tbody><tr><td>C.albicans</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>S.aureus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Gélose au sang de mouton</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>Hela cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco’s Modified Eagle Medium, avec 4,5 g/L de glucose et de L-glutamine, sans pyruvate de sodium</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &micro ; g/ml concentration finale dans le DMEM complet</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA (0,05 % de trypsine, 0,53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Concentration finale de 10 % dans le DMEM complet<</td></tr><tr><td>fort>Autres milieux et réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (solution saline équilibrée de Hanks)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td><fort>Coloration</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1& 2, spécifique pour gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gramme Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>SuppliesBoîte de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pétri 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 96 puits</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 24 puits</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de culture 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cercles de lamelle, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de biofilm initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

L&#39;étude des interactions polymicrobienne à travers les royaumes taxonomiques qui incluent les champignons, les bactéries et les virus n&#39;ont pas été examinés précédemment en ce qui concerne la façon dont les membres virales du microbiome affectent les interactions microbiennes ultérieures avec ces cellules hôtes infectées par le virus. La cohabitation de virus avec des bactéries et des champignons est principalement présent sur les surfaces muqueuses de la cavité buccale et du tractus génital. les cellules des muqueuses, en particulier ceux avec des infections virales latentes chroniques ou persistantes persistants, pourraient avoir un impact significatif sur les membres du microbiome par altération du virus en nombre et le type de récepteurs exprimés. La modification de l&#39;architecture de la membrane de la cellule hôte entraînerait une capacité altérée de nouveaux membres de la flore normale et des agents pathogènes opportunistes pour initier la première étape dans la formation de biofilm, à savoir l&#39; adhérence. Cette étude décrit une méthode pour la quantification et l&#39;examen visuel de l&#39;effet de HSV sur l&#39;ouverture de BIOFILla formation de m (d&#39;adhésion) de S. aureus et C. albicans.

Le niveau de la solidité des données obtenues à partir du système décrit dans le présent rapport est illustré à la figure 2 af 38. Grâce à l&#39;utilisation de ce système, la modulation de l&#39;interaction staphylococcique et fongique avec des cellules infectées par des virus et de leur effet sur l&#39;adhésion de l&#39;autre peut être délimitée. Ces types d&#39;études nécessitent un examen au microscope de l&#39;interaction , comme illustré sur les f...

Une méthode est décrite ici pour déterminer l’association et la compétition interrègnes (bactériennes et fongiques) pour l’adhérence aux monocouches de cellules HeLa infectées par le virus. Ce protocole peut être étendu à plusieurs combinaisons de procaryotes, d’eucaryotes et de virus.

Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

L'objectif général de cette expérience est de mesurer les effets que des cellules préalablement infectées par le virus HSV exercent sur l'attachement ultérieur de pathogènes opportunistes bactériens et fongiques, par exemple Staphylococcus aureus et Candida albicans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le rôle qu'une infection virale chronique joue dans la régulation des différents membres du microbiome de l'hôte. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'examiner et de quantifier l'interaction de plusieurs organismes au stade initial de la formation du biofilm, à savoir l'adhérence.Les implications de cette technique s'étendent au contrôle des pathogènes opportunistes colonisateurs, car la condition préalable à l'infection par le VHS, à savoir l'élimination asymptomatique, est présente dans la majorité de la population humaine. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le contrôle exercé par le VHS sur l'attachement microbien ultérieur, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme l'infection par le CMV ou celle par l'adénovirus. Pour commencer, déterminez la viabilité du virus VHS1 ou VHS2 et la multiplicité d'infection, ou MOI, par coloration au X-gal lors de chaque essai expérimental utilisant un essai d'entrée de virus rapporteur.Effectuez une dilution du virus au MOI souhaité et placez les témoins de viabilité virale dans une microplaque séparée, parallèlement aux plaques utilisées pour le test poly-microbien. Ensuite, utilisez 100 microlitres de tampon paraformaldéhyde-glutaraldéhyde pour fixer les monocouches avant coloration. Pour maintenir les cellules HeLa, cultivez-les dans du DMEM contenant 4,5 grammes par litre de glucose, 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 50 microgrammes par litre de gentamicine et de L-glutamine.Utilisez une solution de trypsine pour repiquer les cellules à une confluence de 80 pour cent. Pour manipuler C.albicans, cultivez un stock congelé sur milieu sub en milieu aseptique à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, repiquez C.albicans sur milieu fungicell et incubez pendant 48 heures avant utilisation.Générer les formes en tube germinatif ou GT de C.albicans en prélevant des colonies de cellules fongiques représentatives et en les cultivant dans trois millilitres de FPS à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l'incubation, centrifuger la culture à 4 000 ×g pendant dix minutes. Ensuite, laver les cellules deux fois avec du HBSS.Après avoir utilisé un hémocytomètre pour compter les cellules, ajouter le GT lavé à l'HBSS à 37 degrés Celsius jusqu'à une DO 600 de zéro virgule trente-deux. Pour préparer les suspensions de forme levurique, ou YF, prélever des colonies de fungicell représentatives et les utiliser pour ensemencer trois millilitres d'HBSS. Faire croître les cultures jusqu'à une DO 600 de zéro virgule trente-deux en utilisant un hémocytomètre, puis dénombrer le nombre de formes YF par millilitre, qui doit représenter 99 pour cent des cellules observées au microscope.Préparer un stock fongique de travail en transférant 250 microlitres de stock GT ou YF dans 25 millilitres de HBSS à 37 degrés Celsius. Cela donne une concentration de dix puissance cinq UFC par millilitre. Pour préparer SRES ATCC 25923, ensemencer un stock congelé sur gélose au sang de mouton à cinq pour cent et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.En deux jours, sélectionner des colonies représentatives, les transférer dans un milieu de sel de mannitol et les cultiver à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Pour préparer un stock SRES, suspendre les colonies représentatives dans trois millilitres de HBSS à 37 degrés Celsius jusqu'à une DO 600 de zéro virgule un trois deux ou dix puissance huit UFC par millilitre. Pour préparer un stock de travail, transférer 100 microlitres de la suspension stock dans 25 millilitres de HBSS.Cela donne dix puissance cinq UFC par millilitre. La première étape cruciale lors de l'application de cette méthode à d'autres organismes ou souches de micro-organismes est la détermination du nombre exact de bactéries et de champignons à ajouter afin d'obtenir un nombre suffisant de colonies à compter. Pour réaliser un test de biofilm polymicrobien, ensemencez des plaques de 96 puits avec 200 microlitres contenant deux fois dix puissance 15 cellules HeLa par millilitre.Agiter les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes avant de les incuber à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone pendant 18 heures. Utiliser One X Optimum pour laver les monocouches, puis ensemencer avec la souche unique de HSV. Tester une seule souche à la fois.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius, en présence de cinq pour cent de dioxyde de carbone, pendant trois heures. À l’aide de 100 microlitres de PPS à 37 degrés Celsius contenant du magnésium et du calcium, laver les monocouches infectées. Ensuite, remplacer le PPS par du HBSS à 37 degrés Celsius.Laisser 25 microlitres de HBSS dans chaque puits. Ensuite, ajouter la suspension de travail YF, GT et/ou SRES et incuber les plaques à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après l'incubation, aspirer une colonne de la plaque à la fois.Remplissez immédiatement les puits avec 300 microlitres de PBS contenant du magnésium et du calcium. Après avoir répété cette étape de lavage deux fois, ajoutez 200 microlitres d’un tampon de lyse RIPA filtré et stérilisé, dilué au 1/50, dans chaque puits. Lorsque vous travaillez avec d'autres souches de bactéries ou de champignons, assurez-vous que la concentration de RIPA utilisée est suffisante pour la lyse cellulaire, tout en restant compatible avec les tests de viabilité microbienne.Triturez rapidement le lysat de cellules HeLa et pipetez 50 microlitres sur des sels de mannitol et/ou sur un milieu fungicell. Ensuite, à l’aide d’une tige en verre courbée à un angle de 90 degrés, étalez le lysat sur la surface de la boîte. Après avoir incubé les boîtes pendant 18 heures, comptez manuellement le nombre de colonies par boîte.Les témoins consistent en SRES ou en adhérents de C.albicans sur des cellules HeLa non infectées par le VHS. Pour réaliser les études d'imagerie, rincer chaque lamelle ronde en verre dans de l'acétone avant la stérilisation. Ensuite, à l'aide de pinces stérilisées à l'alcool et à la flamme, placer les lames sèches et stériles dans les puits de plaques stériles de 24 puits.Ajoutez des cellules HeLa dans les puits des plaques contenant les lamelles. Ensuite, infectez les cellules avec le virus. Après l'infection, ajoutez des bactéries et des champignons selon le modèle et incubez les cellules, puis traitez-les comme indiqué précédemment pour la plaque de 96 puits.Après le dernier lavage, fixer les cellules pour la microscopie en inondant les lamelles de méthanol, puis laisser évaporer. Pour la microscopie en champ clair, remplir les puits contenant les lamelles fixées avec de l'eau déionisée. Aspirer immédiatement l'eau et ajouter suffisamment de cristaux de violet de crésyl pour recouvrir chaque lamelle.Après avoir lav&eacute; les lamelles color&eacute;es au violet de cristal avec de l'eau d&eacute;ionis&eacute;e, faites-les s&eacute;cher dans C2 avant de les fixer avec un milieu de montage durcissant sur une lame &eacute;tiquet&eacute;e. Pour la microscopie en fluorescence, apr&egrave;s avoir &eacute;limin&eacute; le m&eacute;thanol des lamelles par lavage, faites-les s&eacute;cher dans les puits avant de les monter sur des lames &eacute;tiquet&eacute;es &agrave; l'aide d'un milieu de montage durcissant. Ajoutez une quantit&eacute; suffisante d'une dilution au 1/20 d'anticorps anti-HSV1 conjugu&eacute; &agrave; la FITC plus 2GD pour recouvrir enti&egrave;rement la lamelle.Incuber les lames dans une chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, utiliser du PBS pour laver les lamelles quatre fois. Après le dernier lavage, remettre les lames dans la chambre humide.Ajouter le dab B et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, laver les lames quatre fois avec du PBS. Laisser le milieu de montage polymériser pendant 24 heures à température ambiante à l'abri de la lumière.Ensuite, sous objectif à immersion, examinez au moins 50 champs en champ clair ou au microscope à fluorescence pour détecter une colocalisation. Des résultats représentatifs de l'effet du VHS sur l'adhérence de Staphylococcus et/ou de Candida albicans sont présentés ici. La présence du VHS1 inhibe l'adhérence des staphylocoques aux cellules HeLa.La présence de formes à tube germinatif de Candida, mais pas des formes levuriennes, a rétabli les niveaux d'adhérence des staphylocoques. Des résultats similaires ont été mesurés pour les cellules HeLa infectées par le VHS2. Comme on le voit sur cette figure, le niveau d'adhérence des formes à tube germinatif de Candida est significativement plus élevé pour les cellules infectées par le VHS2 que pour celles infectées par le VHS1.L'effet inverse a été mesuré pour HSV1 par rapport à HSV2 sur les formes levuriennes de Candida. Les profils d'adhérence ont été déterminés par coloration au violet de crésyl des monocouches afin de visualiser l'interaction entre les bactéries et le champignon. Une microscopie en fluorescence a ensuite été utilisée pour détecter la présence d'HSV en relation avec les autres micro-organismes.En l'absence de VHS, les staphylocoques ainsi que les formes levuriques et à tube germinatif de Candida étaient colocalisés sur les cellules HeLa. Toutefois, seul Candida a été observé sur les cellules infectées par le VHS. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit à neuf heures si elle est effectuée correctement.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que la coloration différentielle par anticorps fluorescents peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'expression différentielle de récepteurs membranaires présents après l'entrée virale dans la cellule. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine du microbiome humain pour explorer les interactions post-microbiennes dans des systèmes de culture tissulaire ainsi que de culture d'organes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de développer un modèle d'interaction polymicrobienne couvrant plusieurs royaumes taxonomiques.N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l'utilisation de souches virales non transmissibles et de techniques de barrière sont nécessaires.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Le test décrit un moyen rapide pour mesurer la formation de biofilm au début de bactéries et de champignons. Cette méthode utilise une plaque de microtitration comme substrat pour la formation de biofilms microbiens et le biofilm est visualisée en utilisant la souche de cristal violet. Le test fournit soit un test qualitatif ou quantitatif pour la formation de biofilm tôt.

Plaque de microtitrage biofilm essai de formation

Source : Tay, S. B., et al. Perturbation antivirulente des biofilms pathogènes utilisant des lactonases modifiées pour l’extinction du quorum.  J. Vis. Exp. (2016)La vidéo démontre une méthode pour quantifier la biomasse de biofilm dans une bactérie pathogène, en comparant des témoins non traités à des échantillons traités avec une enzyme quorum-quenching. L’enzyme perturbe la signalisation bactérienne lors de l’incubation précoce, réduisant l’adhésion cellulaire. Après lavage et incubation...

Quantification de la suppression du biofilm induite par les enzymes chez les bactéries pathogènes

Source : Schlafer, S, et Frost Kristensen, M. Surveillance du pH extracellulaire dans des biofilms inter-royaumes à l’aide de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la culture de biofilms inter-règnes de Streptococcus mutans et Candida albicans dans des conditions de type oral pour modéliser les interactions bactériennes-fongiques, permettant d’étudier la synergie microbienne, l’adhésion médiée par le glucan et la virulence acidogénique dans la pathogenèse orale.

Établissement de biofilms bactérien-fongiques inter-règnes pour l’étude de la pathogenèse orale

Source : Miquel Guennoc, C., et al. Nouvelle méthode d’analyse qualitative multi-échelle des biofilms bactériens sur des colonies fongiques filamenteuses utilisant la microscopie confocale et électronique. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la préparation d’une culture fongique sur des membranes de cellophane traitées pour soutenir la formation de colonies et la croissance radiale. Il montre ensuite la culture et la préparation des cellules bactériennes du sol pour des tests d’interaction.

Établissement d’une coculture fongique-bactérienne pour la formation de biofilms

Cette vidéo illustre l’initiation de la formation de biofilms polymicrobiens sur des cellules infectées par des virus par des bactéries et des champignons. L’infection par le virus de l’herpès simplex empêche l’attachement bactérien aux cellules, empêchant la co-localisation bactérienne-fongique. En revanche, les cellules non infectées présentent une co-localisation bactérienne-fongique et l’initiation de la formation d’un biofilm.

Un test pour déterminer l’initiation d’un biofilm polymicrobien sur des cellules infectées par le virus

Cette vidéo décrit une méthode de culture et d’analyse qualitative des biofilms bactériens sur les hyphes fongiques à l’aide de la microscopie. Les biofilms bactériens se forment fréquemment sur les surfaces fongiques et impliquent de nombreux processus d’interaction bactério-fongique, tels que la coopération métabolique, la compétition ou la prédation.

Procédé de préparation d’échantillons pour visualiser des bactéries formant un biofilm sur des hyphes fongiques

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer et analyser qualitativement les biofilms bactériens sur les hyphes fongiques par microscopie confocale et électronique.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Ce protocole décrit l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisées personnalisables pour visualiser la formation de biofilms de Candida albicans dans des conditions physiologiques hôte.

Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Ce protocole permet au lecteur d’analyser la formation de biofilm induite sur les sels biliaires dans les pathogènes entériques à l’aide d’une approche à multiples facettes pour capturer la nature dynamique des biofilms bactériens par évaluation de la conformité, formation de la matrice extracellulaire substance polymérique, et la dispersion.

La Formation de Biofilm induite sur les sels biliaires chez les agents pathogènes entériques : Techniques d’Identification et de Quantification

Ce protocole décrit la préparation de l’inoculum, la quantification du biofilm sur des plaques de microtitration à l’aide d’un colorant violet cristallin, le nombre viable dans les biofilms et la visualisation des biofilms d’Acinetobacter.

Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter

Découvrez une méthode pour évaluer l'adhérence de Staphylococcus aureus et Candida albicans sur des monocouches de cellules HeLa infectées par HSV. Cette technique permet d'étudier les interactions entre virus, bactéries et champignons.

Détermination de biofilm Initiation sur les cellules infectées par le virus par les bactéries et les champignons

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